O protozoário flagelado Giardia duodenalis é um parasito intestinal que pode infectar uma ampla variedade de mamíferos, incluindo os humanos e os animais domésticos e selvagens. Devido à carência de informações a respeito da caracterização molecular de amostras de Giardia spp. no Brasil, o presente estudo teve como objetivo analisar 113 amostras de fezes positivas para Giardia spp. de origem humana e animal. Um segmento do gene que codifica a enzima glutamato desidrogenase (gdh) dos isolados provenientes de 37 humanos, 31 cães, 20 gatos, 12 bugios, cinco bezerros, três chinchilas, duas avestruzes, dois cachorros-do-mato e uma onça-pintada foi amplificado e seqüenciado. A análise da seqüência de nucleotídeos do gene gdh mostrou que estes isolados foram divididos em seis linhagens genéticas principais (Assemblages A, B, C, D, E, F). O genótipo AII foi identificado apenas nas amostras de humanos, enquanto o genótipo AI foi detectado nos isolados de origem animal (gato, bezerro, onça-pintada). Os isolados de Giardia spp. provenientes dos humanos, bugios, chinchilas e avestruzes foram caracterizados como pertencente ao genótipo BIV. Entretanto, os demais Assemblages foram identificados apenas em um grupo específico de hospedeiros. Assemblage C e D foram encontrados nas amostras de cães e cachorros-do-mato, Assemblage F nas amostras de gatos e Assemblage E nas amostras de bezerros. A caracterização molecular das amostras de Giardia spp. gera uma importante contribuição para o conhecimento da especificidade de hospedeiro dos diferentes genótipos. / The flagellated protozoan Giardia duodenalis is an intestinal parasite that can infect a broad variety of mammalian hosts, including humans and domestic and wild animals. Due the lack of information about the molecular characterization of Giardia spp. in Brazil, this study aimed to analyse 113 stool samples from human and animals, all positive to Giardia spp. A segment of the glutamate dehydrogenase gene (gdh) of isolates from 37 humans, 31 dogs, 20 cats, five calves, 12 wild monkeys, three chinchilas, two ostrichs, two crab-eating-foxes and one jaguar was amplified and sequenced. Nucleotide sequences analysis of gdh gene showed that these isolates could be divided into six main genetic lineage (Assemblages A, B, C, D, E, F). The genotype AII was identified only in human isolates, whereas genotype AI was detected in a variety of animals (cat, calf, jaguar). In adition, Giardia spp. isolates recovered from human, wild monkeys, chinchila and ostrichs were characterized as genotype BIV. However the other Assemblages identified were confined to restrict host species. Assemblages C and D were found in isolates from dogs and crab-eating-foxes, Assemblage F from cats and Assemblage E from calves. The molecular characterisation of Giardia spp. isolates has made a major contribution to our understanding of the host specificity of different genotypes.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA068.pdf: 13593 bytes, checksum: bb2118cc19310d22381d61f71c63aee7 (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 / The mitochondrial enzyme Glutamate Dehydrogenase (GDH: EC 1.4.1.2) catalyzes the reversible deamination of the L-glutamate for 2-oxoglutarate (α-ketoglutarate) using NAD+ and NADP+ as coenzymes. It is a complex allosteric enzyme that consists of six identical subunits being its activity influenced by both, the ADP its positive modulator, and by the GTP, its negative modulator.It is one of the most important liver enzymes found in hepatocytes of cattle, sheep and goats. Infections by Fasciola spp or severe acute intoxication by toxins of plants such as Xanthium spp and Senecio spp as well as intoxication by copper result in the release of this enzyme in blood. The increase of the GDH indicates damage or hepatic necrosis in cattle and sheep. This is an enzyme of choice to evaluate the function of the ruminants. In the present study the cDNA, that codifies the GDH enzyme of the hepatocyte of sheep, was synthesized by means of the RT-PCR making use of mRNA extracted from the liver of sheep. Part of the region where the cDNA of the GDH of the ovine is codified was amplified by PCR from primers synthesized through the comparison of the aligned sequences of Ovis aries with those of the Bos taurus,. Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculus available in the database, where highly conserved regions, as well as variable regions were identified.The cDNA was cloned in the vector pGEM®-T Easy Vector Systems and inserted in competent cells of the Escherichia coli DH10B by means heat shock. The plasmid DNA was purified and after sequencing, the presence of an insert of 1292 pb was confirmed. The alignment of the sequence deduced of amino acid with other species revealed high homology among the GDH / A enzima mitocondrial Glutamato Desidrogenase (GDH : EC 1.4.1.2) catalisa a desaminação reversível do L- glutamato para 2-oxoglutarato (α-cetoglutarato) usando o NAD+ e NADP+ como coenzimas . É uma enzima alostérica complexa que consiste em seis subunidades idênticas sendo sua atividade influenciada tanto pelo ADP, seu modelador positivo, como pelo GTP, seu modelador negativo. É uma das mais importantes enzimas hepáticas encontradas em hepatócitos de bovinos, ovinos e caprinos. Infecções por Fasciola spp ou intoxicação grave aguda por toxinas de plantas tais como Xanthium spp e Senecio spp e intoxicação por cobre resultam na liberação dessa enzima no sangue. O aumento da GDH indica danos ou necrose hepática em bovinos e ovinos. Esta é a enzima de escolha para avaliar a função hepática dos ruminantes. No presente trabalho o cDNA que codifica a enzima GDH do hepatócito de ovino foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando mRNA extraído do fígado de ovino. Parte da região de codificação do cDNA da GDH de ovino foi amplificada por PCR a partir de oligonucleotídeos iniciadores sintetizados através da comparação das sequências alinhadas de Ovis aries com de Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus e Mus musculus disponíveis em banco de dados, onde foram identificadas regiões bastante conservadas e regiões variáveis. O cDNA foi clonado no vetor pGEM® -T Easy Vector Systems e inserido em células competentes de Escherichia coli DH10B através de choque térmico. O DNA plasmidial foi purificado e após o sequenciamento a presença de um inserto de 1292 pb foi confirmado. O alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos com outras espécies revelou alta homologia entre as GDH

O protozoário flagelado Giardia duodenalis é um parasito intestinal que pode infectar uma ampla variedade de mamíferos, incluindo os humanos e os animais domésticos e selvagens. Devido à carência de informações a respeito da caracterização molecular de amostras de Giardia spp. no Brasil, o presente estudo teve como objetivo analisar 113 amostras de fezes positivas para Giardia spp. de origem humana e animal. Um segmento do gene que codifica a enzima glutamato desidrogenase (gdh) dos isolados provenientes de 37 humanos, 31 cães, 20 gatos, 12 bugios, cinco bezerros, três chinchilas, duas avestruzes, dois cachorros-do-mato e uma onça-pintada foi amplificado e seqüenciado. A análise da seqüência de nucleotídeos do gene gdh mostrou que estes isolados foram divididos em seis linhagens genéticas principais (Assemblages A, B, C, D, E, F). O genótipo AII foi identificado apenas nas amostras de humanos, enquanto o genótipo AI foi detectado nos isolados de origem animal (gato, bezerro, onça-pintada). Os isolados de Giardia spp. provenientes dos humanos, bugios, chinchilas e avestruzes foram caracterizados como pertencente ao genótipo BIV. Entretanto, os demais Assemblages foram identificados apenas em um grupo específico de hospedeiros. Assemblage C e D foram encontrados nas amostras de cães e cachorros-do-mato, Assemblage F nas amostras de gatos e Assemblage E nas amostras de bezerros. A caracterização molecular das amostras de Giardia spp. gera uma importante contribuição para o conhecimento da especificidade de hospedeiro dos diferentes genótipos. / The flagellated protozoan Giardia duodenalis is an intestinal parasite that can infect a broad variety of mammalian hosts, including humans and domestic and wild animals. Due the lack of information about the molecular characterization of Giardia spp. in Brazil, this study aimed to analyse 113 stool samples from human and animals, all positive to Giardia spp. A segment of the glutamate dehydrogenase gene (gdh) of isolates from 37 humans, 31 dogs, 20 cats, five calves, 12 wild monkeys, three chinchilas, two ostrichs, two crab-eating-foxes and one jaguar was amplified and sequenced. Nucleotide sequences analysis of gdh gene showed that these isolates could be divided into six main genetic lineage (Assemblages A, B, C, D, E, F). The genotype AII was identified only in human isolates, whereas genotype AI was detected in a variety of animals (cat, calf, jaguar). In adition, Giardia spp. isolates recovered from human, wild monkeys, chinchila and ostrichs were characterized as genotype BIV. However the other Assemblages identified were confined to restrict host species. Assemblages C and D were found in isolates from dogs and crab-eating-foxes, Assemblage F from cats and Assemblage E from calves. The molecular characterisation of Giardia spp. isolates has made a major contribution to our understanding of the host specificity of different genotypes.

