O câncer cervical representa a terceira causa de morte por câncer em mulheres e está associado a infecções persistentes pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) em mais de 99% dos casos. Evidências sólidas mostram que a expansão de Células Mielóides Supressoras (MDSC) e fatores solúveis como a interleucina IL-10 são importantes mediadores da evasão tumoral à resposta imunológica contra tumores, que limita a eficácia de imunoterapias. Dada a importância epidemiológica dos tumores induzidos por HPV e a necessidade eminente do desenvolvimento de imunoterapias ativas contra essas lesões, desenvolvemos durante os últimos 12 anos, uma estratégia vacinal terapêutica baseada em DNA. Esta vacina codifica a proteína E7 do HPV-16 fusionada à glicoproteína D (gD) do Vírus Herpes Simplex do tipo 1 (HSV-1), denominada pgDE7h. O presente trabalho propôs a investigação de estratégias que restringem a imunossupressão, baseadas em um plasmídeo que codifica o receptor solúvel da citocina IL-10 (pIL10R) e da quimioterapia com gencitabina, na potencialização da vacina pgDE7h para controlar o crescimento de tumores que expressam as proteínas E6 e E7 do HPV-16 em modelo murino (células TC-1). Foi possível observar um atraso no crescimento do tumoral a partir da combinação da vacina com o pIL-10R. Adicionalmente, a utilização da eletroporação como método de entrega dos plasmídeos aumentou a proteção terapêutica para 90% e 60% quando os animais foram imunizados 5 ou 14 dias após o desafio, respectivamente. A combinação dos plasmídeos foi ainda capaz de elevar o número de linfócitos T CD8+ E7-específicos ativados, encontrados sistemicamente e no sítio tumoral. No consócio da imunização com a pgDE7h à gencitabina, foi possível observar um efeito sinérgico dessa associação, que aumentou a proteção antitumoral de 20% para 100% de animais livres de tumor, concomitante ao controle da expansão de populações imunossupressoras no baço. Além disso, a quimioimunoterapia administrada até 14 dias após o desafio com as células tumorais mostrou-se protetora em modelo de recidivas, simuladas por meio de transplantes subsequentes de células tumorais. Na busca de um protocolo vacinal com maior viabilidade clínica, combinamos a coadministração dos plasmídeos pgDE7h e pIL- 10R com o tratamento com gencitabina. Esta combinação terapêutica mostrou-se mais eficiente, onde se observou um aumento robusto da ativação de linfócitos T CD8+ E7-espefíficos, com regressão completa de tumores pré-estabelecidos. Em suma, esses resultados evidenciam que a associação de abordagens terapêuticas pode superar barreiras imunológicas presentes no ambiente tumoral e aumentar as chances de sucesso clínico do tratamento proposto. / Cervical cancer represents the third cause of cancer death among women, which is associated with persistent Human Papilloma Virus (HPV) infection in more than 99% of cases. Solid evidences show that the expansion of Myeloid-derived Suppressor Cells (MDSC) and soluble factors, such as IL-10, are important mediators of immune evasion mechanisms expressed by tumor cells, that limits the efficacy of immunotherapeutic approaches. Given the epidemiological importance of HPVinduced tumors and the crucial importance of developing active immunotherapies against neoplasias, during the past 12 years, we have been developing a DNA-based therapeutic vaccine strategy encoding the HPV-16 E7 protein fused to the Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) glycoprotein D (gD), named pgDE7h. This work aimed to investigate the potential role of immunossupression restriction using a plasmid encoding the soluble IL-10 receptor (pIL10R) and the chemotherapeutic drug gemcitabine to enhance in enhancing the pgDE7h vaccine potency in the control of tumors expressing HPV-16 E6 and E7 proteins in a murine model (TC-1 cells). It was possible to observe a tumor growth delay after combining the vaccine with pIL-10R. Additionally, the use of electroporation as a plasmid delivery method provided a therapeutic protection of 90% and 60% when the animals were immunized 5 or 14 days after challenge, respectively. The combination of plasmids was also capable to increase substantially the numbers of activatedE7-specific CD8+ T lymphocytes both systemically and at the tumor site. When pgDE7h immunization was combined to chemotherapy, we observed a synergistic effect, which increased the antitumor protection from 20% to 100% and promoted the control of immunosuppressive cell populations in the spleen. It was possible to maintain the high antitumour protective effects of the chemo-immunotherapy when the animals were immunized 14 days after tumor cell challenge and tumor relapses after subsequent challenges with tumor cells. To search a vaccine protocol with greater applicability in a clinical setting, we combined co-administration of pgDE7h and pIL-10R and gemcitabine treatment. Our data showed that the combined treatment induced a robust increase in the activation of CD8+ T lymphocytes and a complete regression of pre-established tumors. All together, these results show that the combination of therapeutic approaches can overcome immunological barriers present in the tumor environment and increase the chances of clinical success of the propose therapeutic treatment.

A imunoterapia baseada em MoDC constitui uma estratégia para tratamento de indivíduos HIV+. Protocolos para obtenção de MoDC em geral utilizam IL-4 e GM-CSF (IL4-DC). Alguns estudos utilizam as IFN-DC (IFN-α + GM-CSF), que exibem um fenótipo combinado de DC mielóide, DC plasmocitóide (pDC) e célula NK. Esse perfil misto pode aperfeiçoar a imunoterapia para pacientes HIV+. Para tanto, monócitos de pacientes HIV+ foram cultivados com GM-CSF e IL-4 ou IFN-α por 5 dias e estimuladas por 48 horas com pulso de HIV inativado por AT-2 e/ou coquetel de citocinas pró-inflamatórias. Avaliamos a expressão de moléculas de superfície de IFN-DC e ativação de linfócitos T por citometria de fluxo; produção de citocinas IL-12 e IL-10 por ELISA. IFN-DC apresentaram morfologia e fenótipo basais ativados e características de pDC e célula NK, diferente das IL4-DC. As IFN-DC foram capazes de produzir IL-12, estimular a proliferação e produção de IFN-γ de linfócitos TCD4 e CD8, porém similares às IL4-DCs. IFN-DC são capazes de estimular resposta de linfócitos T tanto quanto IL4-DC. / Immunotherapy based on MDDCs is a strategy for treating HIV-infected patients. Alternatively to the conventional protocol for DC differentiation based on IL-4 and GM-CSF (IL4-DC) some studies suggest the use of IFN-DC (IFN-α + GM-CSF). These cells exhibit a combined phenotype of myeloid DC, plasmacytoid DC (pDC) and NK. Considering the mixed profile of IFN-DCs alternative protocols can bring novel elements for immunotherapy. Monocytes isolated from HIV-infected patients were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 or IFN-α. On day 5 DCs were pulsed with AT-2-inactivated HIV and stimulated for 48 hours with a cocktail of proinflammatory cytokines. We assessed IFN-DC surface markers expression and T cell activation by flow cytometry; IL-10 and IL-12 production by ELISA. IFN-DC showed activated morphological and phenotypic features during basal state of maturity and exhibited features of pDC and NK different from IL4-DC. The IFN-DC like IL4-DC were able to produce IL-12 and stimulated T cells. So, the IFN-DC were able to stimulate the T cells as well as IL4-DCs.

A imunoterapia baseada em MoDC constitui uma estratégia para tratamento de indivíduos HIV+. Protocolos para obtenção de MoDC em geral utilizam IL-4 e GM-CSF (IL4-DC). Alguns estudos utilizam as IFN-DC (IFN-α + GM-CSF), que exibem um fenótipo combinado de DC mielóide, DC plasmocitóide (pDC) e célula NK. Esse perfil misto pode aperfeiçoar a imunoterapia para pacientes HIV+. Para tanto, monócitos de pacientes HIV+ foram cultivados com GM-CSF e IL-4 ou IFN-α por 5 dias e estimuladas por 48 horas com pulso de HIV inativado por AT-2 e/ou coquetel de citocinas pró-inflamatórias. Avaliamos a expressão de moléculas de superfície de IFN-DC e ativação de linfócitos T por citometria de fluxo; produção de citocinas IL-12 e IL-10 por ELISA. IFN-DC apresentaram morfologia e fenótipo basais ativados e características de pDC e célula NK, diferente das IL4-DC. As IFN-DC foram capazes de produzir IL-12, estimular a proliferação e produção de IFN-γ de linfócitos TCD4 e CD8, porém similares às IL4-DCs. IFN-DC são capazes de estimular resposta de linfócitos T tanto quanto IL4-DC. / Immunotherapy based on MDDCs is a strategy for treating HIV-infected patients. Alternatively to the conventional protocol for DC differentiation based on IL-4 and GM-CSF (IL4-DC) some studies suggest the use of IFN-DC (IFN-α + GM-CSF). These cells exhibit a combined phenotype of myeloid DC, plasmacytoid DC (pDC) and NK. Considering the mixed profile of IFN-DCs alternative protocols can bring novel elements for immunotherapy. Monocytes isolated from HIV-infected patients were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 or IFN-α. On day 5 DCs were pulsed with AT-2-inactivated HIV and stimulated for 48 hours with a cocktail of proinflammatory cytokines. We assessed IFN-DC surface markers expression and T cell activation by flow cytometry; IL-10 and IL-12 production by ELISA. IFN-DC showed activated morphological and phenotypic features during basal state of maturity and exhibited features of pDC and NK different from IL4-DC. The IFN-DC like IL4-DC were able to produce IL-12 and stimulated T cells. So, the IFN-DC were able to stimulate the T cells as well as IL4-DCs.