Berlin, Freie Univ., Diss., 2002. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Computerdatei im Fernzugriff.

Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2002. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.

Ulm, Univ., Diss., 2007.

Thesis (doctoral)--Tübingen, 1984.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Atherosclerosis is considered a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall which is not only modulated by innate and adaptive immune responses but also by factors of the blood coagulation system. In general hypercoagulability seems to increase the development and progression of experimental atherosclerosis in mice on an atherogenic background. In addition, the great majority of coagulation proteins including coagulation factor XII (FXII) have been detected in early and advanced human atherosclerotic lesions supporting the cross-link between the coagulation system and atherosclerosis. Moreover, FXII has been detected in close proximity to macrophages, foam cells and smooth muscle cells in these lesions and has been demonstrated to be functionally active in human plaques. Although these data indicate that factor XII may play a role in atherogenesis a direct contribution of FXII to atherogenesis has not been addressed experimentally to date. Furthermore, clinical studies examining the function of FXII in vascular disease have yielded conflicting results. Hence, in order to investigate the function of coagulation factor XII in atherosclerosis apolipoprotein E and FXII-deficient (F12\(^{-/-}\) apoE\(^{-/-}\)) mice were employed. Compared to F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) controls, atherosclerotic lesion formation was reduced in F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) mice, associated with diminished systemic T-cell activation and Th1-cell polarization after 12 weeks of high fat diet. Moreover, a significant decrease in plasma levels of complement factor C5a was evidenced in F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) mice. Interestingly, C5a increased the production of interleukin-12 (IL-12) in dendritic cells (DCs) and enhanced their capacity to trigger antigen-specific interferon-gamma (IFNγ) production in OTII CD4\(^+\) T cells in vitro. Importantly, a reduction in frequencies of IL-12 expressing splenic DCs from atherosclerotic F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) versus F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) mice was observed in vivo, accompanied by a diminished splenic Il12 transcript expression and significantly reduced IL-12 serum levels. Consequently, these data reveal FXII to play an important role in atherosclerotic lesion formation and to promote DC-induced and systemic IL 12 expression as well as pro-inflammatory T-cell responses likely at least in part via the activation of the complement system. / Die Arteriosklerose wird als eine chronisch entzündliche Erkrankung der arteriellen Gefäßwand angesehen, welche nicht nur durch Antworten des angeborenen und erworbenen Immunsystems, sondern auch durch Faktoren des Blutgerinnungssystems beeinflusst wird. Aus Tierstudien weiß man, dass Hyperkoagulabilität im Allgemeinen die Entwicklung und das Fortschreiten der Arteriosklerose in Mäusen mit atherogenem Hintergrund steigert. Ferner wurde die Mehrheit der Blutgerinnungsproteine inklusive des Koagulationsfaktors XII (FXII) in frühen und fortgeschrittenen arteriosklerotischen Läsionen in Menschen nachgewiesen, was eine mögliche Verbindung zwischen Koagulationssystem und Arteriosklerose untermauert. Darüber hinaus wurde der FXII in diesen Läsionen im unmittelbaren Umfeld von Makrophagen, Schaumzellen und glatten Muskelzellen nachgewiesen und dessen funktionelle Aktivität in humanen Plaques aufgezeigt. Obwohl diese Daten eine Funktion von FXII in der Arteriosklerose nahelegen, wurde eine direkte Beteiligung von FXII an der Atherogenese bislang experimentell noch nicht untersucht. Ferner erzielten klinische Studien, welche die Funktion von FXII in Gefäßerkrankungen untersuchten, widersprüchliche Resultate. Um die Funktion des Koagulationsfaktors XII in der Atherosklerose zu untersuchen, wurden daher Apolipoprotein E und FXII-defiziente (F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\)) Mäuse eingesetzt. Die Ausbildung arteriosklerotischer Läsionen war in F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) Mäusen im Vergleich zu F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) Kontrollen reduziert. Dies ging mit einer verringerten systemischen T-Zell Aktivierung und Th1-Zell Polarisierung nach 12-wöchiger atherogener Diät einher. Ferner konnte eine signifikante Reduktion der C5a-Plasmaspiegel in F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) Mäusen nachgewiesen werden. Interessanterweise konnte C5a die Interleukin-12 (IL 12) Produktion in dendritischen Zellen (DCs) steigern, sowie deren Fähigkeit erhöhen, eine antigen-spezifische Interferon-gamma (IFNγ) Produktion in vitro, in OTII CD4\(^+\) T-Zellen zu induzieren. Insbesondere konnte in vivo eine Reduktion IL-12-exprimierender DCs in Milzen arteriosklerotischer F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) im Vergleich zu F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) Mäusen beobachtet werden, welche mit einer verminderten Expression an Il12 Transkripten in der Milz und signifikant reduzierten IL-12 Serumspiegeln einherging. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass FXII eine wichtige Rolle in der Bildung arteriosklerotischer Läsionen spielt und die DC-vermittelte und systemische IL-12 Expression, sowie pro-inflammatorische T-Zell Antworten, vermutlich teilweise über eine Aktivierung des Komplementsystems, fördert.

