Les microorganismes ont développé une résistance accrue aux antibiotiques. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) bactériennes sont essentielles pour la biosynthèse des protéines, car elles permettent de jumeler les acides aminés à leurs ARNt complémentaires. L’inhibition des aminoacyl-ARNt synthétases, telle que la glutamyl- ARNt synthétase (GluRS) dans cette étude, a été identifiée comme une stratégie valable dans la quête de nouveaux antibiotiques. Ainsi, afin de développer un antibiotique efficace et sans toxicité pour l’humain, l’écart évolutif entre les GluRS bactériennes et humaines orthologues a été évalué. Le design rationnel de nouveaux inhibiteurs pour une protéine spécifique se base sur plusieurs critères : les caractéristiques structurales du site actif, l’analogie avec des molécules reconnues pour interagir avec le site actif, le niveau de difficulté lors de la synthèse, conformité aux critères de similitudes aux drogues actives existantes, etc... La caractérisation du site actif permet d’identifier les acides aminés qui interagissent avec les inhibiteurs connus, ainsi que ceux qui pourraient potentiellement participer aux interactions avec un nouvel inhibiteur. Cette étape préliminaire permet déjà d’identifier les caractéristiques principales qui seront vitales pour le design de nouveaux inhibiteurs efficaces chez les enzymes bactériennes et inefficaces chez les enzymes orthologues humaines. Une nouvelle série d’inhibiteurs potentiels a donc été établie et testée in silico à l’aide de l’arrimage moléculaire. Cette approche computationnelle permet de prédire comment les molécules vont s’assembler, ainsi que d’identifier les facteurs qui déterminent la spécificité de l’interaction. Les avantages de cette approche sont multiples. Entre autres, une grande rapidité d’exécution et une faible ressource informatique permettent d’effectuer un criblage à haut débit de banques virtuelles de molécules. Les meilleurs candidats provenant du design rationel et aussi d’un criblage virtuel de plus de 48000 composés sont présentés.

Les aminoacyl-ARNt synthetases (aaRS) sont des enzymes clés dans le mécanisme de biosynthèse des protéines. Chacun des membres de cette famille d'enzymes reconnaît et lie les éléments d'identités propres à chaque acide ribonucléique de transfert (ARNt) permettant ainsi leur aminoacylation par un acide aminé spécifique. Une fois l'ARNt correctement chargé, celui-ci peut lier un facteur protéique (EF-Tu pour les aminoacyl-ARNt élongateurs) qui le conduit au ribosome pour la biosynthèse des protéines. Plus particulièrement la glutamyl-ARNt synthetase (GluRS) d'Escherichia coli est une protéine capable d'estérifier l'ARNtGIU par un résidu glutamate. Cette enzyme monomérique est subdivisée en 5 domaines structuraux, chacun capable de lier une portion de l'ARNt qui lui est propre. La région formant la boucle d'anticodon de l'ARNtG'u est reconnue par les domaines 4 et 5 séparés par une charnière, et situés en C-terminal de l'enzyme. L'étude d'une GluRS tronquée, délétée de son domaine 5, a montré l'importance de ce domaine sur l'activité catalytique de cette enzyme. Afin de comprendre les mécanismes mis en place entre ces deux derniers domaines lors de la liaison du substrat ARNtGly, des variants protéiques visant à altérer les interactions existant entre les domaines 4 et 5 et la charnière ont été synthétisés, et leur constantes catalytiques mesurées. L'étude du simple variant, substitué au niveau du second résidu chargé de la charnière de la GluRS de E. coli a montré l'importance de ce dernier dans les interactions mises en place entre le domaine 5 et la charnière. Par ailleurs l'altération des constantes cinétiques (en comparaison avec les valeurs trouvées pour l'enzyme sauvage), de double et triple variants, substitués au niveau des résidus chargés trouvés sur la charnière séparant les domaines 4 et 5, ont révélé l'importance de certain de ces résidus dans les interactions existant entre ces deux domaines.

L'enzyme glutamyl-queuosine-ARNt synthétase, présente chez plusieurs bactéries et codée par le gène yadB chez Escherichia coli, catalyse la formation de glutamylqueuosine- ARNtAsp. Le rôle de cet aminoacyl-ARNt est inconnu, mais la cotranscription de yadB et de dksA suggère une implication dans la réponse générale au stress. yadB a été remplacé dans une souche de Escherichia coli [delta]lac par lacZ, sans modification des éventuels éléments transcriptionnels de yadB. L'activité [béta]-galactosidase a été utilisée comme rapporteur pour déterminer le niveau d'expression de yadB dans diverses conditions de croissance et de stress. Les différences phénotypiques entre les souches sauvage et [delta]yadB ont été investiguées. Nous avons découvert que yadB est un gène non-essentiel chez Escherichia coli. Sa faible expression suggère un rôle dans le métabolisme basal de la cellule. Cette expression est sensiblement plus élevée pendant la phase stationnaire de croissance. Aucune différence phénotypique n'a été découverte entre les souches sauvage et [delta]yadB.