Giardia duodenalis é um protozoário entérico de distribuição mundial responsável por causar a giardíase em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. É considerada uma espécie complexa, no qual os isolados podem ser classificados em sete agrupamentos genéticos distintos apesar de serem morfologicamente indistinguíveis. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genotípica de isolados de G. duodenalis provenientes de humanos naturalmente infectados, residentes em cidades do litoral de São Paulo, na Baixada Santista. A caracterização molecular de 43 isolados pelo seqüenciamento parcial de genes codificadores da enzima glutamato-desidrogenase (gdh) e da proteína beta-giardina (bg) mostrou que o assemblage B da G. duodenalis é o mais freqüente na região litorânea, ocorrendo em 53,5% (n=23) das amostras, sendo o assemblage A identificado em 34,8% (n=15). A maioria das seqüências obtidas pelo gene gdh se mostrou polimórfica, caracterizada por picos duplos de nucleotídeos em algumas posições em cromatograma e quando a análise dos dois genes foi combinada cinco isolados apresentaram identidades diferentes. A esses fenômenos duas explicações são atribuídas, infecção mista ou heterozigose de seqüência alélica. As análises filogenéticas mostraram que o gene bg é mais conservado que o gene gdh, não sendo capaz de discriminar os sub-agrupamentos que constituem os Assemblages do parasita. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que a participação de genótipos zoonóticos é relevante na epidemiologia das giardíases nos indivíduos residentes das cidades litorâneas do estado de São Paulo e que estudos de caracterização molecular da G. duodenalis são indispensáveis para melhor conhecimento da epidemiologia desta infecção. / Giardia duodenalis is an enteric protozoa of global distribution responsible for causing giardiasis in a wide range of mammals including humans. Is considered complex specie in which the isolates can be classified in different genetic groups despite to be morphologically indistinguishable. The purpose of this study was evaluating the genetic variability of G. duodenalis isolates from humans naturally infected residents in the coast cities of Sao Paulo, in Baixada Santista. The molecular characterization of 43 isolates using the gene encoding glutamate-desidrogenasi enzyme (gdh) and beta-giardin protein (bg) showed that the assemblage B is the most common in the coast region, occurring in 53.5% (n=23) samples, the assemblage A was identified in 34.8% (n=15). Most sequences obtained by the gdh gene showed polymorphism, characterized for double peaks of nucleotides in some chromatogram positions and when the analysis of two genes was combined five isolates were differently identified. For this phenomena can be attributed two explanations, mixed infections or heterozygosis allelic sequence. The phylogenetic analysis showed that bg gene is more conserved than gdh gene, not being able to discriminate the sub-groups of parasite assemblages. Based on the presented results we can conclude the participation of zoonotic genotypes is important in the epidemiology of giardiasis in residents of the coast cities of Sao Paulo state and molecular characterization studies of G. duodenalis are essential for better understanding the epidemiology of this infection.