Protamin antagonisiert die antikoagulierende Wirkung von Heparin. Nach intravenöser Protaminapplikation treten als häufige unerwünschte Wirkungen ein systemischer Blutdruckabfall, Herzfrequenzabfall sowie eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Widerstandes auf. Die Protamin-assoziierten Nebenwirkungen sind zum Teil lebensbedrohlich. Der ihnen zugrunde liegende Mechanismus wurde in der vorliegenden Arbeit auf Zellkultur- und Gesamttierebene analysiert sowie mögliche Therapieoptionen aufgezeigt. Heparin-Protamin-Komplexe aktivieren auf Endothelzellen den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet über sein Substrat Plasmakallikrein die Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen. Funktions-inhibierende Antikörper oder pharmakologische Inhibitoren von Plasmakallikrein oder Faktor XII blockierten die Heparin-Protamin induzierte Bradykininbildung auf Zellen. Stickstoffmonoxid-spezifische Fluorophore zeigten, dass Bradykinin-Bindung an Kinin B2 Rezeptoren die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase aktiviert. B2 Rezeptorantagonisten blockierten die Heparin-Protamin induzierte Stickstoff-monoxidbildung. Die intravenöse Infusion von Protamin in heparinisierte Wildtypmäuse senkte den systemischen Blutdruck und die Herzfrequenz. Im Gegensatz dazu waren Faktor XII und B2 Rezeptor Gen-defiziente Mäuse oder Tiere, die Faktor XII Inhibitoren oder B2 Rezeptorantagonisten infundiert bekamen, vor Heparin-Protamin-Effekten geschützt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Heparin-Protamin-Komplikationen durch eine Faktor XII-getriebene Bradykininbildung verursacht werden. Eine Blockade der Bradykininbildung oder -wirkung eröffnet eventuell eine Möglichkeit, die Heparin-Protamin-Nebenwirkungen auch beim Patienten zu therapieren. / Protamine is the antidot for anticoagulant effects of heparin. Intravenous application of protamine may cause systemic hypotension, heart rate decrease and increase in pulmonary pressure. Adverse effects associated with protamine are common and potentially life-threatening. This work characterizes the pathomechanism of heparin-protamine-effects in cell culture and in transgenic mice and suggests therapeutic options to block the adverse effects. Heparin-protamine-complexes activate blood coagulation factor XII on endothelial cells. Active factor XII initiates the generation of the vasoactive peptide hormone bradykinin from high molecular weight kininogen by plasmakallikrein action. Antibodies or low molecular weight inhibitors that interfere with factor XII or plasmakallikrein activity blocked heparin-protamine-induced bradykinin effects on cells. Nitric oxide-specific dyes revealed that bradykinin-binding to kinin B2 receptors activates the endothelial nitric oxide synthase. B2 receptor antagonists interfered with heparin/protamine-driven nitric oxide generation. Intravenous application of protamine into heparinized wildtype mice reduced systemic blood pressure and heart rate. Factor XII or B2 receptor deficient mice were protected from heparin-protamine-effects. Consistently, pharmacological targeting of B2 receptors or factor XII inhibited protamine associated cardiovascular effects in heparinized wildtype mice. Together, this work demonstrates that heparin-protamine-adverse effects are due to factor XII activation that culminates in the generation of bradykinin. Inhibition of bradykinin formation or signaling may offer novel strategies to block adverse heparin-protamin-effects in patients.