L'enzyme étudiée est la glutamyl-ARNt synthetase (GluRS) de la bactérie Escherichia coli. Son activité consiste principalement à charger l'acide glutamique sur l'ARNtGlu. Cette GluRS se compose de 5 domaines structuraux, dont les deux derniers (#4 et 5) situés dans la partie C-terminale ont été acquis durant l'évolution et sont responsables de la reconnaissance de la boucle de l'anticodon de l'ARNtGlu. Le domaine 4 est lié au domaine 5 par une charnière mobile (4-5) permettant à ce dernier de s'incliner et de s'adapter à l'anticodon de l'ARNtGlu (Nureki et al., 1995). Cette GluRS bactérienne, qui joue un rôle essentiel dans la biosynthèse des protéines, est considérée comme une nouvelle cible de l'antibiothérapie grâce à l'existence d'analogues du glutamyl-AMP qui inhibent plus des GluRS bactériennes que la GluRS cytopiasmique des mammifères (Balg et al., 2007). La première partie de ce projet consiste à étudier le rôle de la charnière 4-5 sur l'activité de la GluRS en produisant par mutagenèse dirigée du gène gltX de E. coli des variants E366A, E455R et D333A, altérés dans les résidus qui pourraient influencer les orientations relatives des domaines 4 et 5. Les propriétés cinétiques de ces variants dans la réaction de formation du glutamyl-ARNt montrent qu'il n'y a pas d'effet majeur de ces substitutions sur les Km sauf pour D333A. La constante de spécificité de l'enzyme sauvage reste plus grande que celle des variants ce qui suggère que la flexibilité de la charnière n'est pas grandement affectée par la substitution d'un seul de ces résidus. Accidentellement, un variant double charnière (#dc) a été obtenu dont le Km pour l'ARNtGlu est 7,7 fois plus grand que celui de la GluRS sauvage, et dont la constante de spécificité est 15 fois plus faible. Ce résultat suggère que la longueur de la charnière a peut-être autant d'influence que la nature de ces résidus pour le bon fonctionnement de la GluRS. La deuxième étape du projet est de tester l'hypothèse selon laquelle la flexibilité de la charnière 4-5 de la GluRS est importante pour l'activité catalytique de cette enzyme. Des formes tronquées de ces variants ne contenant que les 2 derniers domaines 4 et 5 ont été surproduites et purifiées pour la mesure de la flexibilité de la charnière 4-5 par résonance magnétique nucléaire (RMN). Une analyse préliminaire de la GluRS tronquée sauvage par RMN a montré qu'elle est bien repliée. Notre étude structure-fonction de la charnière 4-5 facilitera le design rationnel de nouveaux inhibiteurs plus efficaces de la GluRS. Ceux-ci pourraient être des composés de départ (« lead compounds ») pour la conception d'un nouvel antibiotique.

Le but visé par la présente recherche est de faire la synthèse d'inhibiteurs de la glutaminyl (GlnRS), de la glutamyl (GluRS) et de l'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS). Le design des inhibiteurs est basé sur l'intermédiaire de la réaction catalysée par les aaRSs, l'adénylate d'aminoacyle. Cet anhydride mixte (carboxylique-phosphorique), hautement instable, est plus fortement lié à l'enzyme que ne le sont ses trois substrats: l'acide aminé, l'ARNt et l'ATP. Différents analogues stables de cet intermédiaire ont été synthétisés dans le but d'empêcher la substitution de l'AMP de l'adénylate d'aminoacyle par l'ARNt. Ainsi, des adénylates d'aminoalkyles, des aminoacylsulfamoyladénosines et des aminoacylphosphonates adénosines ont été synthétisés. Ces composés ont permis d'inhiber l'enzyme correspondante avec des K\ variant du micromolaire au nanomolaire. Ces inhibiteurs ont été utilisés dans des études de cinétiques enzymatiques, en cristallisation et dans la compréhension du mécanisme catalytique de ces enzymes. Les travaux en cours portent sur la rigidification de même que sur la diminution de la polarité de l'adénylate de glutamyle et ce, par la modification de la portion acide glutamique des inhibiteurs déjà synthétisés. La résistance aux antibiotiques constitue un problème très grave de nos jours. Le développement d'antibiotiques possédant de nouveaux modes d'action est au coeur des préoccupations actuelles. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs) sont des enzymes impliquées dans la biosynthèse des protéines. Elles catalysent l'estérification d'un acide aminé sur l'acide ribonucléique de transfert (ARNt). Leur inhibition entraîne, par conséquent, l'arrêt de la croissance cellulaire. Les enzymes humaines ont connu une évolution suffisamment divergente des aaRSs bactériennes rendant ainsi possible l'inhibition sélective de ces dernières. Elles représentent donc des cibles intéressantes pour le développement d'antibiotiques. L'acide pseudomonique, un inhibiteur de l'isoleucyl-ARNt synthétase, possède des propriétés antibiotiques. Il est commercialisé comme antibiotique topique par la compagnie pharmaceutique GlaxoSmithKline.

