La α-1,3-galactosiltransferasa (α3GT) està involucrada en la biosíntesis d'oligosacàrids antigènics responsables del rebuig immunològic hiperagut (HAR) en el xenotransplant d'òrgans d'animals a humans, per la qual cosa aquesta enzima té un particular interès en biomedicina. Per altra banda, la α3GT constitueix un model enzimàtic per a estudis mecanístics i estructurals de glicosiltransferasas. L'enzim transfereix galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).Actualment, els estudis cristalogràfics han mostrat dos tipus d'estructures amb diferents conformacions en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, aquesta zona està altament desordenada, però en la forma II està ben definida, la qual cosa suggereix que funciona com a tapa que tanca el lloc catalític. Aquests canvis conformacionals suggereixen que l'extrem C-terminal podria tenir un rol clau en l'activitat catalítica.En la present tesis doctoral es va abordar l'estudi estructural/funcional de l'extrem C-terminal des d'un enfocament d'anàlisi cinètic d'estabilitat de mutants d'alanina de cadascun dels aminoàcids de les posicions 358-368. D'aquesta manera, la comparació entre eficiència catalítica i estabilitat enzimàtica proporcionen un mètode que permet identificar els aminoàcids que tenen un paper important en la unió de lligand o en l'empaquetament estructural. Pels mutants K359A, Y361A, V363A y R365A no s'ha detectat activitat, per la qual cosa aquestes posicions són fonamentals per a l'activitat α3GT. K359, Y361 i R365 interaccionen amb els fosfats del UDP-Gal, a més, K359A també interacciona amb l'hidroxil 3 de la lactosa segons modelització molecular, per la qual cosa s'ha proposat un paper d'àcid/base general a la lisina 359. Per altra banda, els mutants N367A i V368A van resultar ser de 2 a 3 vegades més actius que wt, respectivament. Els estudis d'estabilitat revelen que wt i mutants de residus no involucrats directament en la interacció amb els substracts, presenten major estabilitat que aquells que segons els models moleculars i les estructures cristal·logràfiques interaccionen directament amb el UDP o UDP-Gal. Per altra banda, es va trobar que la presència de UDP disminueix en mutants de residus directament implicats en les interacciones amb el UDP-Gal. / La α-1,3-galactosiltransferasa (α3GT) está involucrada en la biosíntesis de oligosacáridos antigénicos responsables del rechazo inmunológico hiperagudo (HAR) en el xenotransplante de órganos de animales a humanos, por lo que esta enzima tiene un particular interés en biomedicina. Por otra parte, la α3GT constituye un modelo enzimático para estudios mecanísticos y estructurales de glicosiltransferasas. La enzima transfiere galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac).Actualmente, los estudios cristalográficos han mostrado dos tipos de estructuras con diferentes conformaciones en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, esta zona está altamente desordenada, pero en la forma II está bien definida, lo cual sugiere que funciona como tapa que cierra el sitio catalítico. Estos cambios conformacionales sugieren que el extremo C-terminal podría tener un rol clave en la actividad catalítica.En la presente tesis doctoral se abordó el estudio estructural/funcional del extremo C-terminal desde un enfoque de análisis cinético y de estabilidad de mutantes de alanina de cada uno de los aminoácidos de las posiciones 358-368. De esta manera, la comparación entre eficiencia catalítica y estabilidad enzimática proporcionan un método que permite identificar los aminoácidos que tienen un rol importante en la unión de ligando o en el empaquetamiento estructural.Para los mutantes K359A, Y361A, V363A y R365A no se ha detectado actividad, por lo cual estas posiciones son fundamentales para la actividad de α3GT. K359, Y361 y R365 interaccionan con los fosfatos del UDP-Gal, además, K359A también interaccionan con el hidroxilo 3 de la lactosa según modelización molecular, por lo cual se ha propuesto un rol de ácido/base general a la lisina 359. Por otra parte, los mutantes N367A y V368A resultaron ser de 2 a 3 veces más activos que wt, respectivamente. Los estudios de estabilidad revelan que wt y mutantes de residuos no involucrados directamente en la interacción con los sustratos, presentan mayor estabilidad que aquellos que según los modelos moleculares y las estructuras cristalográficas interaccionan directamente con el UDP o UDP-Gal. Por otra parte, se encontró que la presencia de UDP disminuye en mutantes de residuos directamente implicados en las interacciones con el UDP-Gal. / Mammalian α-1,3-Galactosyltransferase (α3GT) is involved in the biosynthesis of the oligosaccharide antigen responsible for hiperacute (vascular) rejection (HAR) in xenotransplantation of animal organs to humans [1]. α3GT is also used as a model enzyme for studies of glycosyltransferase structure and mechanisms, as well as biocatalyst in enzymatic oligosacaride synthesis. The enzyme catalyzes the transfer of galactose (Gal) from UDP-Gal a la N-acetyllactosamyne (NAcLac), or to lactose.Currently, there are two types of α3GT 3-dimensional structure. The previously reported form I [2] is similar to the form II [3,4], except at the C-terminal residues 358-368. The C-terminal region is highly disordered in form I but well defined in form II, suggesting that it functions as a lid that closes the active site. The conformational change at the C-terminus and the sequence conservation among other α3GT suggest that this region could have key role in the catalytic action [4]. In the present Doctoral Thesis, the study structure/function of the end C-terminal was approached by a kinetic analysis and by stability analysis of alanine mutants for each one of the amino acids at positions 358-368. This way, the comparison of catalytic efficiency and enzymatic stability provides a method that allows identification of the amino acids that have an important role in the substrate binding or in structural packaging. For mutants K359A, Y361A, V363A and R365A no activity was detected, therefore these positions are fundamental for α3GT activity. K359, Y361 and R365 interact with the UDP-Gal phosphates, also, K359A interacts with the 3-hydroxyl of the lactose according to molecular modeling, thereby it has been proposed to have the role as the general acid/base. On the other hand, the mutants N367A and V368A turned out to be 2 or 3 times more active than wt, respectively. The studies of stability reveal that amino acids mutants (wt including) which don't directly interact with the substrates do not present higher stability than the amino acid mutants which directly interact with the substrate UDP or UDP-Gal. On the other hand, the presence of UDP stabilizes de wt enzyme and the mutants of the amino acids that don't directly interact with the substrates, while this UDP stabilizing effect diminishes in mutants of amino acids directly implied in the interactions of UDP or UDP-Gal.

