The HIV-1 envelope glycoprotein trimer (Env) is covered by an extensive array of glycans that shield it from immune surveillance. The high density of glycans on the trimer surface imposes steric constraints that limit the actions of glycan processing enzymes, such that multiple under-processed structures remain on specific locations. These oligomannose-type glycans are recognized by broadly neutralizing antibodies (bNAbs) that are not thwarted by the glycan shield but, perhaps paradoxically, target it. In multiple studies, bNAbs have been shown to be capable of providing passive protection from viral challenge, making Env a focus of antibody-mediated vaccine design. Here, the development of a workflow for the semi-quantitative, site-specific N-glycosylation analysis of a soluble recombinant, native-like trimer mimic (BG505 SOSIP.664) is reported. The resulting data reveal a mosaic of dense clusters on the outer domain of Env and allow mapping the extremes of simplicity and diversity of glycan processing. Although individual sites usually minimally affect the global integrity of the glycan shield, examples are identified of how deleting certain glycans can subtly influence neutralization by bNAbs that bind at distant sites. Env is a trimer of heterodimers of gp120 and gp41, which is generated by cleavage of an endogenous protease. In this thesis, the detailed effect of protease cleavage on glycan processing is examined by comparing the site-specific N-glycosylation profiles of the native-like trimer mimic to the corresponding uncleaved pseudotrimer and the matched gp120 monomer. Trimer-associated glycan remodeling forms a localized subdomain of the native mannose patch. Furthermore, the glycosylation analysis of further Env immunogens – a glycan-depleted trimer and a flexibly-linked, uncleaved trimer (both based on BG505 SOSIP.664) – provides important insights into the robustness of the HIV-1 glycan shield and the Env maturation pathway. Overall, this thesis reveals how structural constraints shape Env glycosylation and the network of bNAb-targeted glycans that should be preserved on recombinant vaccine candidates.

Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância de pesquisa e desenvolvimento em reprodução bovina, especialmente em hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG). Os produtos comerciais à base de eCG comercialmente disponíveis são purificados a partir do sangue de éguas gestantes, apresentando variabilidade de lote para lote e presença de contaminantes. Estes fatos, juntamente com a limitação do material de partida (sangue equino), enfatizam a necessidade de haver um sistema de expressão de eCG recombinante passível de ser explorado comercialmente. Neste quesito, as células de mamíferos se mostram um sistema robusto para tal finalidade, visto que são capazes de adicionar modificações pós-traducionais às cadeias polipeptídicas, tais como a glicosilação, o que é essencial para o correto dobramento, maturação e montagem das duas subunidades, além de interferir diretamente com a meia-vida, o reconhecimento do receptor, a solubilidade e a atividade biológica das proteínas. No entanto, mesmo entre os sistemas de expressão heteróloga em células de mamífero, encontra-se muita variabilidade nos padrões de glicosilação adicionado. No presente trabalho, foi realizado um estudo comparativo através da clonagem e expressão de uma forma fusionada de eCG (reCGβα) em duas linhagens celulares diferentes: (1) CHO-DG44, um dos sistemas de expressão mais utilizados pelas indústrias farmacêuticas, capaz de adicionar N-glicanos complexos; e (2) 293T, uma linhagem humana capaz de produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos complexos e sialilados. Os resultados de atividade biológica (in vitro e in vivo) apontam uma maior atividade de reCG produzido por células CHO-DG44. O perfil de N-glicosilação de reCG produzido pelas células CHOD-G44 assemelhou-se mais à eCG selvagem, quando comparado a reCG produzido por células 293T. Por fim, estudos clínicos foram realizados com reCG produzido em meio livre de soro fetal bovino e parcialmente purificado, onde atividade específica de reCG produzido por células CHO-DG44 mostrou-se similar ao produto comercial selvagem. / Brazil is currently the major beef producer and exporter, rendering to livestock one of the country´s most economically relevant activities. This emphasizes the importance of research and development in bovine reproduction, especially at ovulation-stimulatory hormones, such as equine gonadotropin (eCG). The commercially available eCG-based products are purified from blood of pregnant heifers, presenting batch-to-batch variability and the presence of contaminants. These facts, together with the limitation of the bulk material (equine blood), emphasize the need of an eCG expression system able to be commercially explored. In this aspect, mammalian cells are a robust system, capable of add post-translational modifications to polypeptide chains, such as glycosylation, which is essential for the correct folding, maturation and assembly of both eCG subunits. In addition, glycosylation directly interferes with the protein half-life, receptor recognition, solubility and biological activity. In the present work, a comparative study was carried out by cloning and expressing a fusion form of eCG (reCGβα) in two different mammalian cell lines: (1) CHO-DG44, one of the most used by pharmaceutical companies expression systems, capable of add complex-type N-glycans; and (2) 293T, a human cell line capable of produce glycoproteins carrying complex and sialylated oligosaccharides. The in vitro and in vivo biological activity results show a higher potency of reCG produced by CHO-DG44 cells. The N-glycosylation pattern produced by CHO-DG44 cells was more similar to native eCG in comparison to the N-glycosylation produced by 293T cells. Finally, clinical studies were performed with serum absent media produced and partially purified reCG, showing that the specific activity of reCG produced by CHO cells was similar to the commercial wild type product.

Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância de pesquisa e desenvolvimento em reprodução bovina, especialmente em hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG). Os produtos comerciais à base de eCG comercialmente disponíveis são purificados a partir do sangue de éguas gestantes, apresentando variabilidade de lote para lote e presença de contaminantes. Estes fatos, juntamente com a limitação do material de partida (sangue equino), enfatizam a necessidade de haver um sistema de expressão de eCG recombinante passível de ser explorado comercialmente. Neste quesito, as células de mamíferos se mostram um sistema robusto para tal finalidade, visto que são capazes de adicionar modificações pós-traducionais às cadeias polipeptídicas, tais como a glicosilação, o que é essencial para o correto dobramento, maturação e montagem das duas subunidades, além de interferir diretamente com a meia-vida, o reconhecimento do receptor, a solubilidade e a atividade biológica das proteínas. No entanto, mesmo entre os sistemas de expressão heteróloga em células de mamífero, encontra-se muita variabilidade nos padrões de glicosilação adicionado. No presente trabalho, foi realizado um estudo comparativo através da clonagem e expressão de uma forma fusionada de eCG (reCGβα) em duas linhagens celulares diferentes: (1) CHO-DG44, um dos sistemas de expressão mais utilizados pelas indústrias farmacêuticas, capaz de adicionar N-glicanos complexos; e (2) 293T, uma linhagem humana capaz de produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos complexos e sialilados. Os resultados de atividade biológica (in vitro e in vivo) apontam uma maior atividade de reCG produzido por células CHO-DG44. O perfil de N-glicosilação de reCG produzido pelas células CHOD-G44 assemelhou-se mais à eCG selvagem, quando comparado a reCG produzido por células 293T. Por fim, estudos clínicos foram realizados com reCG produzido em meio livre de soro fetal bovino e parcialmente purificado, onde atividade específica de reCG produzido por células CHO-DG44 mostrou-se similar ao produto comercial selvagem. / Brazil is currently the major beef producer and exporter, rendering to livestock one of the country´s most economically relevant activities. This emphasizes the importance of research and development in bovine reproduction, especially at ovulation-stimulatory hormones, such as equine gonadotropin (eCG). The commercially available eCG-based products are purified from blood of pregnant heifers, presenting batch-to-batch variability and the presence of contaminants. These facts, together with the limitation of the bulk material (equine blood), emphasize the need of an eCG expression system able to be commercially explored. In this aspect, mammalian cells are a robust system, capable of add post-translational modifications to polypeptide chains, such as glycosylation, which is essential for the correct folding, maturation and assembly of both eCG subunits. In addition, glycosylation directly interferes with the protein half-life, receptor recognition, solubility and biological activity. In the present work, a comparative study was carried out by cloning and expressing a fusion form of eCG (reCGβα) in two different mammalian cell lines: (1) CHO-DG44, one of the most used by pharmaceutical companies expression systems, capable of add complex-type N-glycans; and (2) 293T, a human cell line capable of produce glycoproteins carrying complex and sialylated oligosaccharides. The in vitro and in vivo biological activity results show a higher potency of reCG produced by CHO-DG44 cells. The N-glycosylation pattern produced by CHO-DG44 cells was more similar to native eCG in comparison to the N-glycosylation produced by 293T cells. Finally, clinical studies were performed with serum absent media produced and partially purified reCG, showing that the specific activity of reCG produced by CHO cells was similar to the commercial wild type product.