MOURA, E. S Potencial antitumoral da Calotroipis procera Ait. in vivo E in vitro. 2005 79 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005. / Submitted by Luciene Oliveira (luciene@ufc.br) on 2017-08-07T18:46:50Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_esm.pdf: 2710827 bytes, checksum: 4a1b81d833be1b9594cdef154b6d45aa (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-08T13:21:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_esm.pdf: 2710827 bytes, checksum: 4a1b81d833be1b9594cdef154b6d45aa (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T13:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_esm.pdf: 2710827 bytes, checksum: 4a1b81d833be1b9594cdef154b6d45aa (MD5) Previous issue date: 2005-12-20 / This study initially evaluated the cytotoxicity of hydroalcoholic extracts from the aerial sections of Calatropis procera Ait f., with hexane fractions, dichloromethane and Nbutanol, tested in five lineages of tumor cells (HL-60, CEM, MCF-7, HCT-8 and B-16) via the MTT method and the antimitotic action in sea urchin eggs with positive control of doxirrubicina. The action of the ethanolic extract on the stalk was also studied with the fractions, hexane, dichlomethane, ethyl acetate, acetone and methanol, using the MTT method in four lineages of cells (HL-60, CEM, HCT-8 and B-16). The antimitotic action was evaluated with sea urchin eggs using three extracts, ethyl acetate, acetate and methanol with positive control of doxirrubicana. The hemolytic test was carried out with five fractions, using mice red blood cells. The in vivo evaluation was performed with hexane fractions, dichloromethane, ethyl acetate, acetone and methanol, by intraperitoneal means in the 180 sarcoma and the methanol fraction was used via oral means on Ehrlic’s tumor. Hydroalcoholic and ethanolic fractions showed cytotoxic activity. The hexane fraction presented less activity than 1.8 μg/mL. N-butanol had a result lower than 1.0 μg/mL, except for the B-16 lineage, which did not present any action. In the ethanolic extract the ethyl acetate presented action lower than 2.5 μg/mL and acetone lower than 4.4 μg/mL and methanol lower 10.5 and did not present any action in the B-16 lineage. Inhibition of embryonic development in sea urchin eggs in the hydroalcoholic extract in the first division of dichloromethane presented the best action, with 42.80 μg/mL, in the third division and blastula N-butanol 23.40 and 24.0 μg/mL respectively. The ethanolic extract presented an important antimitotic action, showing inhibition in all phases of embryonic development with action lower than 4.8 μg/mL, and the ethyl acetate was the most active in all phases of division. In the hemolytic test the ethyl acetate fractions 80.51 μg/mL, acetone 133.4 μg/mL and methanol 132.1 μg/mL presented action in erythrocytic membrane. In the in vivo study of the 180 sarcoma tumoral inhibition was evaluated with the positive and negative control group, weighing and histological study of the organs: liver, spleen and kidney and tumor. The organic fraction ethyl acetate presented inhibition in tumoral growth by 64.3%. As for the methanolic fraction 500 mg/kg (orally) presented inhibition by 43.18%. / Este trabalho avaliou inicialmente a citotoxicidade dos extratos hidroalcoólico de partes aéreas da Calotropis procera Ait.f., com as frações hexano, diclorometano e N-butanol, testadas em cinco linhagens de células tumorais (HL-60, CEM, MCF-7, HCT-8 e B-16) através do método MTT e a ação antimitótica em ovos do ouriço do mar com controle positivo da doxirrubicina. Também foi estudada a ação do extrato etanólico do caule com as frações: hexano, diclometano, acetato de etila, acetona e metanol, usando o método MTT em quatro linhagens de células (HL-60, CEM, HCT-8 e B-16). A ação antimitótica foi avaliada com ovos do ouriço do mar usando três extratos: acetato de etila, acetato e metanol com controle positivo da doxorrubicina.O teste hemolítico foi realizado com as cinco frações, usando hemácias de camundongo. A avaliação in vivo foi feita com as frações