Este trabalho descreve a produção dos FGFs básico bovino e ácido humano (há) em E. coli utilizando o vetor pET. Para expressar o haFGF utilizamos o cDNA nativo com pequenas modificações, obtendo cerca de 40 mg da proteína por litro de cultura induzida. No caso do bbFGF, cerca de 60 pares de bases da extremidade 5 do cDNA nativo foram substituídos por oligonucleotídeos sintéticos contendo condons frequentemente usados em genes bacterianos altamente expressos e apresentando menor conteúdo de C+G do que a sequência nativa. Com este cDNA modificado, obteve-se cerca de 10mg 1-1 de bbFGF. Os FGFs intracelulares solúveis foram purificados a partir do extrato bacteriano por chromatografia de afinidade em Heparina-Sepharose atingindo um grau de pureza da ordem de 95%. O haFGF sozinho é ativo sobre fibroblastos 3T3 em cultura na concentração de ng ml-1; na presença de heparina, a atividade desloca-se para a faixa de pg ml-1. O bbFGF é ativo na concentração de pg ml-1 e sua atividade não é significantemente potenciada pela heparina. O sequenciamento da extremidade N-terminal e a análise de aminoácidos mostraram somente uma forma de haFGF recombinante correspondente à proteína autêntica de 154 aminoácidos. Foram encontradas duas formas de bbFGF recombinante, uma correspondente à proteína autêntica de 154 resíduos e outra contendo 153, onde os dois primeiros foram removidos. / Here we describe the use of the pET expression system to produce the 154 amino acid bovine basic (bb) and human acidic (ha) FGFs. To express haFGF we have used the native cDNA sequencewith minor modifications, obtaining about 40 mg of growth factor per liter of bacterial culture. In the case of bbFGF, about 60 base pairs form the 5-end of the native cDND were replaced with synthetic oligonucleotides containing codons frequently used in highly expressed bacterial genes and having a lower G+C content than the native sequence. By using this modified cDNA about 10 mg 1-1 of bbFGF was obtained. The intracellular, soluble FGFs were partially purified from bacterial extracts by heparin-affinity chromatography and shown to be more than 95% pure. The haFGF alone is active upon 3T3 fibroblasts in culture at the level of ng ml-1 or in the range of pg ml-1 when heparin is added to the incubation medium. The bbFGF is active in the range of pg ml-1 and its activity is not significantly potentiated by heparin. Only one form of recombinant haFGF corresponding to the authentic protein of 154 amino acids was found by N-terminal protein sequencing and amino acid analysis. Two forms of recombinant bbFGF were found, one corresponding to the authentic protein of 154 amino acids (about 75%) and another containing 153 amino acids where the first two residues were removed (about 25%>).

Este trabalho descreve a produção dos FGFs básico bovino e ácido humano (há) em E. coli utilizando o vetor pET. Para expressar o haFGF utilizamos o cDNA nativo com pequenas modificações, obtendo cerca de 40 mg da proteína por litro de cultura induzida. No caso do bbFGF, cerca de 60 pares de bases da extremidade 5 do cDNA nativo foram substituídos por oligonucleotídeos sintéticos contendo condons frequentemente usados em genes bacterianos altamente expressos e apresentando menor conteúdo de C+G do que a sequência nativa. Com este cDNA modificado, obteve-se cerca de 10mg 1-1 de bbFGF. Os FGFs intracelulares solúveis foram purificados a partir do extrato bacteriano por chromatografia de afinidade em Heparina-Sepharose atingindo um grau de pureza da ordem de 95%. O haFGF sozinho é ativo sobre fibroblastos 3T3 em cultura na concentração de ng ml-1; na presença de heparina, a atividade desloca-se para a faixa de pg ml-1. O bbFGF é ativo na concentração de pg ml-1 e sua atividade não é significantemente potenciada pela heparina. O sequenciamento da extremidade N-terminal e a análise de aminoácidos mostraram somente uma forma de haFGF recombinante correspondente à proteína autêntica de 154 aminoácidos. Foram encontradas duas formas de bbFGF recombinante, uma correspondente à proteína autêntica de 154 resíduos e outra contendo 153, onde os dois primeiros foram removidos. / Here we describe the use of the pET expression system to produce the 154 amino acid bovine basic (bb) and human acidic (ha) FGFs. To express haFGF we have used the native cDNA sequencewith minor modifications, obtaining about 40 mg of growth factor per liter of bacterial culture. In the case of bbFGF, about 60 base pairs form the 5-end of the native cDND were replaced with synthetic oligonucleotides containing codons frequently used in highly expressed bacterial genes and having a lower G+C content than the native sequence. By using this modified cDNA about 10 mg 1-1 of bbFGF was obtained. The intracellular, soluble FGFs were partially purified from bacterial extracts by heparin-affinity chromatography and shown to be more than 95% pure. The haFGF alone is active upon 3T3 fibroblasts in culture at the level of ng ml-1 or in the range of pg ml-1 when heparin is added to the incubation medium. The bbFGF is active in the range of pg ml-1 and its activity is not significantly potentiated by heparin. Only one form of recombinant haFGF corresponding to the authentic protein of 154 amino acids was found by N-terminal protein sequencing and amino acid analysis. Two forms of recombinant bbFGF were found, one corresponding to the authentic protein of 154 amino acids (about 75%) and another containing 153 amino acids where the first two residues were removed (about 25%>).

