Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T04:22:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alegre_SarahMonte_D.pdf: 1722619 bytes, checksum: 9f52c232fe3cdfeb33a536b700d294f7 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A deficiência de G-6-PD é um erro inato do metabolismo de carboidratos em que a atividade ou estabilidade da glicose-6-fosfato desidrogenase (enzima que cataliza a reação inicial da via das pentoses-fosfato) está reduzida. Uma variedade de alterações é esperada, pois a referida enzima está presente em diferentes células e tecidos, incluindo pâncreas e o córtex da adrenal. Em nosso estudo anterior demonstramos que os portadores dessa deficiência enzimática apresentavam redução na fase rápida de secreção de insulina. No presente trabalho de pesquisa, tivemos como objetivo avaliar de forma mais precisa a secreção de insulina através da quantificação do peptídeo C plasmático após estimulo glicidico, assim como, após a L-arginina, outro estimulante da secreção de insulina, além da sensibilidade periférica à insulina. Constou dos objetivos avaliar a secreção de cortisol após estímulo com ACTH. Para tanto, foram estudados 11 individuos com deficiência de G-6-PD e 11 indivíduos controle que formaram o grupo I e foram submetidos aos testes par avaliar a função secretória da célula ß pancreática (Teste Endovenoso de Tolerância à Glicose - TETG e Teste da Arginina) e a sensibilidade periférica à insulina (Teste de Tolerdncia à Insulina - TTl). E, o grupo II composto com 12 indivíduos com deficiência de G-6-PD e 16 individuos controle que foram submetidos à estimulação das adrenais com ACTH (Teste do Cortisol). Para os dois grupos de estudo os procedimentos experimentais foram realizados após jejum de 12 -14 h. As amostras de sangue para as determinações séricos de glicose, insulina e peptideo C foram coletadas nos tempos: 0 (jejum}, 1, 3, 5, 7, 10, 30 e 60min. após a infusão de 0,5g de glicose/ Kg de peso corporal para o TETG e, 2, 3, 4, 5, 7 e 10 min. após o término da infusão de 50ml de L-arginina a 10% para o teste da arginina. A sensibilidade à insulina foi calculada pelo decaimento dos niveis séricos de glicose nos primeiros 15 min. após a infusão de 0,1 U de insulina regular humana / Kg de Peso corporal. A secreção de cortisol foi avaliada através de amostras basais de cortisol e, 30, 60 e 120 min. após infusão de 0,25mg de ACTH. Os resultados demonstram que pacientes com deficiência de G-6-PD e individuos controle apresentaram valores semelhantes de glicose plasmática durante o TETG. Os niveis séricos de insulina nos primeiros 10 min. do TETG, bem como os índices de avaliação da fase rápida de insulina foram significativamente menores nos pacientes com deficiência de G-6-PD. A quantificação do peptideo C está em concordância com esses resultados, pois os pacientes com deficiência enzimática apresentaram valores de peptideo C significativamente menores nos tempos: 1 min. (C: 3,2 ± 0,5 ng/ml X G-6-PD: 1,2 ± 0,5 ng/ml, p < 0,01); 3 min. (C: 4,5 ± 0,9 ng/ml X G-6-PD: 1,9 ± 0,4 ng/ml, p < 0,02); 5 min. (C: 4,8 ± 0,9 ng/ml X G-6-PD: 1,8 ± 0,3 ng/ml, p < 0,01); 7 min. (C: 4,1 ± 0,7 ng/ml X G-6-PD: 1,4 ± 0,3 ng/ml, p < 0,01); aos 10min. (C: 4,7 ± 1,0 ng/ml X G-6-PD: 1,5 ± 0,4 ng/ml, p < 0,01) e aos 30 min. (C: 4,3 ± 0,5 ng/ml X G-6-PD: 1,9 ± 0,5 ng/ml, p < 0,01) do T. E. T.G. Também a determinação das áreas sob as curvas de peptideo C, nos 60 min. do teste, bem como os índices de avaliação da fase rápida de secreção de insulina demonstram valores menores, estatisticamente significativos para o grupo de pacientes com deficiência de G-6-PD. A extração hepática de insulina,. após estimulo com glicose endovenosa, foi estatisticamente menor para os pacientes com deficiência de G-6-PD (C: 58,4 ± 4,1% X G-6-PD: 38,6 ± 8,8%, p < 0,05). O índice utilizado para avaliar a secreção de insulina no teste da arginna, a média dos três maiores valores nos primeiros 5 min., foi semelhante para os dois grupos quanto aos niveis de insulina, mas significativamente menor no grupo de individuos com deficiência de G-6-PD em relação ao peptideo C. A extração hepática de insulina, durante o teste da arginina, foi menor para o grupo, de portadores de deficiência de G-6-PD, embora esse resultado não tenha sido significativo. A sensibilidade periférica à insulina avaliada pela velocidade de decaimento da glicose foi semelhante nos dois grupos (C: 6,6 ± 1,0%/min. X G-6-PD: 5,56 ± 0.5%/min.). Para o grupo II, onde a secreção de cortisol foi avaliada durante a estimulação com ACTH, os niveis de cortisol plasmático foram significativamente menores nos pacientes com deficiência de G-6-PD aos 30 min. (C: 26 ± 1,2 µg/dl X G-6-PD: 21,1 ± 1,8 µg/dl, p < 0.05). No periodo restante do teste essa diferença desapareceu. A análise das áreas sob as curvas de cortisol foi semelhante nos dois grupos. Esses resultados