hexano, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, por via intra-peritonial no sarcoma 180 e a fração metanol foi usada por via oral no tumor de Ehrlich. As frações do extrato hidroálcólico e etanólico demonstraram atividade citotóxica. A fração hexano apresentou atividade menor que 1,8 μg/mL. O N-butanol teve resultado menor que 1,0 μg/mL, exceto para linhagem B-16, que não apresentou ação. No extrato etanólico o acetato de etila apresentou a ação menor que 2,5 μg/mL e a acetona menor que 4,4 μg/mL e o metanol menor que 10,5 e não apresentou ação na linhagem B-16. A inibição do desenvolvimento embrionário em ovos do ouriço do mar no extrato hidroalcoólico na 1ª divisão o diclorometano apresentou a melhor ação, com 42,80 μg/mL, na 3ª divisão e blástula o N-butanol 23,40 e 24,0 μg/mL respectivamente. O extrato etanólico apresentou importante ação antimitótica, mostrando inibição em todas as fases do desenvolvimento embrionário com ação menor que 4,8 μg/mL, e o acetato de etila foi o extrato mais ativo em todas as fases da divisão. No teste hemolítico as frações acetato de etila 80,51 μg/mL, acetona 133,4 μg/mL e o metanol 132,1 μg/mL apresentaram ação na membrana dos eritrócitos. No estudo in vivo do sarcoma 180 foi avaliado a inibição tumoral com grupo controle positivo e negativo, pesagem e estudo histológico dos órgãos: fígado, baço e rim e tumor. A fração orgânica acetato de etila apresentou inibição do crescimento tumoral de 64,3%. Em quanto à fração metanólica 500 mg/kg (via oral) apresentou inibição de 43,18%.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / É freqüente em determinadas doenças, e inclusive no câncer, uma resposta imune que leva a formação de interleucinas imunossupressoras cujo efeito principal é a paralisação de macrófagos e inversão do perfil em geral protetor (Th-1) para outro não protetor ou predominantemente Th-2. A resposta imune polarizada tipo 2 tem sido associada à progressão tumoral e metástase. A interleucina 13 atualmente é considerada um mediador de resposta imune tipo 2, pois apresenta inúmeras atividades imunoregulatórias em muitas doenças, incluindo no câncer. Do ponto de vista celular, o papel protetor ou supressor das células NKT restritas a CD1d na imunidade tumoral tem sido bastante explorado. Enquanto IL-12 pode ativar células NKT tipo I produtoras de IFN-γ, as células NKT tipo 2 têm sido descritas como principal fonte de IL-13 e esse mecanismo foi o responsável pela inibição da imunovigilância em alguns modelos tumorais. Uma das cadeias do receptor, IL-13Rα2, possui alta afinidade pela IL-13 e pode atuar como um inibidor dominante negativo ou “receptor decoy”, suprimindo a ação da IL-13 e assim contribuindo para a manutenção da imunovigilância tumoral. No presente trabalho, construímos uma quimera IL-13Rα2-Fc no vetor de expressão eucariótica VR1012 e confirmamos a identidade da proteína recombinante por immunoblotting. Através do ensaio de ELISA quimioluminescente, observamos que a atividade biológica da quimera produzida, ou seja, a sua alta afinidade pela IL-13, estava preservada. Esta vacina de DNA foi então testada no modelo singênico de melanoma murino B16F10-Nex2, isoladamente ou em associações com um plasmídeo contendo o gene da IL-12. Um protocolo de bioquimioterapia foi então construido com o composto ciclopaladado 7A. Experimentos in vivo mostraram um efeito protetor mediado pela alta produção de IFN-γ e “down-regulation” de interleucinas antiinflamatórias. A bioquimioterapia in vivo com ambos os plasmídeos em associação com a droga 7A foi o melhor protocolo terapêutico o qual levou a uma redução significativa na evolução tumoral, protegendo 30% dos animais, que permaneceram livres de tumor. Demonstramos que a primeira administração do plasmídeo expressando IL-12, seguida de contínuas doses do plasmídeo expressando IL-13Rα2-Fc juntamente com a droga 7A resultou em uma atividade anti-tumoral mediada pela alta produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição ou controle de mecanismos imunossupressores, principalmente recrutamento de células T NK1.1+ produzindo IL-10 e IL-13. / Interleukin 13 has emerged as a central mediator of a Th 2-dominant immune response and it has immunoregulatory activities in many diseases, including cancer. The protective or suppressive role of CD1d-restricted NKT cells in tumor immunity has been well documented. Whereas IL-12 can activate type I IFN-γ−producing NKT cells, type II NKT cells have been reported to produce IL-13 and this mechanism was responsible for immunosurveillance suppression in some tumor models. The high affinity chain of the receptor, IL-13Rα2, may act as a dominant negative inhibitor or “decoy receptor” suppressing the action of interleukin 13 then helping the maintenance of tumor immunosurveillance. Here, we constructed an IL- 13Rα2-Fc chimera in an expression vector VR1012 and confirmed the identity of our recombinant protein by immunoblotting analysis and its bioactivity (binding to IL-13) in an ELISA chemiluminescent assay. Such DNA vaccine was tested against syngeneic B16F10- NEX2 murine melanoma. Experiments in vivo were carried out and the results showed a protective effect mediated by high production of IFN-γ and down-regulation of the antiinflammatory interleukins. Biochemotherapy in vivo with plasmid containing the gene for IL- 13Rα2-Fc in association with plasmid that encodes the gene for IL-12 combined with treatment with the 7A cyclopalladated compound led to a significant reduction of tumor evolution and complete protection of 30% of mice that remained tumor free. We conclude that IL-12 gene therapy, followed by continuous doses of IL-13Rα2-Fc gene associated with 7A chemotherapy resulted in anti-tumor activity owing to the high production of pro-inflammatory cytokines and down regulation of immune suppression mechanisms, specifically involving the recruitment of NK1.1+ T cells producing IL-10 and IL-13. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As células tumorais prosperam como consequência da capacidade de resistir aos mecanismos de morte celular e de evasão da vigilância imunológica. Nós propomos que, em cânceres que possuem o supressor de tumor p53 selvagem, a remediação de ambas dessas defesas pode ser promovida pela transferência genica combinada de vetores adenovirais portadores dos transgenes de p19Arf (proteína supressora de tumor, parceira funcional de p53) e de interferon-beta (IFNbeta, citocina imunomoduladora). De fato, em resultados anteriores, notamos que a transdução combinada (p19Arf/IFNbeta), mas não os tratamentos individuais, em células de melanoma murino B16F10 resulta em aumento massivo de morte celular. Porém a capacidade destas células em processo de morte de desencadear imunidade antitumoral não foi analisada. Nesta tese e em estudos complementares, buscamos investigar os mecanismos moleculares de morte celular envolvidos na resposta imune estimulada por p19Arf/IFNbeta e explorar sua aplicação como imunoterapia do câncer. Inicialmente, em modelo de vacinação profilática, revelamos que o tratamento combinado em células B16F10 promove a expressão de IL-15, ULBP1, dos receptores de morte FAS/APO1 e KILLER/DR5, assim como uma resposta de células natural killer que rejeitam estas células tratadas quando inoculadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Após desafio tumoral no flanco oposto, a progressão desses tumores foi fortemente reduzida devido ao engajamento de linfócitos T CD4+ e CD8+, que apresentaram produção aumentada das citocinas IFN-? e TNF-alfa e medeiam proteção antitumoral de longo prazo. Em seguida, explorando um contexto de imunização diferente, a transferência de gênica in situ foi realizada em carcinoma heterotópico de pulmão e exibiu proteção significativa contra um desafio tumoral secundário, apenas quando o tumor primário foi tratado com p19Arf/IFNbeta. Análise de transcriptoma destes tumores indicou uma assinatura quimiotáxica de neutrófilos e linfócitos T CD8+ através das quimiocinas CCL3, CXCL3 e da IL-1beta. Em apoio destas observações, análises mecanicistas in vitro revelaram que células tratadas com p19Arf/IFNbeta ativam programas apoptóticos