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.

Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKCδ induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKCδ leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKCδ leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.

THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.

As funções fisiológicas da proteína prion (PrPc) estão sob ampla investigação e caracterização, especialmente as funções associadas ao desenvolvimento cerebral. Destaca-se que a associação de PrPc com Stress Inducible Protein 1 (STI1), induz neuritogênese e neuroproteção via proteína cinase extracelular reguladora (ERK) e proteína cinase dependente de AMPc (PKA) respectivamente. O presente estudo avaliou como a expressão de PrP cem astrócitos pode modular a interação neurônioglia e o papel de STI1 como um fator autócrino em astrócitos. PrPc modula a interação neurônio-glia, a produção de fatores tróficos solúveis e a organização da laminina secretada na matriz extracelular pelos astrócitos. Desta forma, a expressão de PrP ctanto em astrócitos quanto em neurônios é essencial para a neuritogênese e sobrevivência neuronal. O papel autócrino de STI1 em astrócitos também foi demonstrado. A interação PrPc-STI1 previne a morte celular por ativação da via de PKA, e ativa a diferenciação astrocitária, de uma forma protoplasmática para uma fibrosa pela indução de ERK1/2. De acordo com estes resultados, um menor grau de diferenciação é encontrado em camundongos deficientes para PrPc. Estes apresentam uma expresão reduzida GFAP (proteína fibrilar acídica glial) e aumentada de vimentina e nestina em comparação com aqueles derivados de animais tipo-selvagem. STI1 promove ainda parada da proliferação astrocitária ativando a via de PKC de maneira independente de PrPc. O mecanismo pelo qual STI1 é secretada por astrócitos também foi avaliado e verificou-se que este é independente da via clássica mediada pelo complexo de Golgi. STI1 secretada é encontrada numa forma solúvel e em outra associada a componentes lipídicos e foram caracterizados por microscopia eletrônica como vesículas que variam entre 20-200nm. Dentre as vias de secreção não clássicas dependentes de lipídeos, a via de \"shedding\" de membrana foi descartada visto que STI1 não é secretada em associação com lipoproteínas. STI1 está presente em frações positivas para o receptor de transferrina, Hsp70, Hsp90 e PrPc, sugerindo composição exossomal. Esses resultados indicam que STI1 pode ser classificada como um fator trófico que associado ao seu \"receptor\" ou \"co-receptor\", PrPc, modula a sobrevivência e diferenciação tanto de neurônios quanto de astrócitos / The physiological functions of PrPc are under intense investigation and characterization, particularly those associated with brain development. In neurons, the association of PrPc with its ligand, STI1, induces neuritogenesis and neuroprotection via ERK and PKA signaling pathways, respectively. The present study evaluated whether PrPc expression in astrocytes modulates neuron-glia crosstalk and the autocrine role of STI1 in astrocytes. PrPc modulates neuron-glia interaction, the production and secretion of soluble factors, and the organization of the laminin in the extracellular matrix. PrPc expression in neurons and astrocytes is essential to neuritogenesis and neuronal survival. The autocrine role of STI1 in astrocytes was also demonstrated. The PrPc-STI1 interaction prevents cell death in a PKA-dependent manner, and induces astrocyte differentiation, from a flat to a process-bearing morphology in an ERK1/2 dependent manner. We showed that PrPccnull astrocytes presented a slower rate of astrocyte maturation than wild-type ones, with reduced expression of GFAP and increased vimentin and nestin expression. STI1 inhibited proliferation of both wild-type and PrPCnull astrocytes in a PKC-dependent manner. The mechanisms by which STI1 can be secreted by astrocytes was avaliated and we demonstrated that this secretion is independent on the classical secretory pathway mediated by the Golgi apparatus. Secreted STI1 is found in a soluble form and associated with lipidic compartments and we characterized by electron microscopy as vesicles that range from 20-200nm. Among the non-classical lipid-dependent secretory pathways, STI1 secretion by shedding was ruled out since STI1 was not secreted with lipoprotein fractions. On the other hand, STI1 is present in fractions that are positive for transferrin receptor, Hsp70, Hsp90 and PrPc, suggesting an exosome identity. Taken together, these data indicate that STI1 acts as a neurotrophic factor whose activity is dependent on the expression of PrP c at the neuronal surface, modulating differentiation and survival of both neurons and astrocytes