El ácido salicílico (SA) juega un papel fundamental en la respuesta defensiva de las plantas. Este compuesto se acumula en las mismas como consecuencia de infecciones patogénicas de tipo incompatible, y su aplicación exógena induce resistencia. Asimismo, plantas transgénicas incapaces de acumularlo presentan una mayor susceptibilidad a patógenos de distinta naturaleza. Por otra parte, el ácido gentísico (GA, ácido 2,5-dihidroxibenzoico) se acumula en plantas en infecciones compatibles no necrotizantes. La aplicación exógena de GA induce un conjunto de proteínas de defensa PR (Pathogenesis related) distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario en la señalización frente a patógenos en plantas. Ambos compuestos se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una o más moléculas de azúcar. Estas reacciones de conjugación son catalizadas por proteínas denominadas glicosiltransferasas. En plantas de tomate el SA se acumula como SA 2-O-ß-glucósido, unido a una molécula de glucosa, mientras el GA lo hace en forma de GA 5-O-ß-xilósido, unido a xilosa. GAGT (Gentisic Acid Glycosyl Transferase) ha sido descrita como la proteína que conjuga GA en tomate. Dado que la glicosilación de metabolitos es una forma rápida de inactivarlos, la existencia de esta proteína con actividad conjugadora de GA refuerza la idea del ácido gentísico (GA) como molécula señal complementaria al SA en la interacción planta-patógeno. Por otra parte, la proteína Twi1 (Tomato wound inducible), descrita en tomate como una posible glicosiltransferasa debido a sus características comunes con este grupo de proteínas, presenta inducción por SA y otros compuestos de naturaleza fenólica, además de herida e interacciones de tipo incompatible. Trabajos en los que se ha llevado a cabo la sobreexpresión o el silenciamiento de una GT han puesto de manifiesto cómo ello conlleva la aparición de resistencia o susceptibilidad frente a una infección patogénica. Por tanto, las GTs tienen un papel fundamental en la respuesta defensiva de la planta, modulando los niveles de moléculas que intervienen en dicha respuesta. Por otra parte, se han realizado estudios dirigidos a elucidar la implicación de compuestos del metabolismo secundario en la interacción de plantas de tomate con distintos patógenos. Ello ha permitido detectar cambios concretos de los niveles de un número determinado de metabolitos a lo largo de las infecciones, como son cuatro amidas derivadas del ácido hidroxicinámico (HCAAs) que se acumulan en plantas de tomate infectadas con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. Las HCAAs son un conjunto de metabolitos, pertenecientes al grupo de los fenilpropanoides, de bajo peso molecular y que se caracterizan por la presencia de nitrógeno en su estructura. En su ruta de biosíntesis participan diversos enzimas tales como la fenilalanina amonio liasa (PAL), la tirosina descarboxilasa (TYDC) o la tiramina hidroxicinamoil transferasa (THT). La acumulación en tomate de las cuatro amidas como consecuencia de la infección bacteriana va acompañada de la inducción del isoenzima THT1-3. La obtención de plantas transgénicas que sobreexpresen o silencien las proteínas GAGT, Twi1 y THT1-3 permitirá llevar a cabo ensayos de resistencia frente a infecciones patogénicas que contribuyan al conocimiento del sistema defensivo de las plantas, tanto en sus aspectos de señalización como en los referidos a componentes de la respuesta final de la planta. Al mismo tiempo, esta estrategia puede constituir, en sí misma, un medio de obtención de plantas más resistentes frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza. / Campos Beneyto, L. (2014). Metabolitos secundarios de naturaleza fenólica: papel en la respuesta defensiva de plantas de tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/44236 / TESIS