demonstram que pacientes com deficiência de G-6-PD apresentam diminuição na secreção de insulina (fase rápida) após estimulo com glicose e L-arginina, sensibilidade periférica à insulina semelhante a de indivíduos controle e secreção de cortisol diminuida durante a primeira hora após estimulação com ACTH. / Abstract: Glucose - 6 - phosphate dehydrogenase deficiency ( G-6-PD ) is an inborn error of carbohydrate metabolism in which the activity and/or stability of G-6-PD ( enzyme that catalyses the initial reaction of the pentose phosphate pathway) is decreased. Recognition that deficiency of G-6-PD also occurs in other cells, tissues and biologic fluids raises the question that some specific functional alterations might happens in the affected persons. We demonstrated in our previous study that the patients with G-6-PD deficiency showed. Decreased first phase insulin release after glucose stimulation. The aim of the present study was to investigate the insulin secretory activity of pancreatic ß-cells through the determination of the C-peptide concentration after the intravenous glucose and L-arginine stimulation, and to evaluate the insulin sensitivity. It was also a purpose of this study to investigate the cortisol levels in response to stimulation with ACTH in those patients. The study included 11 male controls and 11 patients with G-6-PD deficiency ( group I ) that were studied with intravenous infusion of glucose, L-arginine and regular human insulin (0,1 UI/Kg B.W) to evaluate the secretion and action of insulin. The group II with 16 normal subjects and 12 G-6-PD deficient patients were submited to stimulation with ACTH ( 0,25 mg corticotropin). All the tests were performed in the morning after a 12-14h overnight fast. Blood samples for glucose, insulin, and C-peptide determination were collected before and 1,3,5,7,10,30 and 60 min. after intravenous glucose infusion (0,5 g/Kg body weight) (IVTT), before and 2,3,4,5,7 and 10 min. after L-arginine infusion ( 5g as a 10% solution ). The insulin sensitivity was calculated by the glucose disappearance rate during the first 15 min. after intravenous injusion of 0,1U of human insulin/Kg B.W. The cortisol secretion was evaluated before and at 30,60 and 120 min. after 0,25 mg of ACTH infusion. In the intravenous glucose tolerance test no significant differences were demonstrated between the mean plasma glucose levels of the G-6-PD deficient patients and those of the control group. The serum insulin levels during IVGTT from G-6-PD deficient patients were significantly lower when compared to insulin levels in the normal men in the first 10 min. as the index of first phase insulin release. The serum C - peptide levels were significantly lower in the G-6-PD deficient patients than the control group at: 1,3,5,7,10 and 30 min., and as the area under the curve of C - peptide levels in IVGTI. The hepatic extraction of insulin during IVGTT were significantly lower in the patients than in the control group. The index used to evaluate insulin secretory response after arginine infusion, mean of the highest values during the first 5 min. were similar between patients and controls for insulin levels, but signiflcantly lower in G-6-PD deficient patients when we analysed C-peptide, after arginine infusion. Patients and controls showed similar hepatic extraction of insulin in the arginine test. In the group II, after stimulation with ACTH, the cortisol levels were significantly lower in the G-6-PD deficient patients than the normal men at 30 min., but this differences between the groups decreased gradually and were no statistically significant, after the first hour. The areas under the cortisol levels for the two groups were similar. These results demonstrate that the G-6-PD deficient patients showed decresead insulin secretion ( first phase ) after glucose and L-arginine stimulation, decreased hepatic insulin extraction during IVGTI, no alteration in insulin peripheral sensitivity and decreased cortisol production in the first 30 min. after corticotropin stimulation. / Doutorado / Doutor em Medicina

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimáticocolorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimáticocolorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimáticocolorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