de p53 e antivirais de IFNbeta, enquanto sucumbem a um processo de morte por necroptose que também libera moléculas de morte celular imunogênica (MCI), calreticulina, ATP e HMGB1. No entanto, procurando potencializar ainda mais o benefício terapêutico dos nossos vetores, exploramos sua associação com o quimioterápico imunogênico doxorrubicina (Dox), que também é indutor de MCI. E nesta associação, percebemos que a Dox aumenta não apenas os níveis de morte celular, mas também a imunogenicidade das células tratadas, proporcionando em um modelo de vacina terapêutica, um controle tumoral superior em camundongos que já portavam antes da vacinação tumores B16F10 ou MCA205. Além disso, a associação in situ destas terapias restaurou a eficácia de uma dose sub-terapêutica de Dox, que em contraste com sua dose terapêutica, não prejudica a função cardíaca. Finalmente, também exploramos a associação com o bloqueio dos pontos de controle imunológicos PD-1 ou CTLA-4, que no modelo de vacina terapêutica, sua associação induziu maior rejeição completa de tumores B16F10. Em conclusão, aqui apresentamos evidências sobre a capacidade da combinação p19Arf/IFNbeta de induzir morte celular e estimulação imunológica. E ressaltamos seu potencial como uma estratégia de imunoterapia do câncer / Cancer cells thrive as a consequence of resisting cell death mechanisms and escaping from immune surveillance. We propose that, in cancers that harbor the wild-type tumor suppressor p53, remediation of both of these defenses can be achieved by harnessing the adenoviral vector mediated gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein, p53 functional partner) together with interferon-beta (IFNbeta, immunomodulatory cytokine). Indeed, in our initial observations, it was noticed that combined-transduction (p19Arf/IFNbeta), but not the individual treatments, of B16F10 mouse melanoma cells results in massive cell death levels. Yet, the capability of these dying cells to unleash antitumor immunity was not investigated. Here in this thesis and in complementary studies, we sought to investigate the molecular mechanisms of cell death involved in the p19Arf/IFNbeta immune stimulation and explore its potential as a mediator of cancer immunotherapy. First, in a prophylactic B16F10 vaccine model, we revealed that the dual treatment led to the up-regulation of IL-15, ULBP1, FAS/APO1 and KILLER/DR5 death receptors, plus a natural killer cell response that completely rejects treated cells when inoculated in syngeneic immunocompetent mice. Whereas, upon a contralateral tumor challenge, progression was strongly reduced by engaging both CD4+ and CD8+ T cells, which displayed augmented production of IFN-? and TNF-alpha cytokines and provided long term antitumor protection. Next, exploring different immunization context, in situ gene transfer in a heterotopic lung carcinoma exhibited significant protection against a secondary tumor challenge only when the primary tumor was treated with p19Arf/IFNbeta. Transcriptome analysis of these treated tumors indicated a chemotaxic signature of neutrophils and CD8+ T cells with the involvement of CCL3, CXCL3 chemokines and IL-1beta. Moreover, in support of this evidence, mechanistic in vitro studies revealed that p19Arf/IFNbeta treated cells reactivate p53 apoptotic and IFNbeta antiviral programs, while succumbing to a necroptosis cell death processes that also releases immunogenic cell death (ICD) molecules, calreticulin, ATP and HMGB1. Yet, aiming to potentiate therapeutic benefit of our vectors, we explored their association with doxorubicin (Dox) immunogenic chemotherapy, which is also an inducer of ICD. And in this setting, this association with Dox enhances not only cell death levels but also immunogenicity of treated cells, providing superior tumor control in a therapeutic vaccine model, where mice were already bearing B16F10 tumors or MCA205 sarcomas before vaccination. Moreover, associated use of these therapies in situ rescued efficacy of a sub-therapeutic dose of Dox, which in contrast to its therapeutic dose, does not impair cardiac function. Finally, we also evaluated the association with PD-1 or CTLA-4 checkpoint blockade immunotherapy, which in the therapeutic vaccine model induced full tumor rejection in a greater number of mice. In sum, here we provide compelling evidence for the ability of the p19Arf/IFNbeta combined gene transfer to promote cell death and immunogenic stimuli and underscored its potential to be applied as a cancer immunotherapy strategy

