Ethanol is a widely used drug, yet an understanding of its sites and mechanisms of action remains incomplete. Among the protein targets of ethanol are glycine receptors (GlyRs). In addition to ethanol, zinc also modulates GlyR function. Although the individual effects of zinc and alcohols on GlyR function have been well studied, the combined effects of these agents have not been thoroughly examined. This project investigated the effects of zinc on alcohol action at the glycine receptor (GlyR). In Aim 1, the effects of zinc on ethanol modulation of GlyR function were tested and characterized in three GlyR [alpha] subunits ([alpha]1-3). Aim 2 explored a site of action for the augmenting effects of zinc on ethanol action at the GlyR. Mutant D80A GlyRs, which lack a zinc binding site (D80), were constructed and allowed us determine if this zinc binding site is important for the zinc/ethanol interactions that were observed in Aim 1. The effects of ethanol were reduced in mutant D80A GlyRs compared to wild type (WT). In addition, manipulating zinc levels in our buffers either by adding or chelating zinc did not change the magnitude of ethanol enhancement of mutant D80A GlyRs as it did in WT GlyRs suggesting that the D80 position is important for zinc modulation of ethanol action. Finally, Aim 3 extended the findings from Aims 1 and 2 by evaluating the effects of a GlyR point-mutation on alcohol consumption and other behavioral tests in mice. Glra1(D80A) knock-in mice provided an animal model for behavioral studies of zinc/ethanol interactions at the GlyR and showed decreased alcohol consumption and preference compared to their WT littermates. In addition, D80A KI mice had increased startle responses compared to their WT littermates. Other behavioral tests were also conducted including tests of ethanol motor incoordination and strychnine induced convulsions; there were no differences detected between KI and WT mice in these assays. Overall, our findings demonstrate that zinc is critical in determining the effects of ethanol at GlyRs and suggest that zinc signaling at the D80 position may be important for mediating the behavioral effects of ethanol action at GlyRs. / text

Une réduction de l'inhibition segmentaire contribue vraisemblablement à l'hypersensibilité douloureuse persistante – qui se manifeste par l'hyperalgie, l'allodynie, et la douleur spontanée – au cours d'états douloureux chroniques. L'association fréquente d'une allodynie avec la migraine – une céphalée épisodique – suggère qu'une perte de l'inhibition synaptique contribue aussi à la manifestation de la douleur migraineuse. Cependant, la grande prévalence de la migraine – plus de 10% de la population générale – soulève la question de savoir si le traitement des informations méningées par le réseau neuronal – associant interneurones excitateurs et inhibiteurs – dans le complexe trigéminal, premier relais sur les voies nociceptives de la face et des méninges, est le même que celui des autres informations, par exemple cutanées. Nous avons caractérisé l'effet du blocage pharmacologique des récepteurs à la glycine (GlyR) et des récepteurs GABAA (GABAAR) sur la transmission synaptique entre fibres afférentes primaires, cutanées ou méningées, et neurones de second ordre en enregistrant des potentiels de champ dans le sous-noyau caudal superficiel (Sp5C). Une stimulation électrique transcutanée évoque trois potentiels de champ négatifs dus à l'activation, du plus précoce au plus tardif, de fibres afférentes primaires de type Aβ, Aδ et C. Bloquer les GlyRs et/ou GABAARs segmentaires facilite les potentiels de champ polysynaptiques excitateurs évoqués par l'activation des fibres afférentes primaires de type A et, au contraire, inhibe, ou même abolit, les potentiels de champ C. Bloquer les récepteurs GABAB (GABABR) segmentaires prévient cette suppression. Il est intéressant de noter que bloquer les GABABRs, potentialise aussi les potentiels de champ C en condition controle. Une stimulation électrique méningée évoque deux potentiels de champ négatifs dus à l'activation, du plus précoce au plus tardif, des fibres afférentes primaires de type Aδ et C. Au contraire du potentiel de champ C cutané, le potentiel de champ C méningé est potentialisé après blocage des GlyRs et/ou GABAARs segmentaires. Ces résultats démontrent que le traitement des informations cutanées et méningées par le Sp5C est différent. Seule l'activation des fibres afférentes primaires cutanées de type A inhibe les inputs cutanés de type C vers le Sp5C par l'intermédiaire d'un circuit polysynaptique excitateur, d'interneurones GABAergiques de dernier ordre et de GABABRs présynaptiques. La théorie du "gate control" postule que l'activité des afférences non-nociceptives ferme la porte à la transmission des inputs nociceptifs vers les centres supérieurs. Nos