Giardia duodenalis é um protozoário entérico de distribuição mundial responsável por causar a giardíase em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. É considerada uma espécie complexa, no qual os isolados podem ser classificados em sete agrupamentos genéticos distintos apesar de serem morfologicamente indistinguíveis. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genotípica de isolados de G. duodenalis provenientes de humanos naturalmente infectados, residentes em cidades do litoral de São Paulo, na Baixada Santista. A caracterização molecular de 43 isolados pelo seqüenciamento parcial de genes codificadores da enzima glutamato-desidrogenase (gdh) e da proteína beta-giardina (bg) mostrou que o assemblage B da G. duodenalis é o mais freqüente na região litorânea, ocorrendo em 53,5% (n=23) das amostras, sendo o assemblage A identificado em 34,8% (n=15). A maioria das seqüências obtidas pelo gene gdh se mostrou polimórfica, caracterizada por picos duplos de nucleotídeos em algumas posições em cromatograma e quando a análise dos dois genes foi combinada cinco isolados apresentaram identidades diferentes. A esses fenômenos duas explicações são atribuídas, infecção mista ou heterozigose de seqüência alélica. As análises filogenéticas mostraram que o gene bg é mais conservado que o gene gdh, não sendo capaz de discriminar os sub-agrupamentos que constituem os Assemblages do parasita. Com base nos resultados apresentados podemos concluir que a participação de genótipos zoonóticos é relevante na epidemiologia das giardíases nos indivíduos residentes das cidades litorâneas do estado de São Paulo e que estudos de caracterização molecular da G. duodenalis são indispensáveis para melhor conhecimento da epidemiologia desta infecção. / Giardia duodenalis is an enteric protozoa of global distribution responsible for causing giardiasis in a wide range of mammals including humans. Is considered complex specie in which the isolates can be classified in different genetic groups despite to be morphologically indistinguishable. The purpose of this study was evaluating the genetic variability of G. duodenalis isolates from humans naturally infected residents in the coast cities of Sao Paulo, in Baixada Santista. The molecular characterization of 43 isolates using the gene encoding glutamate-desidrogenasi enzyme (gdh) and beta-giardin protein (bg) showed that the assemblage B is the most common in the coast region, occurring in 53.5% (n=23) samples, the assemblage A was identified in 34.8% (n=15). Most sequences obtained by the gdh gene showed polymorphism, characterized for double peaks of nucleotides in some chromatogram positions and when the analysis of two genes was combined five isolates were differently identified. For this phenomena can be attributed two explanations, mixed infections or heterozygosis allelic sequence. The phylogenetic analysis showed that bg gene is more conserved than gdh gene, not being able to discriminate the sub-groups of parasite assemblages. Based on the presented results we can conclude the participation of zoonotic genotypes is important in the epidemiology of giardiasis in residents of the coast cities of Sao Paulo state and molecular characterization studies of G. duodenalis are essential for better understanding the epidemiology of this infection.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30°C or 40°C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30°C or 40°C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 646482 bytes, checksum: e24f14a04e6d76f0071ed6751a17d95a (MD5) Previous issue date: 2009-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective in this trial was to evaluate the effects of supplementation with nitrogenous compounds sources on insoluble fiber utilization of through acid lactic bacteria (LAB) growth, microbial protein production, and activity of the enzymes carboxymethilcellulase (CMC) and glutamate dehydrogenase (GDH). Three experiments were carried out. At the first one, four incubations were performed using the ruminal fluid taken from a Holstein x Zebu steer fitted with ruminal canullae and fed signal grass (Brachiaria decumbens Stapf.) pasture plus 200 g/day of supplemental protein. The fluid was collected and centrifuged. The microbial pellet was re-suspended in a basal media and used as inoculum. Eight treatments were evaluated: Cellulose, Cellulose plus Casein, Cellulose plus Soy Peptone, Cellulose plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1), Starch, Starch plus Casein, Starch plus Soy Peptone, and Starch plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1). The flasks were kept at 39°C with orbital shaking (70 rpm). Successive incubations were done to select the microorganisms according to the energy and nitrogenous sources. After 24 hours of incubation, on the third and fourth transfers, the pH were evaluated and the resulting fluid was diluted and plated on a selective media for LAB according to spread plate technique. After 