As funções fisiológicas da proteína prion (PrPc) estão sob ampla investigação e caracterização, especialmente as funções associadas ao desenvolvimento cerebral. Destaca-se que a associação de PrPc com Stress Inducible Protein 1 (STI1), induz neuritogênese e neuroproteção via proteína cinase extracelular reguladora (ERK) e proteína cinase dependente de AMPc (PKA) respectivamente. O presente estudo avaliou como a expressão de PrP cem astrócitos pode modular a interação neurônioglia e o papel de STI1 como um fator autócrino em astrócitos. PrPc modula a interação neurônio-glia, a produção de fatores tróficos solúveis e a organização da laminina secretada na matriz extracelular pelos astrócitos. Desta forma, a expressão de PrP ctanto em astrócitos quanto em neurônios é essencial para a neuritogênese e sobrevivência neuronal. O papel autócrino de STI1 em astrócitos também foi demonstrado. A interação PrPc-STI1 previne a morte celular por ativação da via de PKA, e ativa a diferenciação astrocitária, de uma forma protoplasmática para uma fibrosa pela indução de ERK1/2. De acordo com estes resultados, um menor grau de diferenciação é encontrado em camundongos deficientes para PrPc. Estes apresentam uma expresão reduzida GFAP (proteína fibrilar acídica glial) e aumentada de vimentina e nestina em comparação com aqueles derivados de animais tipo-selvagem. STI1 promove ainda parada da proliferação astrocitária ativando a via de PKC de maneira independente de PrPc. O mecanismo pelo qual STI1 é secretada por astrócitos também foi avaliado e verificou-se que este é independente da via clássica mediada pelo complexo de Golgi. STI1 secretada é encontrada numa forma solúvel e em outra associada a componentes lipídicos e foram caracterizados por microscopia eletrônica como vesículas que variam entre 20-200nm. Dentre as vias de secreção não clássicas dependentes de lipídeos, a via de \"shedding\" de membrana foi descartada visto que STI1 não é secretada em associação com lipoproteínas. STI1 está presente em frações positivas para o receptor de transferrina, Hsp70, Hsp90 e PrPc, sugerindo composição exossomal. Esses resultados indicam que STI1 pode ser classificada como um fator trófico que associado ao seu \"receptor\" ou \"co-receptor\", PrPc, modula a sobrevivência e diferenciação tanto de neurônios quanto de astrócitos / The physiological functions of PrPc are under intense investigation and characterization, particularly those associated with brain development. In neurons, the association of PrPc with its ligand, STI1, induces neuritogenesis and neuroprotection via ERK and PKA signaling pathways, respectively. The present study evaluated whether PrPc expression in astrocytes modulates neuron-glia crosstalk and the autocrine role of STI1 in astrocytes. PrPc modulates neuron-glia interaction, the production and secretion of soluble factors, and the organization of the laminin in the extracellular matrix. PrPc expression in neurons and astrocytes is essential to neuritogenesis and neuronal survival. The autocrine role of STI1 in astrocytes was also demonstrated. The PrPc-STI1 interaction prevents cell death in a PKA-dependent manner, and induces astrocyte differentiation, from a flat to a process-bearing morphology in an ERK1/2 dependent manner. We showed that PrPccnull astrocytes presented a slower rate of astrocyte maturation than wild-type ones, with reduced expression of GFAP and increased vimentin and nestin expression. STI1 inhibited proliferation of both wild-type and PrPCnull astrocytes in a PKC-dependent manner. The mechanisms by which STI1 can be secreted by astrocytes was avaliated and we demonstrated that this secretion is independent on the classical secretory pathway mediated by the Golgi apparatus. Secreted STI1 is found in a soluble form and associated with lipidic compartments and we characterized by electron microscopy as vesicles that range from 20-200nm. Among the non-classical lipid-dependent secretory pathways, STI1 secretion by shedding was ruled out since STI1 was not secreted with lipoprotein fractions. On the other hand, STI1 is present in fractions that are positive for transferrin receptor, Hsp70, Hsp90 and PrPc, suggesting an exosome identity. Taken together, these data indicate that STI1 acts as a neurotrophic factor whose activity is dependent on the expression of PrP c at the neuronal surface, modulating differentiation and survival of both neurons and astrocytes

Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKCδ induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKCδ leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKCδ leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.

THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, uma vez que está envolvida na biossíntese de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial. Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). Ensaios de complementação funcional mostraram que o gene thi1 de Arabidopsis thaliana é capaz de complementar uma cepa mutante de levedura para o gene ortólogo. A proteína THI1 de Arabidopsis thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada da região N-terminal da proteína, responsável pela sua localização na células, revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes. Na extremidade N-terminal encontra-se um peptídeo de trânsito cloroplástico seguida por uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica, tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o objetivo de avaliar se a localização final de THI1 pode apresentar um tipo de regulação temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas expressando a proteína THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em Arabidopsis thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de Arabidopsis thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o intuito de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial, fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas construções em epiderme de cebola, revelou que no caso das construções contendo a seqüência de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma. Além do aspecto do direcionamento, THI1 foi avaliada sob o ponto de vista filogenético. As análises filogenéticas mostram que thi1 é raramente encontrado em bactérias mas é amplamente distribuído em Archaea. As distâncias genéticas indicam que provavelmente os eucariontes herdaram thi1 de Archaea. As poucas bactérias que possuem esse gene provavelmente obtiveram-no por meio de herança horizontal. / THI1 is probably a bifunctional protein, since it is involved in thiamin biosynthesis and organelar genome stability mainly the mitochondrial. Interestingly, the thiamin biosynthesis occurs at different compartments in plants (chloroplasts) and yeasts (mitochondria). Functional complementation assays showed that Arabidopsis thaliana thi1 gene is able to complement a yeast mutant strain for the hortolog gene. The Arabidopsis thaliana THI1 is encoded by a single copy gene. A detailed analysis of the THI1 N-terminal region, that is responsible for its targeting in cells, reveled the presence of two in tanden directing sequences. At N-terminal region there is a chloroplastic transit peptide followed by a region able to form an anfifilic α-helix frequently present in mitochondrial presequences. Aiming to evaluate if the THI1 final localization could present a temporal or spacial regulation, transgenic plants expressing THI1 fused to GFP ("green fluorescent protein") where obtained. Confocal microscopy analysis of these transgenic plants showed that THI1 is mainly found in chloroplasts and barely found in mitochondrias. Different from what happens in Arabidopsis thaliana, in sugar cane where founded at least three thi1 isoforms/paralogs. The amino acids sequence alignment of these isoforms with the thi1 one, reveled high similarity including the targeting sequence. To evaluate the directing standard of these sugarcane isoforms, gene constructions made by the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide or the mitochondrial presequence, fused to GFP under the guidance of 35S promotor, where obtained. A transient expression of these gene constructios in epidermal onion cells prove that in the case of the constructions containing either the complete targeting sequence or the chloroplastic transit peptide the directing occurred only to chloroplasts. On the other hand, the constructions containing the mitochondrial pre sequence, GFP were kept defused in the citoplasm. Besides the directing aspect, THI1 were evaluated under the filogenetic point of view. Filogenetic analysis showed that thi1 is rarely found in bacteria but is widely distributed in Archaea. The genetic distances pointed out that probably eucaryotes THI1 came from Archaea. This gene in a few bacterias probably were inherited by lateral transference.