As células tumorais prosperam como consequência da capacidade de resistir aos mecanismos de morte celular e de evasão da vigilância imunológica. Nós propomos que, em cânceres que possuem o supressor de tumor p53 selvagem, a remediação de ambas dessas defesas pode ser promovida pela transferência genica combinada de vetores adenovirais portadores dos transgenes de p19Arf (proteína supressora de tumor, parceira funcional de p53) e de interferon-beta (IFNbeta, citocina imunomoduladora). De fato, em resultados anteriores, notamos que a transdução combinada (p19Arf/IFNbeta), mas não os tratamentos individuais, em células de melanoma murino B16F10 resulta em aumento massivo de morte celular. Porém a capacidade destas células em processo de morte de desencadear imunidade antitumoral não foi analisada. Nesta tese e em estudos complementares, buscamos investigar os mecanismos moleculares de morte celular envolvidos na resposta imune estimulada por p19Arf/IFNbeta e explorar sua aplicação como imunoterapia do câncer. Inicialmente, em modelo de vacinação profilática, revelamos que o tratamento combinado em células B16F10 promove a expressão de IL-15, ULBP1, dos receptores de morte FAS/APO1 e KILLER/DR5, assim como uma resposta de células natural killer que rejeitam estas células tratadas quando inoculadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Após desafio tumoral no flanco oposto, a progressão desses tumores foi fortemente reduzida devido ao engajamento de linfócitos T CD4+ e CD8+, que apresentaram produção aumentada das citocinas IFN-? e TNF-alfa e medeiam proteção antitumoral de longo prazo. Em seguida, explorando um contexto de imunização diferente, a transferência de gênica in situ foi realizada em carcinoma heterotópico de pulmão e exibiu proteção significativa contra um desafio tumoral secundário, apenas quando o tumor primário foi tratado com p19Arf/IFNbeta. Análise de transcriptoma destes tumores indicou uma assinatura quimiotáxica de neutrófilos e linfócitos T CD8+ através das quimiocinas CCL3, CXCL3 e da IL-1beta. Em apoio destas observações, análises mecanicistas in vitro revelaram que células tratadas com p19Arf/IFNbeta ativam programas apoptóticos de p53 e antivirais de IFNbeta, enquanto sucumbem a um processo de morte por necroptose que também libera moléculas de morte celular imunogênica (MCI), calreticulina, ATP e HMGB1. No entanto, procurando potencializar ainda mais o benefício terapêutico dos nossos vetores, exploramos sua associação com o quimioterápico imunogênico doxorrubicina (Dox), que também é indutor de MCI. E nesta associação, percebemos que a Dox aumenta não apenas os níveis de morte celular, mas também a imunogenicidade das células tratadas, proporcionando em um modelo de vacina terapêutica, um controle tumoral superior em camundongos que já portavam antes da vacinação tumores B16F10 ou MCA205. Além disso, a associação in situ destas terapias restaurou a eficácia de uma dose sub-terapêutica de Dox, que em contraste com sua dose terapêutica, não prejudica a função cardíaca. Finalmente, também exploramos a associação com o bloqueio dos pontos de controle imunológicos PD-1 ou CTLA-4, que no modelo de vacina terapêutica, sua associação induziu maior rejeição completa de tumores B16F10. Em conclusão, aqui apresentamos evidências sobre a capacidade da combinação p19Arf/IFNbeta de induzir morte celular e estimulação imunológica. E ressaltamos seu potencial como uma estratégia de imunoterapia do câncer / Cancer cells thrive as a consequence of resisting cell death mechanisms and escaping from immune surveillance. We propose that, in cancers that harbor the