Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKCδ induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKCδ leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKCδ leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKCβI são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKCβI em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKCβI em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKCβI diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKCβI encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKCβI foi capaz de fosforilar a TIF1β e inibindo-se a PKCβI por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1β e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1β. Além disso vimos que inibindo-se a PKCβI com o peptídeo inibidor da PKCβI aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKCβI aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKCβI o que sugere que a PKCβI ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKCβI regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1β um possível alvo direto da PKCβI. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKCβI parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKCβI parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKCβI are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKCβI targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKCβI targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKCβI decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKCβI we found the adaptor protein, TIF1βI, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKCβI phosphorylated TIF1β and inhibiting PKCβI with RNAi decreased the expression of TIF1β and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1β. We also saw that inhibiting PKCβI with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKCβI increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKCβI suggesting that PKCβI activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKCβI regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1β a possibly a direct target of PKCβI, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKCβI seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKCβI has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKCβI são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKCβI em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKCβI em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKCβI diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKCβI encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKCβI foi capaz de fosforilar a TIF1β e inibindo-se a PKCβI por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1β e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1β. Além disso vimos que inibindo-se a PKCβI com o peptídeo inibidor da PKCβI aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKCβI aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKCβI o que sugere que a PKCβI ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKCβI regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1β um possível alvo direto da PKCβI. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKCβI parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKCβI parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKCβI are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKCβI targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKCβI targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKCβI decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKCβI we found the adaptor protein, TIF1βI, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKCβI phosphorylated TIF1β and inhibiting PKCβI with RNAi decreased the expression of TIF1β and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1β. We also saw that inhibiting PKCβI with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKCβI increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKCβI suggesting that PKCβI activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKCβI regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1β a possibly a direct target of PKCβI, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKCβI seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKCβI has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKCβI modulam a fosforilação da α-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a α-tubulina durante a interfase, a PKCβI interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da α-tubulina pela PKCβI foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a α- e a β-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da α-tubulina pela PKCβI. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a α e β-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na β-tubulina. A fosforilação in vitro de α-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKCβI em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-α-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da α-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKCβI em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKCβI modulate the phosphorylation of α-tubulin, however, while aPKCs interact with α-tubulin during interfase PKCβI interacts with α-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of α-tubulina phosphorylation by PKCβI. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between α- and β-tubulin, as a phosphorylation site of α-tubulin by PKCβI. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between α and β-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in β-tubulin. The in vitro phosphorylation of α-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKCβI in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-α-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of α-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKCβI in undifferentiated ESC.

Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKCδ induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKCδ leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKCδ leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKCβI modulam a fosforilação da α-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a α-tubulina durante a interfase, a PKCβI interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da α-tubulina pela PKCβI foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a α- e a β-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da α-tubulina pela PKCβI. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a α e β-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na β-tubulina. A fosforilação in vitro de α-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKCβI em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-α-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da α-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKCβI em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKCβI modulate the phosphorylation of α-tubulin, however, while aPKCs interact with α-tubulin during interfase PKCβI interacts with α-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of α-tubulina phosphorylation by PKCβI. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between α- and β-tubulin, as a phosphorylation site of α-tubulin by PKCβI. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between α and β-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in β-tubulin. The in vitro phosphorylation of α-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKCβI in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-α-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of α-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKCβI in undifferentiated ESC.