48 hours the colonies forming units (CFU/mL) were counted. It wasperformed a test to detect the presence of inhibitory substances on the inhibitory activity by using the LAB obtained in the previous procedure. The growth of LAB was favored (P<0.05) when starch was used as energy source compared to cellulose. The true protein sources (soy peptone and casein) increased the growth of these bacteria (P<0.05) compared to control and urea. The pH was not affected by energy source (P>0.05), but the inclusion of urea resulted in higher pH (P<0.05) compared to other sources of nitrogenous compounds. None inhibitory activity was detect on LAB cultures. In the second experiment, three incubations were performed according to the experimental procedures described above. Four treatments were evaluated: Cellulose, Cellulose plus Casein, Cellulose plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1), and Cellulose plus Casaminoacids. After the first transfer, a flask of each treatment was taken at 6, 12 and 24 hours of incubation. The microbial enzymes were extracted and the activities of CMC and GHD were evaluated. A second group of flasks was incubated in order to obtain samples at 6, 12 and 24 hours to quantify the concentration of ammonia nitrogen (AN) and microbial protein. In all incubation times higher AN concentration was observes for urea (P<0.05). At 12 and 24 hours of incubation the sources of true protein (casein and casaminoacids) caused increase in AN concentrations compared to control (P<0.05). In a general, the concentration of microbial protein was stable among treatments. The activity of CMC was higher with the use of urea and casaminoacids (P<0.05) compared to control and casein. Supplementation with casaminoacids implied higher activity of GDH (P<0.05) compared to control at 6 hours of incubation, with intermediate positions for casein and urea. At 12 hours, the activity of GDH was also stimulated by casein (P<0.05). At 24 hours the activity of GDH was not different among treatments (P>0.05). In the third experiment three Holstein x Zebu steers, with average initial body weight of 350 kg, fitted with ruminal canullae and kept in individual stalls, were used. The animals were fed Tifton hay (Cynodon sp.), ad libitum. The treatments were: control, without supplementation; supplementation with non-protein nitrogenous compounds (urea: ammonium sulfate, 9:1); and supplementation with true protein (albumin). The level of supplementation with nitrogenous compounds was 1 g/kg body weight in crude protein. The experiment was carried out according to a 3 x 3 Latin square design, with three experimental periods lasting five days each, being three days for the adaptation of animals to supplementation. In the fourth day of each experimental period, samples of rumen fluid were collected at 6, 12 and 24 hours after supplementation to evaluate pH and ruminal AN concentration. At same time, it was carried out an in situ incubation procedure in order to quantify the activity of the enzymes CMC and GHD. The average of the ruminal pH was 6.55, with no differences among treatments and time of evaluation (P>0.05). In a general way, the activity of GHD was increased between times of evaluation (P<0.05). However, there were no differences among treatments (P>0.05). The control treatment show higher activity of the CMC compared to treatments with supplementation (P<0.05). However, supplementation with urea implied higher activities of the CMC than albumin (P<0.05). The sources of nitrogen compounds (urea and albumin) caused increase in RAN concentrations compared to control (P<0.10). The concentrations of RAN decreased from the first moment of evaluation (P<0.10). From those results, it can be concluded that true protein sources cause deleterious effects on utilization of insoluble fibrous substrates because they stimulate the growth of nonstructural carbohydrates degrading bacteria. / Objetivou-se avaliar os efeitos da suplementação com diferentes fontes de compostos nitrogenados sobre a utilização da fibra insolúvel por intermédio da mensuração do crescimento de bactérias ácido-láticas (BAL), produção microbiana e atividade das enzimas carboxi-metil-celulase (CMC) e glutamato desidrogenase (GDH). Foram realizados três experimentos. No primeiro experimento realizaram-se quatro incubações utilizando-se como inóculo o fluido ruminal de um novilho mestiço Holandês-Zebu fistulado no rúmen, e alimentado com pasto de capim-braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.) e 200 g/dia de proteína bruta (PB) suplementar. O fluido ruminal coletado foi centrifugado e o pellet de microrganismos re-suspenso em meio basal utilizado como inoculo. Os substratos foram acondicionados em frascos de vidro de forma a compor oito tratamentos: Celulose, Celulose + Caseína, Celulose + Peptona de Soja, Celulose + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1), Amido, Amido + Caseína, Amido + Peptona de Soja, Amido + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1). Os frascos foram mantidos a 39 ºC, sob agitação orbital (70 rpm). Foram realizadas incubações sucessivas a fim de selecionar os microrganismos em função das fontes energéticas e de compostos nitrogenados. Após 24 horas de incubação, nas terceira e quarta transferências, procedeu-se à avaliação do pH e o fluido resultante foi diluído e plaqueado em meio seletivo para bactérias ácido láticas (BAL) segundo técnica de spread plate. Após 48 horas de crescimento, realizou-se a contagem das unidades formadoras de colônia por mL (UFC/mL). Com o objetivo de detectar a presença de substâncias inibidoras do crescimento microbiano, realizou-se teste de atividade inibitória com as BAL obtidas no procedimento anterior. O crescimento de BAL foi favorecido (P<0,05) quando se utilizou amido como fonte de energia em relação à celulose. As fontes de compostos nitrogenados de origem protéica (peptona de soja e caseína) estimularam o crescimento dessas bactérias (P<0,05) em comparação ao controle e ao uso de uréia.O pH não sofreu influência da fonte de energia (P>0,05); entretanto, a inclusão de uréia resultouem pH mais elevado (P<0,05) em relação às demais fontes de compostos nitrogenados Não foi detectada atividade antimicrobiana nas culturas de BAL isoladas. No segundo experimento realizaram-se três incubações segundo os mesmos procedimentos do experimento descrito anteriormente, avaliando-se quatro tratamentos: Celulose, Celulose + Caseína, Celulose + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1) e Celulose + Casaminoácidos. Após uma transferência, tomou-se uma frasco de cada tratamento às 6, 12 e 24 horas de incubação, realizando-se extrações das enzimas e teste de atividades da CMC e da GHD. Incubou-se uma segunda bateria de frascos a fim de se obter amostras nos tempos 6, 12 e 24 horas para quantificação da concentração de nitrogênio amoniacal (NA) e de proteína microbiana. Nos três tempos de incubação, a concentração de NA foi maior (P<0,05) quando uréia foi utilizada como fonte de compostos nitrogenados. Às 12 e 24 horas de incubação as fontes de compostos nitrogenados protéicos (caseína e casaminoácidos) causaram incremento nas concentrações NA em relação ao controle (P<0,05). De maneira geral, a concentração de proteína microbiana manteve-se estável entre os tratamentos. A atividade da enzima CMC foi superior com a utilização de uréia e casaminoácidos (P<0,05) em relação ao controle e caseína. A suplementação com casaminoácidos propiciou maior atividade da GDH (P<0,05) em relação ao controle na 6ª hora de incubação. com posições intermediárias observadas para caseína e uréia, às 12 horas a atividade da GDH passou a serestimulada também pela caseína (P<0,05). Às 24 horas a atividade da GDH não apresentou diferenças entre tratamentos (P>0,05).Para o terceiro experimento utilizaram-se três novilhos mestiços Holandês x Zebu, compeso corporal inicial de 350 kg fistulados no rúmen, mantidos em baias individuais recebendo feno de Tifton (Cynodon sp.) ad libtum.Os tratamentos foram: controle, sem suplementação; suplementação com compostos nitrogenados não-protéicos (uréia:sulfato de amônio, 9:1); e suplementação com compostos nitrogenados protéicos (albumina). Para os tratamentos que compreenderam suplementação com compostos nitrogenados definiu-se o fornecimento em 1 g/kg de peso vivo dos animais em proteína bruta. O experimento foi conduzido segundo delineamento em quadrado latino 3 x 3, com três períodos experimentais com duração de cinco dias cada, sendo os três primeiros dias destinados à adaptação ruminal dos animais à suplementação. Para avaliação do pH e da concentração de NA ruminal coletou-se, no quarto dia de cada período experimental, alíquotas de líquido ruminal nos tempos 6, 12 e 24 horas após a suplementação. Simultaneamente a esta avaliação, conduziu-se procedimento de incubação in situ para quantificação da atividade das enzimas CMC e GHD. A média do pH do líquido de rúmen foi de 6,55, não havendo diferenças entre os tratamento e os tempos de avaliação (P>0,05). Em termos gerais, a atividade da GHD foi ampliada nos intervalos avaliados (P<0,05). Entretanto não foram observadas diferenças entre os tratamentos (P>0,05) sobre a atividade da GDH. De maneira geral, o tratamento controle apresentou maior atividade da CMC em relação ao tratamentos que continham fontes suplementares de nitrogênio (P<0,05). Entretanto, a suplementação com uréia propiciou maiores atividades da CMC em relação à albumina (P<0,05). As fontes de compostos nitrogenados (uréia e albumina) causaram incremento nas concentrações NA em relação ao controle (P<0,10). As concentrações de NA decresceram a partir do primeiro momento de avaliação (P<0,10). A partir dos resultados obtidos concluiu-se que fontes de compostos nitrogenados de origem protéica provocam efeitos deletérios sobre a utilização de substratos fibrosos insolúveis devido ao favorecimento do crescimento de bactérias fermentadoras de carboidratos não-estruturais.