SUMMARY Mast cell activation in allergic and inflammatory disease causes increased vascular permeability and edema. This thesis identifies a paracrine mechanism, by which heparin released from intracellular granules, is involved in mast cell-evoked alteration of endothelial barrier function in vivo. Negatively charged heparin initiated factor XII-driven contact activation. Activated factor XII triggered the formation of the inflammatory mediator bradykinin in plasma. Congenital deficiency and pharmacological targeting of factor XII and kinin B2 receptor provided protection from mast cell-heparin-induced leukocyte-endothelial adhesion and hypotension in rats and mice. Intravital laser scanning microscopy and tracer measurements showed that heparin increased leakage with fluid extravasation in skin microvessels in mice. Deficiency in factor XII or kinin B2 receptor conferred resistance to heparin-induced skin edema and largely protected mice from endothelial barrier dysfunction, caused by allergen-induced mast cell activation and anaphylactic reactions. In contrast, heparin and mast cell activation caused excessive edema formation in mice, deficient in the major inhibitor of factor XII, C1 esterase inhibitor. Hereditary angioedema patients, lacking C1 esterase inhibitor, suffered from allergeninduced edema. The data indicate that mast cell-heparin-initiated bradykinin formation plays a fundamental role in defective barrier function of pathological mast cell-mediated inflammation, hypotension and edema formation. / ZUSAMMENFASSUNG Aktivierte Mastzellen sind bei Allergien und Entzündungskrankheiten an der Ödembildung beteiligt. Diese Arbeit zeigt, wie von aktivierten Mastzellen freigesetztes Heparin die Gefäßpermeabilität erhöht. Mastzell-Heparin aktiviert im Plasma den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet die Bildung des Entzündungsmediators Bradykinin durch Plasmakallikrein-vermittelte Spaltung von hochmolekularem Kininogen. Bradykinin führt zur Ödembildung und Vasodilatation. Bei Ratten und Mäusen blockieren Faktor XII- oder Kinin B2 Rezeptor-Inhibitoren die Heparin-induzierte und Bradykinin-vermittelte Leukozyten-Endothel Adhäsion und den arteriellen Blutdruckabfall. Um den Heparin-vermittelten Flüssigkeitsaustritt aus Mikrogefäßen in der Haut von Mäusen zu analysieren, wurde eine intravitale konfokale Mikroskopietechnik etabliert. Genetische Inaktivierung oder pharmakologische Blockierung von Faktor XII oder Kinin B2 Rezeptoren hemmen den Heparinvermittelten Flüssigkeitsaustritt. Sowohl in systemischen als auch in cutanen passiven Anaphylaxiemodellen waren Faktor XII- und Kinin B2 Rezeptor-defiziente Mäuse vor Allergen-induzierten Ödemen und anaphylaktischen Reaktionen geschützt. Im Gegensatz dazu führte eine Allergenexposition zu einer überschiessenden Ödembildung in C1 Esterase Inhibitor-defizienten Mäusen, bei denen das Gen für den wichtigsten Inhibitor von Faktor XII inaktiviert wurde. Bei Hereditären Angioödem- Patienten, denen funktionaler C1 Esterase Inhibitor fehlt, lösen allergischen Reaktionen Ödemattacken aus. Zusammenfassend zeigen diese Daten erstmals, dass die durch Heparin gestartet Bradykinin-Bildung, eine bedeutende Rolle bei der fehlerhaften Barrierenfunktion der pathologischen Mastzell-vermittelten Entzündungen, Blutdruckabfall und Ödembildung spielt.

