Orientador: Roberto da Silva / Banca: Inês Conceição Roberto / Banca: Haghuvir Arni / Resumo: A glucoamilase é uma enzima importante na produção enzimática de xarope de glicose a partir do amido. Neste processo o amido é primeiramente dextrinizado pela ação da a-amilase a aproximadamente 100°C. Em seguida, a suspensão de dextrinas é resfriada a uma temperatura próxima de 55°C para a sacarificação, pela ação da glucoamilase. A característica de alta termoestabilidade para essa enzima é fundamental para agilizar o processo e reduzir custos operacionais. O presente estudo visou à obtenção, caracterização físico-química, bem como a cinética de termoinativação das glucoamilases mutantes de Aspergillus awamori expressa em Saccharomyces cerevisiae. O gene da glucoamilase sofreu alterações através da técnica de PCR mutagênico, e os clones expressando glucoamilases mais termoestáveis foram selecionados e avaliados. A glucoamilase selvagem apresentou temperatura ótima de atividade a 58°C, as enzimas mutantes apresentaram atividades ótimas a 68°C para a linhagem M1, e 65°C para a linhagem M2. As glucoamilases mutantes M1 e M2 também apresentaram maior termoestabilidade que a enzima selvagem. As temperaturas de desnaturação térmicas na ausência de substrato por 1 hora foram 45, 50 e 55°C para as enzimas, selvagem, M1 e M2, respectivamente. Todas as enzimas apresentaram atividade ótima no pH 3,5 - 4,0, sendo que os mutantes M1 e M2 também exibiram maior estabilidade à variação de pH, retendo acima de 80% da atividade na faixa de pH 5,5 a 10,0. A meia vida (t1/2) a 70°C foi de 8,1 minutos para a glucoamilase mutante M2, 3,8 minutos para o mutante M1 e 3 minutos para a glucoamilase selvagem. A termoinativação das enzimas seguiram uma cinética de primeira ordem. A energia de desnaturação foi de 262,8 e 252,9 KJ mol-1 para os mutantes M2 e M1 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucoamylase is an important enzyme for the production of glucose syrup made from starch. In this process, starch is initially dextrinized by the action of a a-amylase at approximately 100ºC. Secondly, the dextrins suspension is cooled down to a temperature near 55ºC for the saccharification, by the action of an glucoamylase. High thermostability is a fundamental characteristic for this enzyme to accelerate the process and to reduce operational costs. This work had the purpose of studying physicochemical characteristics as well as thermoinactivation kinetics of mutants glucoamylases of Aspergillus awamori expressed in Saccharomyces cerevisiae. Glucoamylases gene was modified through mutagenic PCR technique and the clones which produced more thermostable glucoamylases were selected and evaluated. The wild glucoamilase exhibited optimum temperature at 58ºC, the mutants from strain M1 and M2 acted optimally at 68ºC and 65ºC, respectively. The mutants M1 and M2 also exhibited higher thermostability when compared to the wild enzyme. Thermic denaturation temperatures in the absence of substrate for 1 hour were 45, 50 and 55ºC for the wild, M1 and M2 enzymes, respectively. All enzymes showed optimum activity at pH 3.5 – 4.0, and the mutants M1 and M2 also exhibited higher stability towards pH variation, maintaining 80% of activity in pH from 5.5 to 10.0. Half life (t1/2) at 70ºC was 8.1 minutes for mutant M2, 3.8 minutes for mutant M1 and 3 minutes for wild glucoamylase. The enzymes thermoinactivation followed a first order kinetics. Denaturation energy was 262.8 and 252.9 KJ mol-1 for mutants M2 and M1 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild enzyme. Thermodynamic parameter of thermoinactivation, .G was lower for wild glucoamylase showing a higher denaturation for the enzyme. All enzymes revealed similar activity profile on different substrates, of which corn starch was the best substrate for hydrolysis for all glucoamylases tested. / Mestre