Orientador: Artur Torres Cordeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T07:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ranzani_AmericoTavares_M.pdf: 3887425 bytes, checksum: 3ae590890f0f321ec227cb9c0967c6de (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Tripanossomíases são enfermidades associadas à infecção por protozoários do gênero Trypanosoma. Estas doenças são normalmente tratadas com medicamentos de alta toxicidade e baixa eficiência. A pesquisa de novos compostos que atuem de maneira específica contra alvos metabólicos pré-estabelecidos pode levar ao desenvolvimento de fármacos mais eficientes no tratamento destas enfermidades. A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) é um alvo metabólico validado experimentalmente em Trypanosoma brucei. A G6PD catalisa o primeiro passo da via de síntese de pentoses que supre a célula com ribose-5-fosfato para síntese de bases nitrogenadas e NADPH para biosíntese de lípideos, colesterol e neutralização de espécies reativas de oxigênio. O esteróide desidroepiandrosterona (DHEA) e seus análogos são conhecidos inibidores incompetitivos da enzima humana e recentemente foram caracterizados também como potentes inibidores da G6PD de T. brucei e T. cruzi. Estes esteróides também apresentam efeito citotóxico à forma sanguínea de T. brucei e à forma epimastigota de T. cruzi. Em conjunto, estes resultados sugerem que esteróides análogos do DHEA devam ser explorados como uma nova classe de fármacos antiparasitários. Apesar de já haver estruturas da enzima, o sítio de ligação destes esteróides não é conhecido, informação que ajudaria no desenho racional de novos inibidores. Assim, este projeto teve como objetivo principal a identificação do sítio de inibição por cristalografia. Conseguiu-se estabelecer um protocolo de expressão, purificação e cristalização para a G6PD humana. Testou-se a co-cristalização, seeding e soaking com os esteróides DHEA, epiandrosterona (EA) e 16-bromo-epiandrosterona (16BrEA) com os substratos da enzima, além de outros complexos com frutose-6-fosfato, glucosamina-6-fosfato e NADPH. Na tentativa de diminuir a atividade da enzima para facilitar a cristalização com os substratos e os esteróides, fez-se o mutante D200N, que além de ser menos ativo, também apresentou uma menor inibição pelos esteróides. A enzima humana se apresenta como um equilíbrio de dímero e tetrâmero, não se sabendo a influência destes estados na atividade da enzima. Assim, para favorecer somente um estado oligomérico, foram avaliadas mutações na interface do tetrâmero. A mutação A277C permite a formação de uma ponte dissulfeto com a C294, estabilizando o tetrâmero. A mutação E347A é capaz de desestabilizar o tetrâmero, favorecendo a forma dimérica. Embora não tenha sido possível obter a estrutura da enzima com os esteróides, conseguiu-se pela primeira vez apontar para um resíduo importante para a inibição, o que abre oportunidade para investigações futuras que podem levar à descrição do sítio de inibição / Abstract: Trypanosomiases are infectious diseases caused by protozoan parasites from genus Trypanosoma. Such diseases are currently treated with low effective and highly toxic drugs. The research of novel compounds which inhibits validated metabolic targets might lead to the development of more efficient drugs to such neglected diseases. The enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) was experimentally validated as a metabolic target in T. brucei bloodstream form. G6PD catalyzes the first step of the pentose phosphate pathway (PPP), which supplies the cell with ribose-5-phosphate for synthesis of nucleotides and NADPH for biosynthesis of lipids, cholesterol and detoxification of reactive oxygen species. The steroid Dehydroepiandrosterone (DHEA) and analogues are known uncompetitive inhibitors of the human G6PD and recently they were also characterized as potent inhibitors of T. brucei and T. cruzi G6PD. It was also demonstrated that these steroids are toxic to cultured T. brucei bloodstream form and T. cruzi epimastigote form. Together these results suggest that DHEA derivatives must be explored as a novel anti-parasite drug class. Although the structure of the enzyme is solved, the binding site of these steroids is unknown, information that would help in the rational design of new inhibitors. So, the main goal of this project was the identification of the inhibition site by crystallography. It was established an expression, purification and crystallization protocol for the human G6PD. It was tried the co-crystallization, seeding and soaking of the steroids DHEA, epiandrosterone (EA) and 16-bromo-epiandrosterone (16BrEA) with the substrates of the enzyme, beyond other complexes with fructose-6-phosphate, glucosamine-6-phosphate and NADPH. Attempting to diminish the enzyme activity to facilitate the crystallization with the substrates and the steroids, it was made the mutant D200N, which not only is less active, but it's also less inhibited by the steroids. The human enzyme is in equilibrium between dimer and tetramer, being unknown the effect of these states to the enzyme activity. This way, to favor one oligomer state, it was assessed mutations at the tetramer interface. The mutation A277C allows the formation of a disulfide bond with the C294, stabilizing the tetramer. The mutation E347A is able to destabilize the tetramer, favoring the dimer. Although it was not possible to determine the structure of the enzyme with the steroids, for the first time it was shown the involvement of a residue in the steroid inhibition, which makes possible future investigations that can lead to the inhibition site description / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestre em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

A glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima do processo oxidativo da via das pentoses fosfato e apresenta diversas aplicações industriais. Foram avaliadas as influências de algumas variáveis sobre a produção de G6PDH. No Processo Descontínuo variaram-se a concentração da fonte de carbono, relação carbono-nitrogênio, concentração de aminoácidos e nucleotídeos , pH e a vazão de ar fornecida. A variação na atividade enzimática indicou que as condições do meio são importantes na obtenção desta enzima, tendo sido obtida atividade específica máxima de 86 U/g cél e produtividade de 10,5 U/L.h. No Processo Descontínuo-Alimentado variaram-se o sistema de adição e os nutrientes alimentados. A atividade específica máxima obtida foi 72 U/g cél e a produtividade foi 47 U/L.h. Os resultados indicaram o controle da concentração de glicose em 5g/L para uma melhor produtividade e a necessidade de maiores estudos a fim de otimizar o processo. / The glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is the first enzyme of the pentose phosphate pathway, converting glucose-6-phosphate into 6-phosphogluconate. Besides its importance in biochemistry and medical studies, this enzyme is used in several analytical methods, industrial and commercial application. In this work the influence of several variables in the production of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase in batch and fed-batch processes were studied. In batch cultures the variables were the glucose concentration (10 and 20 g/L), the C:N ratio (3.5 and 6.7 g/g), the aminoacids and nucleotides concentrations (10 and 20 mg/L), pH (4.6 and 5.7) and the aeration (0, 0.8, 1.7 and 2.2 vvm). It was observed that the G6PDH activity varied according to the conditions of the culture. Specific Activity value of 86 U/g cell and productivity of 10,5 U/L.h were attained when the test was carried out as follows: 30oC, pH 5.7, 400 rpm, 2.2 vvm, C:N ratio of 6.7, glucose concentration of 10 g/L, aminoacids (Tryptophan and Hystidine) and nucleotides (Adenine and Uracil) concentrations of 20 mg/L. Nevertheless, the fed-batch process was more efficient and productive than the batch process. The productivity obtained in the best fed-batch condition (glucose addition by an increasing exponential mode) was 47 U/L.h, more than four folds the productivity of the batch culture. So that, by maintaining the glucose concentration in the medium below 5 g/L, the productivity should be improved. However, more studies are needed for optimizing the G6PDH production in a Fed-Batch process. In the fed-batch cultures the feeding conditions and kind of feeding were studied. It was observed that the best fed-batch G6PDH specific activity (72 U/g of cell when the glucose was added in a decreasing linear mode) was lower than that attained in the batch cultures.

A glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima do processo oxidativo da via das pentoses fosfato e apresenta diversas aplicações industriais. Foram avaliadas as influências de algumas variáveis sobre a produção de G6PDH. No Processo Descontínuo variaram-se a concentração da fonte de carbono, relação carbono-nitrogênio, concentração de aminoácidos e nucleotídeos , pH e a vazão de ar fornecida. A variação na atividade enzimática indicou que as condições do meio são importantes na obtenção desta enzima, tendo sido obtida atividade específica máxima de 86 U/g cél e produtividade de 10,5 U/L.h. No Processo Descontínuo-Alimentado variaram-se o sistema de adição e os nutrientes alimentados. A atividade específica máxima obtida foi 72 U/g cél e a produtividade foi 47 U/L.h. Os resultados indicaram o controle da concentração de glicose em 5g/L para uma melhor produtividade e a necessidade de maiores estudos a fim de otimizar o processo. / The glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is the first enzyme of the pentose phosphate pathway, converting glucose-6-phosphate into 6-phosphogluconate. Besides its importance in biochemistry and medical studies, this enzyme is used in several analytical methods, industrial and commercial application. In this work the influence of several variables in the production of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase in batch and fed-batch processes were studied. In batch cultures the variables were the glucose concentration (10 and 20 g/L), the C:N ratio (3.5 and 6.7 g/g), the aminoacids and nucleotides concentrations (10 and 20 mg/L), pH (4.6 and 5.7) and the