wild-type tumor suppressor p53, remediation of both of these defenses can be achieved by harnessing the adenoviral vector mediated gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein, p53 functional partner) together with interferon-beta (IFNbeta, immunomodulatory cytokine). Indeed, in our initial observations, it was noticed that combined-transduction (p19Arf/IFNbeta), but not the individual treatments, of B16F10 mouse melanoma cells results in massive cell death levels. Yet, the capability of these dying cells to unleash antitumor immunity was not investigated. Here in this thesis and in complementary studies, we sought to investigate the molecular mechanisms of cell death involved in the p19Arf/IFNbeta immune stimulation and explore its potential as a mediator of cancer immunotherapy. First, in a prophylactic B16F10 vaccine model, we revealed that the dual treatment led to the up-regulation of IL-15, ULBP1, FAS/APO1 and KILLER/DR5 death receptors, plus a natural killer cell response that completely rejects treated cells when inoculated in syngeneic immunocompetent mice. Whereas, upon a contralateral tumor challenge, progression was strongly reduced by engaging both CD4+ and CD8+ T cells, which displayed augmented production of IFN-? and TNF-alpha cytokines and provided long term antitumor protection. Next, exploring different immunization context, in situ gene transfer in a heterotopic lung carcinoma exhibited significant protection against a secondary tumor challenge only when the primary tumor was treated with p19Arf/IFNbeta. Transcriptome analysis of these treated tumors indicated a chemotaxic signature of neutrophils and CD8+ T cells with the involvement of CCL3, CXCL3 chemokines and IL-1beta. Moreover, in support of this evidence, mechanistic in vitro studies revealed that p19Arf/IFNbeta treated cells reactivate p53 apoptotic and IFNbeta antiviral programs, while succumbing to a necroptosis cell death processes that also releases immunogenic cell death (ICD) molecules, calreticulin, ATP and HMGB1. Yet, aiming to potentiate therapeutic benefit of our vectors, we explored their association with doxorubicin (Dox) immunogenic chemotherapy, which is also an inducer of ICD. And in this setting, this association with Dox enhances not only cell death levels but also immunogenicity of treated cells, providing superior tumor control in a therapeutic vaccine model, where mice were already bearing B16F10 tumors or MCA205 sarcomas before vaccination. Moreover, associated use of these therapies in situ rescued efficacy of a sub-therapeutic dose of Dox, which in contrast to its therapeutic dose, does not impair cardiac function. Finally, we also evaluated the association with PD-1 or CTLA-4 checkpoint blockade immunotherapy, which in the therapeutic vaccine model induced full tumor rejection in a greater number of mice. In sum, here we provide compelling evidence for the ability of the p19Arf/IFNbeta combined gene transfer to promote cell death and immunogenic stimuli and underscored its potential to be applied as a cancer immunotherapy strategy

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer

O objetivo deste estudo foi descrever e mapear a toxicidade local e sistêmica da aplicação da vacina de DNA HSP 65 do Mycobacterium leprae em pacientes com formas avançadas de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e definir qual a dose máxima tolerada. Trata-se de um estudo prospectivo, randomizado, aberto, sem grupo controle, de fase 1, com utilização de uma nova vacina para o tratamento de dezoito pacientes com carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço, sem opção terapêutica curativa, índice de Karnofsky maior que 70%, sem outra doença sistêmica grave. Propôs-se 3 grupos de 6 indivíduos, cada grupo recebendo diferente dose da vacina, respectivamente 150ug; 600ug e 1200ug por dose. A administração desta foi feita em 3 injeções com intervalo de 21 dias. Durante 90 dias os pacientes eram rigorosamente avaliados clinico e laboratorialmente quanto à ocorrência de eventos adversos (EA). A pesquisa