Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. / Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.