La traduction implique l’utilisation d’aminoacyl-ARNt produits par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). Il devrait exister 20 aaRS, une spécifique de chaque acide aminé. Or, les données actuelles montrent qu’une grande majorité des organismes ne possèdent pas l’asparaginyl- (AsnRS) et/ou la glutaminyl-ARNt synthétase (GlnRS). Ils ne peuvent synthétiser l’Asn-ARNtAsn et le Gln-ARNtGln que par l’utilisation de voies impliquant la formation préalable d’aspartyl-ARNtAsn et/ou de glutamyl-ARNtGln. Ces précurseurs « mésacylés » sont synthétisés par une aspartyl-ARNt synthétase et/ou une glutamyl-ARNt synthétase non-discriminantes (AspRS-ND ou GluRS-ND). Ils sont ensuite amidés par une amidotransférase (AdT), pour fournir à la cellule l’Asn-ARNtAsn et/ou le Gln-ARNtGln nécessaires à la traduction des codons Asn et Gln.Ce travail de thèse, effectué dans le contexte biologique de deux organismes différents, Thermus thermophilus et Helicobacter pylori, a permis de montrer que les étapes enzymatiques – formation du précurseur, et amidation par l’AdT – sont réalisées au sein de complexes ribonucléoprotéiques, réunissant l’aaRS-ND, l’ARNtAsn ou l’ARNtGln, et l’AdT : l’Asn-transamidosome ou le Gln-transamidosome. Selon leur origine ou la voie à laquelle ils appartiennent (asparaginylation ou glutaminylation), ces complexes possèdent des particularités mécanistiques et structurales très différentes, mais sont tous adaptés pour éviter la libération des intermédiaires mésacylés toxiques par des stratégies spécifiques. Ce travail permet de mieux comprendre les mécanismes évolutifs qui ont conduit à l’incorporation de l’Asn et de la Gln dans le code génétique. / Protein synthesis requires the biosynthesis of aminoacyl-tRNAs by aminoacyl-tRNA synthétases (aaRS). Since 20 amino acids are présent within the genetic code, 20 aaRS should be used by a single organism. However, the vast majority of organisms found today are deprived of asparaginyl- and/or glutaminyl-tRNA synthetases (Asn- or GlnRS). They can only synthesize Asn-tRNAAsn and/or Gln-tRNAGln through biosynthesis pathways involving the preliminary formation of aspartyl-tRNAAsn and /or glutamyl-tRNAGln. Those « misacylated » precursors are synthesized by so called non-discriminating aspartyl- or glutamyl-tRNA synthetases (ND-AspRS or –GluRS). Then, they are transferred to an amidotransferase (AdT) to provide the Asn-tRNAAsn and/or Gln-tRNAGln species (necessary to fuel protein synthesis) through amidation.This work was performed in the context of two organisms – Thermus thermophilus and Helicobacter pylori. It showed that the two enzymatic steps of asparaginylation and glutaminylation – biosynthesis of the misacylated precursor and amidation by AdT – are carried out within a single ribonucleoprotein complex, namely the (Asn- or Gln-) transamidosome, gathering the ND-aaRS necessary for the misacylation, the tRNA substrate (Asn or Gln) and the AdT. According to their origin or the pathway they originate from (asparaginylation or glutaminylation), those complexes display significant mechanistical and structural peculiarities, but they are all adapted to prevent libération of the toxic misacylated species through specific strategies. This work shed new light on the évolutive mechanisms that led to the incorporation of Asn or Gln into the genetic code.