de EA foi baseada no Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) elaborado pelo National Cancer Institute (NCI). No primeiro grupo (150ug) um paciente morreu por sangramento abundante de úlcera tumoral antes do fim do protocolo. Todos os pacientes referiram aumento da dor; três tiveram maior edema e dois piora da astenia; três tiveram infecções de pele e/ou tecido subcutâneo da cabeça e pescoço e um infecção do trato respiratório superior. No 2º grupo (600ug) três pacientes faleceram antes dos 90 dias de protocolo por causas não relacionadas ao tratamento, descritas a seguir: complicações de gastrostomia, rápida progressão tumoral e hemorragia fatal e carcinomatose pulmonar. Neste grupo um paciente não teve EA; cinco tiveram piora da dor; quatro aumento do edema; dois maior astenia; três celulite de face e dois apresentaram sinusite aguda. Como neste grupo observou-se toxicidade classificada como relacionada ao tratamento graus 3 e 4 em mais de um terço dos pacientes decidiu-se escalonar para baixo a dose no 3º grupo para 400ug. No último grupo três pacientes morreram por progressão tumoral rápida, sem completar o protocolo, então incluiu-se três novos indivíduos. Todos tiveram maior dor; três aumento do edema; três piora da astenia; um caso de erisipela; três com infecção pulmonar e um com sinusite aguda; um paciente apresentou linfonodomegalia peri-tumoral após receber a vacina. Concluiu-se que a administração desta vacina neste grupo de pacientes é segura na dose de 400ug e tem como principal toxicidade aumento dos sinais inflamatórios na lesão tumoral e maior ocorrência de infecções locais e respiratórias. / This study goal was to describe and graduate the local and systemic toxicity of intratumoral injections of HSP (Heat Shock Protein) 65 DNA vaccine in advanced-stage head and neck squamous cell carcinoma (SCCHN) patients and to define the highest well tolerated dose for them. This is a prospective, non-randomized, uncontrolled, phase 1 study, using a new vaccine to treat eighteen patients with advanced-stage SCCHN patients without any option for curative treatment, Karnofsky performance status greater than 70% and no organ failure. The patients were divided into 3 groups of 6 patients each one, receiving different vaccine doses, 150ug; 600ug e 1200ug per dose, respectively. They received three injections with a 21 days interval. The patients were rigorously evaluated into their clinical and laboratory aspects looking for adverse events (AE) during 90 days. Toxic effects were monitored according to National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE). In the first group (150ug) one patient died due to an ulcerate lesion extensive bleeding before the protocol end. All the patients referred pain increase; tree had greater edema; two had strong fatigue; tree presented with cutaneous infections of head and neck and one with an acute sinusitis. In the second group (600ug) three patients died before the 90th day protocol, all considered unrelated to treatment, following described: gastrostomy complications, a fatal bleeding after rapid progression of the tumor and pulmonary carcinomatosis. In this group one patient didn\'t have adverse events; five had pain worsening; four had increase of edema; two had greater fatigue; tree had facial cellulitis and two had acute sinusitis. Due to grade 3 and 4 adverse events occurred in more than one third of patients of this group we decided to lower the dose of the third group to 400ug. In the last group three patients also died before protocol completion, all due to cancer progression, so we had to include three more patients in this group. All of them presented greater pain; tree had increasing of edema; tree had fatigue worsening; tree had pulmonary infections; one had acute sinusitis and lymphoadenomegalia besides the tumor lesion. We concluded that intratumoral injections of M.leprae HSP 65 DNA in advanced-stage SCCHN patients is safe at the dose of 400ug/injection and cause tumor flare adverse events and an increase rate of local and respiratory infections.