Bei einem kleinen Prozentsatz (2–3 %) aller molekulargenetisch untersuchten Hä-mophilie-A-Fälle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der Hämophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zusätzlicher Methoden aufgeklärt werden. Bei zwei Patienten mit milder Hämophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalität dieser Austausche zu überprüfen, wurden für diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgeführt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivität des Promotors deutlich herabsetzen und daher als ursächlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die übrigen Patienten auf epigenetische Veränderungen in fünf CpG-Inseln im 5’UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auffällige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Veränderungen im Intron 1 zurückzuführen sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen könnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalität der Mutationen geklärt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 %) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) überein, während es bei 22 % der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten Hämophilie-A-Patienten aufgeklärt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen führen können und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter Nähe der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen Hämophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer Hämophilie A aufgefallen, welche ungewöhnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auffälligen Bandenmuster nicht erklären konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass fünf der untersuchten Fälle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zurückzuführen sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellulären Expressionssystem durchgeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Domänen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Domänen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazelluläre Immunlokalisation der trunkierten Proteine bestätigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Domäne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen ermöglicht und das FVIII-Protein vor Degradation schützt. / Molecular F8 gene diagnostic procedures fail to reveal any causal mutation in 2–3 % of haemophilia A patients. In the first part of this thesis, DNA samples from these patients were analyzed to identify ‘non canonical’ F8 gene mutations. Two of these patients showed single base substitutions in the promoter region of the F8 gene. These two and two further previously reported nucleotide substitutions were analyzed by luciferase assays for their promoter activities. F8 promoter activity levels were clearly reduced due to the base substitutions illustrating the causality of these promoter mutations. The remaining patients were investigated for methylation aberrations in five CpG is-lands in the 5’UTR and intron 1 of the F8 gene. Three samples with aberrant meth-ylation status were detected, of which one was caused by the second X chromosome in a haemophilia patient with Klinefelter syndrome and the other two were caused by as yet undefined genomic alteration in intron 1. No aberrant methylation status was detected which could have influenced FVIII expression. In four patients with presumptive splice site mutations, mRNA analysis demonstrated the presence of aberrant F8 transcripts and therefore mutation causality could be confirmed. In addition, all experimentally proven silent and splice site mutations were extracted from the literature and the experimental results were compared to those of splice site prediction tools of the software Alamut. In 78 % of cases, splice prediction was found in good agreement with mRNA analyses. In my previous diploma thesis, the duplication breakpoints of ten unrelated haemo-philia A patients with duplications in F8 gene were characterized by PCR and se-quencing. The sequence data flanking the breakpoints were now analyzed with in silico tools in order to identify sequence motifs which could suggest mechanisms for the generation of duplications. These analyses identified several sequence motives which are assumed to contribute to DNA-repair-related rearrangements and sug¬ge-sted different mechanisms to be involved in the origin of duplications. Upon routine molecular diagnostic analysis of F8 intron 1 and intron 22 inversions by PCR or Southern blotting, a few haemophilia A patients with severe phenotype had revealed inconsistent band patterns. Subsequent MLPA analysis in five of these patients identified additional deletions or duplications (CNVs) which could not fully explain the abnormal band patterns. Further long range PCR experiments provided hints to a combination of CNV and inversion events. In the second part of this thesis, in vitro FVIII expression analyses were performed to investigate the impact of nonsense mutations in the F8 gene on transcription and translation. F8 mRNA analyses of both wild type and mutated constructs showed transcription of full-length mRNA. Polyclonal antigen assays were able to detect truncated proteins in cell lysates transfected with F8 constructs carrying nonsense mutations in the distal light chain, i.e. domains A3, C1 or C2. No protein expression was detectable from F8 constructs harbouring nonsense mutations in the proximal heavy chain, i.e. domains A1, A2 or B. These data were confirmed by intracellular immune localization of the truncated proteins. These results suggest an important role of the B domain during intracellular protein processing: it likely enables chaperone binding and thus protects the FVIII protein from degradation.