Resumo: A glucoamilase é uma enzima hidrolítica que catalisa a liberação sucessiva de β-D-glicose a partir do amido e oligossacarídeos relacionados. Neste trabalho foram estudadas as glucoamilases de Aspergillus awamori expressas em levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram utilizadas duas linhagens alteradas denominadas M1 e M2, e uma linhagem selvagem (WT), utilizada como parâmetros na comparação dos resultados. As enzimas foram produzidas em fermentação submersa, e amidos de diferentes origens vegetais foram utilizados como uma fonte extra de carbono na produção das enzimas. O melhor substrato para a produção da glucoamilase selvagem e da mutante M2 foi o amido de batata com 8,2 e 6,6 U/mL, respectivamente. Para a linhagem M1 foi o amido de mandioca com atividade enzimática de 5,9 U/mL. O amido de milho mostrou ser um substrato menos indicado para a produção destas enzimas. Para a purificação foi preparada uma coluna de afinidade com resina sepharoseTM 6B epóxi ativada ligada a acarbose, onde diferentes concentrações do ligante foram avaliadas. A coluna apresentou boa eficiência no processo de purificação conforme análise por eletroforese SDS-PAGE, com massas moleculares estimada em 100 kDa. A temperatura ótima de atividade das enzimas M1 e M2 foi 65 °C, enquanto que a selvagem teve sua atividade máxima em 60 °C. O pH ótimo de atuação das enzimas foi 4,5. As glucoamilases mutantes apresentaram maior termoestabilidade que a glucoamilase selvagem durante o processo de termoinativação, destacando principalmente a glucoamilase M2. A meia vida a 70 °C foi de 8,1 minutos para a enzima mutante M2, 4,1 minutos para a M1 e 3,0 minutos para a enzima selvagem. A energia de ativação para a desnaturação (Ead) foi de 252,9 e 262,8 KJ mol-1 para as enzimas M1 e M2 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para a selvagem. A maior energia dos mutantes indica maior resistência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucoamylase is a hydrolytic enzyme that catalyzes the consecutive liberation of β-D-glucose from starch and related oligosaccharides. In this work glucoamylases from Aspergillus awamori expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae were studied. Two mutant strains, denominated M1 and M2, were used and one wild strain (WS) was used as parameter to compare the results. The enzymes were produced in submerged fermentation and starches from different botanical origins were used as extra carbon source for enzyme production. The best substrate for the production of wild glucoamylase and of mutant M2 was potato starch with 8.2 and 6.6 U/mL, respectively. For strain M1 the best substrate was cassava starch with enzymatic activity of 5.9 U/mL. Corn starch revealed to be a less indicated starch for the production of these enzymes. For purification, an affinity column was prepared with activated SepharoseTM 6B epoxy linked to acarbose, and different concentrations of ligand were evaluated. The column exhibited good efficiency during the purification process according to SDS-PAGE analysis, with molecular masses estimated in 100 kDa. Optimum temperature for activities of M1 and M2 enzymes was 65°C, while the wild one exhibited maximum activity at 60°C. Optimum pH for enzyme action was 4.5. Mutant glucoamylases presented higher thermostability than wild glucoamylase during the thermoinactivation process, with M2 standing out. Half life at 70°C was of 8.1 minutes for mutant enzyme M2, 4.1 minutes for M1 and 3.0 minutes for wild enzyme. Activation energy for denaturation (Ead) was 252.9 and 262.8 KJ mol-1 for enzymes M1 and M2 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild one. The higher energy of the mutants indicates higher resistance of the protein structure, since more energy is required for the molecule to enter a transition and unfolding state. Thermodynamic parameter ΔG was higher... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Heloiza Ferreira Alves-Prado / Banca: Maria de Lourdes T. de M. Polizeli / Banca: Fernando Araripe Gonçalves Torres / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Eleonora Cano Carmona / Doutor