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer

O objetivo deste estudo foi descrever e mapear a toxicidade local e sistêmica da aplicação da vacina de DNA HSP 65 do Mycobacterium leprae em pacientes com formas avançadas de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e definir qual a dose máxima tolerada. Trata-se de um estudo prospectivo, randomizado, aberto, sem grupo controle, de fase 1, com utilização de uma nova vacina para o tratamento de dezoito pacientes com carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço, sem opção terapêutica curativa, índice de Karnofsky maior que 70%, sem outra doença sistêmica grave. Propôs-se 3 grupos de 6 indivíduos, cada grupo recebendo diferente dose da vacina, respectivamente 150ug; 600ug e 1200ug por dose. A administração desta foi feita em 3 injeções com intervalo de 21 dias. Durante 90 dias os pacientes eram rigorosamente avaliados clinico e laboratorialmente quanto à ocorrência de eventos adversos (EA). A pesquisa de EA foi baseada no Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) elaborado pelo National Cancer Institute (NCI). No primeiro grupo (150ug) um paciente morreu por sangramento abundante de úlcera tumoral antes do fim do protocolo. Todos os pacientes referiram aumento da dor; três tiveram maior edema e dois piora da astenia; três tiveram infecções de pele e/ou tecido subcutâneo da cabeça e pescoço e um infecção do trato respiratório superior. No 2º grupo (600ug) três pacientes faleceram antes dos 90 dias de protocolo por causas não relacionadas ao tratamento, descritas a seguir: complicações de gastrostomia, rápida progressão tumoral e hemorragia fatal e carcinomatose pulmonar. Neste grupo um paciente não teve EA; cinco tiveram piora da dor; quatro aumento do edema; dois maior astenia; três celulite de face e dois apresentaram sinusite aguda. Como neste grupo observou-se toxicidade classificada como relacionada ao tratamento graus 3 e 4 em mais de um terço dos pacientes decidiu-se escalonar para baixo a dose no 3º grupo para 400ug. No último grupo três pacientes morreram por progressão tumoral rápida, sem completar o protocolo, então incluiu-se três novos indivíduos. Todos tiveram maior dor; três aumento do edema; três piora da astenia; um caso de erisipela; três com infecção pulmonar e um com sinusite aguda; um paciente apresentou linfonodomegalia peri-tumoral após receber a vacina. Concluiu-se que a administração desta vacina neste grupo de pacientes é segura na dose de 400ug e tem como principal toxicidade aumento dos sinais inflamatórios na lesão tumoral e maior ocorrência de infecções locais e respiratórias. / This study goal was to describe and graduate the local and systemic toxicity of intratumoral injections of HSP (Heat Shock Protein) 65 DNA vaccine in advanced-stage head and neck squamous cell carcinoma (SCCHN) patients and to define the highest well tolerated dose for them. This is a prospective, non-randomized, uncontrolled, phase 1 study, using a new vaccine to treat eighteen patients with advanced-stage SCCHN patients without any option for curative treatment, Karnofsky performance status greater than 70% and no organ failure. The patients were divided into 3 groups of 6 patients each one, receiving different vaccine doses, 150ug; 600ug e 1200ug per dose, respectively. They received three injections with a 21 days interval. The patients were rigorously evaluated into their clinical and laboratory aspects looking for adverse events (AE) during 90 days. Toxic effects were monitored according to National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE). In the first group (150ug) one patient died due to an ulcerate lesion extensive bleeding before the protocol end. All the patients referred pain increase; tree had greater edema; two had strong fatigue; tree presented with cutaneous infections of head and neck and one with an acute sinusitis. In the second group (600ug) three patients died before the 90th day protocol, all considered unrelated to treatment, following described: gastrostomy complications, a fatal bleeding after rapid progression of the tumor and pulmonary carcinomatosis. In this group one patient didn\'t have adverse events; five had pain worsening; four had increase of edema; two had greater fatigue; tree had facial cellulitis and two had acute sinusitis. Due to grade 3 and 4 adverse events occurred in more than one third of patients of this group we decided to lower the dose of the third group to 400ug. In the last group three patients also died before protocol completion, all due to cancer progression, so we had to include three more patients in this group. All of them presented greater pain; tree had increasing of edema; tree had fatigue worsening; tree had pulmonary infections; one had acute sinusitis and lymphoadenomegalia besides the tumor lesion. We concluded that intratumoral injections of M.leprae HSP 65 DNA in advanced-stage SCCHN patients is safe at the dose of 400ug/injection and cause tumor flare adverse events and an increase rate of local and respiratory infections.