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T10:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_PriscillaMunizRibeiroda_D.pdf: 2752788 bytes, checksum: a2b912ed65ab26f33708f44d094db90a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A glutamato desidrogenase (GDH) é uma enzima mitochondrial que cataliza a reação reversível de glutamato a ?-cetoglutarato. Nas ilhotas pancreáticas, está associada com a secreção de insulina por aumentar a concentração de ATP. Ratos alimentados com dieta hipoprotéica apresentam secreção de insulina diminuída. A suplementação com leucina (LEU) aumenta a secreção de insulina em resposta a agentes insulinotrópicos. O presente estudo investigou a influência da suplementação com LEU na expressão da GDH e seu envolvimento com a secreção de insulina em ratos desnutridos e suplementados com LEU. Ratos machos foram alimentados com dietas normo- (17%, NP) ou hipoprotéicas (6%, LP) por oito semanas. Após, foram divididos e suplementados com LEU (1,5%) na água de beber (NPL e LPL) pelas quatro semanas seguintes. O conteúdo protéico de GDH no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético não diferiu entre os grupos. Nas ilhotas LP, a expressão da GDH estava diminuída e a suplementação com LEU aumentou a expressão de RNAm restaurando o conteúdo protéico a valores similares a NP. A secreção de insulina estimulada por agentes insulinotrópicos ou inibidores, combinados ou não, estava diminuída em ilhotas LP comparada com NP. A suplementação com LEU aumentou a secreção de insulina a valores similares a NP, exceto quando as ilhotas LPL foram incubadas com EGCG. Ilhotas LP tiveram diminuição na [Ca2+]i quando expostas a GLN+BCH. A suplementação com LEU restaurou esses parâmetros aos valores de NP. Frente a esses resultados, podemos concluir que a diminuição na expressão da GDH induzida pela dieta LP foi central ao pâncreas endócrino e está associada à redução da secreção de insulina observada nas ilhotas LP. A suplementação com LEU foi capaz de restaurar a expressão da GDH, contribuindo para o aumento da secreção de insulina observado nas ilhotas LPL. Além disso, a GDH pode, ainda, estar associada com a secreção de insulina pelo acoplamento estímulo/secreção via regulação da [Ca2+]i / Abstract: Glutamate dehydrogenase (GDH) is a mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the reversible reaction of glutamate to ?-ketoglutarate. In the pancreatic islets, this enzyme is associated with insulin secretion by augmenting ATP levels. Protein malnourished rats displayed reduced insulin secretion. Leucine (LEU) supplementation augments the insulin secretion response to insulinotropic agents. The present study investigated the influence of LEU supplementation on GDH expression and its involvement with insulin secretion in malnourished rats supplemented with LEU. Male rats were fed normal- (17%, NP) or low-protein diet (6%, LP) for eight weeks. Half of rats of each group were supplemented with LEU (1.5%) in drinking water for the following four weeks (NPL and LPL groups). GDH protein content in brain, liver, kidney and skeletal muscles was not different in any group. GDH RNAm and protein content was reduced in LP islets and LEU supplementation augmented RNAm expression restoring protein content similar to NP. Insulin secretion was reduced in LP islets compared with NP when stimulated by insulinotropics agents or inhybitors, combinaned or not. LEU supplementation augmented insulin secretion to similar values as NP, an effect that was blunted when LPL islets were incubated with EGCG. LP islets showed lower [Ca2+]i when exposed to GLN+BCH. LEU supplementation augmented these patterns similar to NP. Taken together, we may conclude that diminution in GDH expression induced by LP diet was central to endocrine pancreas and was associated with reduced insulin secretion observed in LP rats. LEU supplementation was able to restore GDH expression and it was capable to restore insulin secretion via GDH restoration. Yet, GDH may contribute to insulin secretion via Ca2+ regulation stimulus/secretion coupling / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sarah_Romano_Ortolan.pdf: 975526 bytes, checksum: d72ab61fc7bdc88b6ddbab0eb3a86e42 (MD5) Previous issue date: 2015-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Wheat is considered the main cereal diet of the world population, but in recent years has achieved some gain in productivity of this culture despite having increased the use of nitrogen fertilizer. The