Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.

Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.

Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer