Zugl.: Cleveland, Case Western Reserve Univ., Diss., 2007

Univ., Diss.--Regensburg, 1996.

Tübingen, Univ., Diss., 2003.

Hohenheim, Univ., Diss., 2006.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Zugl.: München, Techn. Universiẗat, Diss., 2009.

München, Techn. Univ., Diss., 2005.

In der Immunantwort sind CD8+ T-Zellen von entscheidender Bedeutung für die spezifische zelluläre Abwehr von intrazellulären Erregern oder Neoplasien. Erst in den vergangenen Jahren konnten CD8+ T-Zellen im Rahmen der adoptiven Immuntherapie oder als CAR-T-Zellen, therapeutisch genutzt werden, wodurch sich für bestimmte hämatologische Erkrankungen komplett neue Therapiemöglichkeiten ergaben. Ein entscheidender Faktor für den Erfolg dieser Therapien ist, dass CD8+ T-Zellen während der ex-vivo Expansion keine terminale Differenzierung durchlaufen, sondern den Phänotyp von gering differenzierten T-memory-Zellen behalten. In den letzten 20 Jahren hat sich das Wissen über den dynamischen Stoffwechsel von CD8+ T-Zellen enorm erweitert. Es wurde deutlich, dass einerseits der Aktivierungszustand und äußere Einflüsse wie Zytokine, Mikromilieu und Nährstoffangebot den Stoffwechsel der Zelle steuern, andererseits der Stoffwechsel der Zelle selbst ihre Differenzierung und Funktion beeinflusst. Im Mausmodell konnte durch die Zugabe des Glykolyseinhibitors 2-DG während der ex-vivo Expansion ein positiver Einfluss auf die Differenzierung von CD8+ T-Zellen erreicht werden. Die mit 2-DG kultivierten Zellen zeigten einen gering differenzierten T-memory-Phänotyp, der nach Transfer zu einer verstärkten Re-Expansion und verbesserter anti-Tumor-Aktivität führte. In der hier vorliegenden Arbeit wird dieser Ansatz bei humanen CD8+ T-Zellen überprüft und auf ein antigenspezifisches Modell des Primings und der Expansion übertragen. Im ersten Teil der Arbeit wurden humane, naive CD8+ T-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von 2-DG unspezifisch aktiviert und expandiert. Es zeigte sich ein dosisabhängiger Effekt der Blockade des Glukosestoffwechsels auf den Metabolismus, die Aktivierung, Differenzierung und Proliferation der Zellen. Die publizierten, an Mauszellen gewonnenen Erkenntnisse zur Wirkung von 2-DG konnten, mit geringen quantitativen Unterschieden, insgesamt bestätigt werden. Im zweiten Schritt wurde der Ansatz auf ein Modell des antigenspezifischen Primings und der Expansion von CD8+ T-Zellen durch peptid-beladene dendritische Zellen übertragen. Im Unterschied zur unspezifischen Expansion führte bereits eine geringe Blockade der Glukosenutzung, in der frühen Expansionshase bis zu 4 Tage nach dem Priming, zu einer ausgeprägten Hemmung der antigenspezifischen Expansion. Die Hauptursache hierfür ist die um ein Vielfaches stärkere Proliferation bei der antigenspezifischen Expansion. Diese ist, aufgrund der geringen Frequenz antigenspezifischer Zellen in der Ausgangspopulation naiver CD8+ T-Zellen, erforderlich und entspricht in ihrem Ausmaß eher der antigenspezifischen Proliferation in-vivo. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die antigenspezifische Proliferation vor allem in der frühen Expansionsphase und weniger während des Primings oder der späten Expansion stark auf die Glukosenutzung angewiesen ist. Auch eine nur vorübergehende Einschränkung der Glukosenutzung in diesem Zeitraum führte zu einer anhaltenden Verminderung der Proliferation. Der Zusatz von 2-DG resultierte zwar in einem höheren Anteil von CD8+ T-Zellen mit einem gering differenzierten Phänotyp, jedoch war ihre absolute Anzahl geringer. Es zeigte sich, dass antigenspezifische Proliferation und Differenzierung in den durchgeführten Versuchen gekoppelt waren. Durch eine Blockade des Glukosestoffwechsels mit 2-DG konnte diese Koppelung nicht aufgehoben werden. Eine wahrscheinliche mechanistische Erklärung hierfür, die jedoch für die antigenspezifische Expansion von CD8+ T-Zellen noch experimentell bestätigt werden müsste, ergibt sich aus dem zellulären Regelkreis von AMPK und mTOR. Dieser integriert in CD8+ T-Zellen die metabolische Situation der Zelle auf der einen Seite und Stimuli zur Zellteilung und -differenzierung auf der anderen Seite. Die genannten Ergebnisse führten zu der Schlussfolgerung, dass bei der Kultivierung von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen für die Immuntherapie der Zusatz von 2-DG keine Verbesserung darstellt. Die vorliegende Arbeit unterstreicht auch, dass Erkenntnisse aus Versuchen mit unspezifisch stimulierten T-Zellen sich nicht ohne Weiteres auf Modelle der antigenspezifischen Expansion oder die Immunantwort in- vivo übertragen lassen. In einem klinischen Nebenprojekt konnte gezeigt werden, dass bei einem Patienten mit Multiplem Myelom unter Therapie mit einem bi-spezifischen, T-Zell rekrutierenden Antikörper gegen BCMA bei Progress der Erkrankung ein homozygoter Verlust des kodierenden Gens aufgetreten war. Damit wurde erstmals für diese Therapie eine homozygote Deletion mit nachfolgendem Verlust der Zielstruktur des Antikörpers als Resistenzmechanismus beschrieben. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch bei Patient:innen mit Multiplem Myelom, die noch keine T-Zell basierte Immuntherapie erhalten haben, häufig heterozygote Veränderungen in Genen vorliegen, die für Zielantigene von Immuntherapien kodieren. Dies macht den Verlust beider Allele wahrscheinlicher und kann somit eine Prädisposition für die Entwicklung einer Therapieresistenz darstellen. / Within the immune response CD8+ T cells are crucial for the specific cellular defence against intracellular pathogens or cancer. But only in the last years, they could be used therapeutically for adoptive immunotherapy or for CAR T cell therapy. As a result, completely new therapeutic options have opened up for certain haematological cancers. A decisive factor for the success of these therapies is that CD8+ T cells do not undergo terminal differentiation during ex-vivo expansion but instead retain the phenotype of minimally differentiated T memory cells. In the past 20 years, knowledge on the dynamic metabolism of CD8+ T cells has expanded enormously. It has become clear that, on the one hand, the activation state and external influences such as cytokines, microenvironment and nutrient supply control the metabolism of the cell and, on the other hand, the metabolism of the cell itself influences its differentiation and function. In mouse models the addition of 2-DG- an inhibitor of glycolysis- during ex-vivo expansion had a positive impact on differentiation of CD8+ T cells. Those cells, that had been cultured with 2-DG showed a less differentiated T-memory phenotype, resulting in increased re-expansion and improved anti-tumour activity upon transfer. In the present work this approach is tested in human CD8+ T cells and subsequently transferred to an antigen-specific model of priming and expansion. In the first part naïve, human CD8+ T cells were non-specifically activated and cultured with different concentrations of 2-DG. This mode of blocking the glucose metabolism had dose-dependent effects on metabolism, activation, differentiation and proliferation. The aforementioned findings on the effect of 2-DG obtained on mouse cells could be confirmed with small quantitative differences. In the second part this approach was transferred to a model of antigen-specific priming of CD8+ T cells using activated and peptide-loaded dendritic cells. In contrast to non-specific expansion, even a slight blockade of glucose utilization, during the early expansion phase up to 4 days after priming, led to a pronounced inhibition of expansion. This can mainly be attributed to the many times stronger proliferation that occurs during antigen-specific expansion. The strong proliferation is necessary because of the low frequency of antigen specific cells among the starting population of naïve CD8+ T cells. In addition, this increased rate of proliferation corresponds more closely to antigen-specific expansion in-vivo. Furthermore, it became clear that antigen-specific proliferation is highly dependent on glucose utilization, especially in the early expansion phase and less so during priming or late expansion. Even a temporary limitation of glucose utilization during this period resulted in a sustained impairment of proliferation. In the experiments it became clear that in antigen-specific expansion, proliferation and differentiation are linked. Although the addition of 2-DG resulted in a higher proportion of CD8+ T cells with a minimally differentiated phenotype, the absolute number of these cells was lower than in the control group. Thus, blocking glucose metabolism does not uncouple antigen-specific proliferation and differentiation. A probable mechanistic explanation for this observation, which would still have to be experimentally confirmed for the antigen-specific expansion of CD8+ T cells, can be found in the cellular control loop of the proteins AMPK and mTOR. In CD8+ T cells they integrate the metabolic state on the one hand and stimuli for cell division and differentiation on the other. These results led to the conclusion, that adding 2-DG is not beneficial in the expansion of antigen-specific CD8+ T cells for immunotherapy. In addition, the present works emphasizes that results, obtained from experiments with non-specifically activated t-cells, do not necessarily apply to models of antigen-specific expansion or the immune response in-vivo. In a clinical side project, it was shown in a patient with multiple myeloma treated with a bi-specific, T cell-engaging antibody against BCMA that a homozygous loss of the coding gene occurred during disease progression. This is the first time that a homozygous deletion with subsequent loss of the antibody's target structure has been described as a resistance mechanism for this therapy. It was also shown that patients with multiple myeloma often have heterozygous alterations in genes that code for target structures of immunotherapies, even before T cell engaging therapies. This makes loss of both alleles more likely and can therefore represent a predisposition to future treatment resistance.

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung einer Kopienzahlvariante (CNV) im Erbgut, die zu einer genomischen Duplikation des SLC2A3-Gens führt. Die Auswirkungen der SLC2A3- Duplikation wurden im Zellkulturmodell und durch bildgebende Verfahren untersucht. Für die SLC2A3-Duplikation konnte eine populationsspezifische Assoziation mit ADHS gezeigt werden (Merker et al. 2017). SLC2A3 kodiert für den neuronalen Glukosetransporter GLUT3, der u.a. Prozesse der Neurotransmitterfreisetzung und Synaptogenese vermittelt und daher wichtig für die Hirnreifung ist. Mögliche Endpunkte für Endophänotypen, die auf einem alterierten Glukosemetabolismus basieren, sind dysfunktionale Hungerregulationsmechanismen ebenso wie eine veränderte neurale Reaktivität gegenüber emotionalen Stimuli und Belohnungsreizen. In zwei peripheren Zellmodellen konnte gezeigt werden, dass die SLC2A3-Duplikation Gen-Dosis-abhängig zu einer Steigerung der basalen SLC2A3-mRNA Expression führt. Ein Expressionsunterschied auf Proteinebene konnte jedoch nicht gefunden werden. Metabolischer Zellstress durch Aushungern der Zellkulturen und eine niedrige Glukosekonzentration im Zellkulturmedium führten zu einer signifikanten Erhöhung des schon unter basalen Bedingungen vorhandenen SLC2A3-Expressionsunterschiedes zwischen Duplikations- und Kontrollzelllinien. Dies deutet darauf hin, dass die SLC2A3-Duplikation bei verminderter zellulärer Energiezufuhr zu einer Überkompensation der Glukoseaufnahme führt. In einer fMRT-Untersuchung wurden erwachsene ADHS-Patienten mit SLC2A3- Duplikation mit ADHS-Patienten und gesunden Kontrollen mit jeweils 2 Genkopien hinsichtlich ereigniskorrelierter neuraler Aktivität als Antwort auf emotionale Stimuli und Essensreize verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die SLC2A3-Duplikation zu einer veränderten Reaktivität gegenüber hochkalorischen Essensreizen führt, was sich in einem durch maschinelles Lernen identifizierten multivariaten neuralen Antwortmuster und einer relativen Unterschätzung des Kaloriengehaltes hochkalorischer Nahrung zeigt. Bei der univariaten Gesamthirn-Analyse der Bilddaten wurden keine signifikanten Gruppenunterschiede gefunden, was darauf hinweist, dass unter den gewählten Versuchsbedingungen keine fokal umschriebenen Gruppenunterschiede der Hirnaktivierung bestehen. Diese Arbeit zeigt, dass die SLC2A3-Duplikation zu einer Erhöhung der SLC2A3- Genexpression mit bisher unbekannten Auswirkungen auf nachgeschaltete Stoffwechselwege und zu einem komplex veränderten neuralen Antwortmuster führt, das durch einen linearen Zusammenhang nicht zu beschreiben ist. Weitere Untersuchungen auf Zellebene und eine Erweiterung der bildgebenden Verfahren könnten zu einer besseren Einordnung der SLC2A3- Duplikation bezüglich ihres Anteils an der endophänotypischen Varianz der ADHS führen. / This thesis is dedicated to the investigation of a genomic copy number variant (CNV) which leads to a duplication of the SLC2A3 gene. The effects of the SLC2A3 duplication were examined in cell culture models and by imaging genetics. The SLC2A3 duplication is associated with ADHD on a population level (Merker et al. 2017). SLC2A3 encodes the neuronal glucose transporter GLUT3 which mediates processes of neurotransmitter release and synaptogenesis and therefore is crucial for brain development. Dysfunctional mechanisms of hunger regulation and an altered neural reactivity towards emotional and reward associated stimuli are possible endophenotypic end points based on an altered glucose metabolism. In two peripheral cell models the SLC2A3 duplication could be shown to lead to a significant increase in basal SLC2A3 mRNA expression levels. On protein level, however, the expression did not differ. Metabolic cell stress induced by cell starving and low glucose concentrations in cell culture media led to a significant increase of SLC2A3 expression differences between duplication and control cell lines. It was concluded that in states of decreased cellular energy supply the SLC2A3 duplication triggers an overcompensation of glucose uptake. Adult ADHD patients with SLC2A3 duplication were compared to ADHD patients and healthy controls each with 2 gene copies of SLC2A3 by means of fMRI regarding event related neural activity towards emotional stimuli and food cues. It could be shown, that the SLC2A3 duplication leads to an altered reactivity towards high caloric food cues which was indicated by a multivariate neural response pattern and relative underestimation of calories of high caloric food. The whole brain univariate standard analysis showed no significant group differences. Therefore, it was concluded that under the experimental conditions the SLC2A3 duplication does not induce alterations in focal brain activity. This work shows that the SLC2A3 duplication is associated with an increase in SLC2A3 gene expression with so far unknown consequences on downstream metabolic pathways. Furthermore the SLC2A3 duplication leads to a complex change in neural response that can not be described by a linear association. Further investigation on cellular level and extension of the imaging studies might elucidate the contribution of the SLC2A3 duplication to the endophenotypic variance in ADHD.

Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2008