Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-25T18:55:01Z No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Metagenomics studies allow the direct analysis of a genetic material in an environmental sample and when linked to bioinformatics it gives a powerful tool to explore the role of new genes and proteins not studied before. Constant decreases in the quantity of fossil fuels and their effects in the global economy and natural environment has accelerated researches in alternative fuels such as the second generation ethanol, which can be produced by vegetation biomass. However, this process demands previous hydrolysis of the lignocellulolytic material by hydrolytic enzymes to provide fermentable sugar. β-glucosidases are enzymes which plays an important role at the final step of cellulose breakdown to glucose, thus being considered the rate limiting enzyme in this process of biomass degradation. Many β-glucosidases are already known, however there is an interest to find new enzymes which are tolerant to glucose inhibition and which exhibits high activity at lower temperatures. In this study we searched for β-glucosidases (GH1) using sequences from a metagenomics database from rivers and lakes in the Amazon region developed in our laboratory. We found 3 complete open reading frames (ORFs) related to β-glucosidases and one of them was selected to be produced in E.coli in a heterologous way and to be biochemically characterized. The coding sequence of the protein named AmBgl1-LP was cloned in the plasmid pET-28a and produced an enzyme which has a molecular mass of 53,7 kDa. The enzymatic assays showed that the enzyme was active with an optimum pH of 5.5, optimum temperature of 35 °C and had a Ki for glucose of 23 mM. The enzyme does not apparently perform transgycosylation, according to the assays for pNPβGlu substrate. Supposedly, AmBgl1-LP suffers inhibition by pNPβGlu on concentrations higher than 10 mM. The enzyme showed to be capable of hydrolyzing cellobiose, pNPβGal and pNPβFuc. Thus, the enzyme is promising for use in cocktails for degradation of biomass. / A metagenômica permite estudar diretamente o material genético presente em uma amostra ambiental e quando aliada à bioinformática possibilita explorar o papel de novos genes e proteínas. A constante diminuição na quantidade de combustíveis fósseis e seus efeitos na economia global e no meio ambiente têm acelerado as pesquisas sobre combustíveis alternativos como, por exemplo, o etanol de segunda geração, o qual pode ser obtido a partir de biomassa vegetal. No entanto, o processo necessita que o material lignocelulolítico seja hidrolisado previamente por enzimas, para o fornecimento de açúcares fermentescíveis. As β-glicosidases são enzimas que participam da etapa final de degradação de celulose em glicose e são, portanto, consideradas passo limitante no processo. Muitas β-glicosidases já foram descritas, entretanto ainda há o interesse em encontrar enzimas que sejam resistentes à inibição por glicose e que exerçam sua atividade em temperaturas mais baixas. Neste sentido, o presente trabalho tratou da busca por β-glicosidases da família GH1 utilizando sequências obtidas a partir de um estudo metagenômico de rios e lagos da Amazônia, realizado em nosso laboratório. Foram encontradas 3 fases abertas de leitura (ORFs) correspondentes à esta classe de enzimas e uma delas foi selecionada para ser produzida em E.coli de forma recombinante e ser caracterizada bioquimicamente. A sequência que codifica a proteína denominada AmBgl1-LP foi clonada em vetor pET-28a e expressa em E.coli, rendendo uma enzima com massa molecular de 53,7 kDa. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que a enzima é ativa em pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 35 °C. Além disso, a enzima possui um Ki para glicose de 23 mM. A enzima aparentemente não realiza transglicosilação, frente aos ensaios com o substrato pNPβGli. Aparentemente a enzima sofre inibição por este substrato em concentrações maiores que 10 mM. A AmBgl1-LP mostrou-se capaz de hidrolisar celobiose, além de pNPβGal e pNPβFuc. Desta forma, a enzima mostra-se promissora para utilização em coquetéis para degradação de biomassa.