use of plant growth promoting bacteria such as Herbaspirillum seropedicae SmR1 among others has been studied to obtain development of plants with less use of nitrogen fertilizers. However there is little information relating the effects of this interaction in plant development and grain yield. Objective of this study was to evaluate the carbon and nitrogen metabolism by certain enzymes, metabolites and indices related to the response to infectious stress on the wheat cultivars CD 104 and CD 120 in association with Herbaspirillum seropedicae bacteria. Two experiments were conducted. The experimental design was completely randomized with four replications in a 4x2. The first factor relates to the conditions inoculation with bacteria and/or nitrogen source in coverage are: control without inoculation with bacteria or added nitrogen fertilizer (C); application of nitrogen fertilizer (50 kg.ha-1) 30 days after sowing (N); inoculation with 106 cells of the bacterium H. seropedicae/seed at planting (Hs) and inoculation with bacteria combined with the application of nitrogen fertilizer (Hs + N) and the second factor refers to the phenological stages (tillering and booting). The results indicated that inoculation with H. seropedicae in wheat seeds of cv.s CD 104 and CD 120 in the two growth stages answered in relation to the indices related to stress with the involvement of enzymes of carbon and nitrogen metabolism. However prominent effect was not noticed to promote plant growth of wheat in late development, nor a deleterious effect of the bacterium for inoculation cv. CD 104 under the experimental conditions. For cv. CD 120 the differential effects indicate lower levels of stress and some level of association to positive effect on productivity when combined inoculation of bacteria to nitrogen fertilization. It was concluded that as well as pathogenic and stressors, H. seropedicae able to beneficially associate with wheat also provides similar interference pattern of carbon and nitrogen metabolism and stress levels / O trigo é considerado o principal cereal da dieta da população mundial, entretanto nos últimos anos tem se obtido pouco ganho de produtividade desta cultura apesar de se ter aumentado o uso de fertilizante nitrogenado. O uso de bactérias promotoras do crescimento vegetal, como Herbaspirillum seropedicae SmR1 entre outras, tem sido estudado para se obter desenvolvimento de plantas com menor uso de fertilizantes nitrogenados. Entretanto existem poucas informações que relacionam os efeitos desta interação no desenvolvimento da planta e de produtividade de grãos. Objetivo deste trabalho foi avaliar o metabolismo de carbono e nitrogênio através de algumas enzimas, metabólitos e índices relacionados à resposta ao estresse infeccioso em trigo das cultivares CD 104 e CD 120 em associação com a bactéria Herbaspirillum seropedicae em dois estádios fenológicos. Foram realizados dois experimentos. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso, com 4 repetições, em esquema fatorial 4x2. O primeiro fator refere-se às condições de inoculação com bactéria e/ou fertilização nitrogenada em cobertura, sendo: controle, sem inoculação com bactéria ou adição de fertilizante nitrogenado (C); aplicação de fertilizante nitrogenado (50 kg.ha-1) após 30 dias da semeadura (N); inoculação de 106 células da bactéria H. seropedicae/semente na semeadura (Hs) e inoculação com a bactéria combinada com a aplicação de fertilizante nitrogenado (Hs + N) e o segundo fator refere-se aos estádios fenológicos (perfilhamento e emborrachamento). Os resultados indicaram que a inoculação com H. seropedicae em sementes de trigo das cv.s CD 104 e CD 120 nos dois estádios fenológicos responderam em relação aos índices relacionados ao estresse com envolvimento das enzimas do metabolismo de carbono e nitrogênio. Entretanto não foi percebido efeito proeminente de promoção do crescimento vegetal no final do desenvolvimento do trigo, tampouco efeito deletério da inoculação de bactéria para a cv. CD 104, nas condições experimentais. Para a cv. CD 120 os efeitos diferenciais indicam menor nível de estresse e algum nível de associação para efeito positivo na produtividade quando combinada a inoculação da bactéria com a fertilização nitrogenada. Foi possível concluir que assim como para agentes patogênicos e estressantes, a H. seropedicae, capaz de associar beneficamente com trigo também apresenta padrão semelhante de interferência do metabolismo de carbono e nitrogênio e índices de estresse