résultats suggèrent que l'état de la porte dépend de l'activité non seulement dans les fibres afférentes primaires de type A mais aussi dans les circuits polysynaptiques excitateurs de la corne dorsale. / Pathological disruption of segmental inhibition is thought to contribute to persistent pain hypersensitivity – including hyperalgesia, allodynia and spontaneous pain – that occurs during chronic pain states. That allodynia is also often associated with migraine – an episodic headache – suggests that a loss of synaptic inhibition is also involved in the manifestation of headache pain. However, the very high prevalence of migraine – more than 10% of the general population – raises the question as to whether processing of meningeous inputs by local neuronal network – consisting of excitatory and inhibitory interneurons – within the trigeminal nucleus, the first relay station for incoming nociceptive signals of the face and meninges, is the same as that of others, for instance cutaneous. We sought to characterize how pharmacological blockade of glycine and GABAA receptors modifies synaptic transmission between either cutaneous or meningeous primary afferent fibers and second order neurons by recording field potentials in the rat superficial medullary dorsal horn (MDH). Transcutaneous electrical stimulation evokes three negative field potentials elicited by, from the earliest to the latest, Aβ-, Aδ- and C-fiber primary afferents. Blocking segmental glycine and/or GABAA receptors strongly facilitates A-fiber-activated polysynaptic excitatory field potentials but, conversely, inhibits, or even abolishes, C-fiber field potentials. Blocking segmental GABAB receptors reverses such suppression. Interestingly, it also potentiates C-fiber field potentials under control conditions. Meningeous electrical stimulation evokes two negative field potentials elicited by, from the earliest to the latest, Aδ- and C-fiber primary afferents. Unlike cutaneous C-fiber field potentials, meningeous ones are facilitated by blocking segmental glycine and/or GABAA receptors. These results demonstrate that MDH processing of cutaneous and meningeous inputs are different. Only activation of cutaneous A-fiber primary afferents inhibits cutaneous C-fiber inputs to the MDH by the way of polysynaptic excitatory pathways, last-order GABAergic interneurons and presynaptic GABAB receptors. In view of the gate control theory postulating that afferent volleys in non-nociceptive afferents close the gate to central transmission of nociceptive inputs, our results suggest that the state of the gate depends on firing activities of both A-fiber primary afferents and polysynaptic excitatory circuits, i.e. the inhibitory tone, within the dorsal horn.

Le récepteur à la glycine est un récepteur neuronal qui appartient à la famille des canaux ligand-dépendants «cys-loop». Avec le récepteur ionotrope GABA ils fournissent la neurotransmission inhibitrice rapide dans le SNC des vertébrés grâce à leur perméabilité sélective au Cl-. Les récepteurs à la glycine participent à différents processus physiologiques comprenant le contrôle de l'activité motrice, la respiration, la sensation de douleur inflammatoire, la perception des stimuli visuels et auditifs. Le développement de modulateurs efficaces des récepteurs à la glycine permettra un contrôle précis de leur activité, ce qui est particulièrement important dans le cas des pathologies des récepteurs à la glycine, comme l'hyperekplexie. En utilisant l'analyse électrophysiologique, la mutagenèse dirigée et l'expression de protéines spécifiques dans un système hétérologue, nous avons identifié les acides ginkgoliques et niflumiques comme nouveaux modulateurs de récepteurs de la glycine, caractérisé leur action sur différentes sous-unités du récepteur et déterminé les sites importants pour la potentialisation ou l'inhibition des récepteurs à la glycine par ces composés. Cette approche est très prometteuse et ouvre de nouvelles voies vers des futures actions thérapeutiques. / Glycine receptor is a ligand-gated neuronal receptor that possesses an ion pore permeable for Cl- and represents an important component of inhibitory neurotransmission in CNS of vertebrates. Glycine receptors participate in the control of motor activity, respiration, inflammatory pain sensation, perception of visual and auditory stimuli. Development of efficient modulators of glycine receptors will allow a precise control of their activity, which is especially important in the case of glycine receptor pathologies, such as hyperekplexia. In the present work we have identified ginkgolic and niflumic acids as novel modulators of glycine receptors, characterized their action on different subunits of the receptor and determined the most probable sites of interaction of the compounds with glycine receptors.