aeration (0, 0.8, 1.7 and 2.2 vvm). It was observed that the G6PDH activity varied according to the conditions of the culture. Specific Activity value of 86 U/g cell and productivity of 10,5 U/L.h were attained when the test was carried out as follows: 30oC, pH 5.7, 400 rpm, 2.2 vvm, C:N ratio of 6.7, glucose concentration of 10 g/L, aminoacids (Tryptophan and Hystidine) and nucleotides (Adenine and Uracil) concentrations of 20 mg/L. Nevertheless, the fed-batch process was more efficient and productive than the batch process. The productivity obtained in the best fed-batch condition (glucose addition by an increasing exponential mode) was 47 U/L.h, more than four folds the productivity of the batch culture. So that, by maintaining the glucose concentration in the medium below 5 g/L, the productivity should be improved. However, more studies are needed for optimizing the G6PDH production in a Fed-Batch process. In the fed-batch cultures the feeding conditions and kind of feeding were studied. It was observed that the best fed-batch G6PDH specific activity (72 U/g of cell when the glucose was added in a decreasing linear mode) was lower than that attained in the batch cultures.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30&#176;C or 40&#176;C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30&#176;C or 40&#176;C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de genes envolvidos no transporte de monocarboxilatos (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) e de genes específicos da oogênese (Bmp15, Gdf9 e Has2) em complexos cumulus-oócito (CCOs) selecionados pelo teste BCB. Após seleção morfológica com base no grau de compactação das células do cumulus (CCs) e no grau de homogeneidade do citoplasma, os CCOs foram corados com 26 μM BCB (azul cresil brilhante) por 90 min e divididos em dois grupos: BCB+, que apresentavam o ooplasma corado de azul, e BCB-, com ooplasma não corado. Foram utilizados dois grupos controles não expostos ao BCB: o grupo holding foi submetido às mesmas condições que os grupos corados e o outro grupo controle foi diretamente submetido à maturação in vitro (MIV), após a seleção morfológica dos CCOs. A expressão gênica relativa foi determinada por RT-PCR em CCOs coletados antes e ao final da maturação. A expressão também foi avaliada, separadamente, em oócitos desnudos (ODs) e células do cumulus (CCs) antes e após a maturação. A análise dos transcritos demonstrou que houve aumento significativo (p < 0,05) na expressão relativa de Gdf9 e Bmp15 nos grupos BCB+, BCB- e holding antes da MIV, enquanto Has2 teve aumento significativo (p < 0,01) após a MIV apenas no grupo controle. Os outros genes analisados (Mct1, Mct2 e Mct4) mantiveram-se estáveis durante a maturação. O aumento na abundância relativa de alguns transcritos durante a MIV pode ser atribuído as condições de incubações durante o teste BCB. Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, a expressão de Mct1, 2 e 4 em CCOs bovinos. Enquanto o mRNA de Mct1 e Mct4 estava presente em ODs e em CC, o Mct2 foi detectado somente em CCs. Não detectamos a expressão de transcritos de Mct3 em CCOs. As diferenças na expressão dessas três isoformas sugerem um papel único para esses transportadores durante a maturação. / The aim of this study was to determine the relative expression of genes involved in transport of monocarboxylates (Mct1, Mct2, Mct3 e Mct4) and oogenesis specific genes (Bmp15, Gdf9 and Has2) in immature and mature bovine cumulus-oocyte complexes (COC) after selection by BCB. Immature COCs underwent morphological selection and were stained with 26 mM BCB for 90 min. Based on ooplasm staining, oocytes were distributed in two groups BCB+ (blue color) and BCB- (non-stained). The holding control group was exposed to the same incubation conditions as stained COCs, but without BCB. Control group was submitted to in vitro maturation (IVM) immediately after morphological selection. mRNA expression was investigated by RT-PCR in COCs before and after IVM. No relationship was observed in the relative expression of Has2, Gdf9, Bmp15 or Mct1, 2 and 4 transcripts between BCB- and BCB+ COCs. Transcripts analysis showed that Gdf9 and Bmp15 in BCB+, BCB- and holding groups were upregulated (p < 0.05) before IVM, while Has2 was up-regulated (p < 0.01) after IVM in the control group. Others genes remained stable during maturation (Mct1, 2 and 4). The increase in relative abundance of some transcripts during IVM may be attributed to incubation conditions during the BCB test. Our results showed, for the first time, Mct1, 2 and 4 expression in bovine COCs. Mct1 and Mct4 transcripts were present in denuded oocytes and cumulus cell, while Mct2 was detected only in cumulus cells. These differences between the three isoforms in localization suggest unique roles for each in monocarboxylate transport during maturation.