Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Traina_Fabiola_D.pdf: 10463418 bytes, checksum: a1c92a0820404ccf5ce6623bff80018a (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica e protéica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e sua participação nas vias de sinalização celular. Neste estudo, foi demonstrada a elevada expressão gênica e protéica de ANKHD1 em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. A expressão protéica de ANKHD1 em diferentes tecidos humanos normais (rim, baço, estômago, intestino delgado, músculo esquelético, fígado, pulmão e linfonodo) foi detectada em intensidades variáveis. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada, através de Western Blotting, em células de leucemia mielóide crônica em fase blástica (K562) e células LNCaP. Entretanto, esta associação não foi detectada nas linhagens leucêmicas KG1, HL60, Daudi e Jurkat. A ANKHD1 foi localizada no citoplasma de células hematopoéticas normais e leucêmicas. Detectou-se a fosforilação de ANKHD1 em serina em células leucêmicas, mas não em células hematopoéticas normais. Através de ensaio de duplo híbrido em levedura, utilizando-se uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana normal, detectou-se a interação de ANKHD1 com as proteínas SIVA1 e SIVA2, proteínas pró-apoptóticas altamente expressas em linhagens de leucemia linfóide aguda. Análises preliminares indicaram que a inibição da expressão protéica de ANKHD1, através de RNAi, induziu à apoptose celular em células leucêmicas, sugerindo uma função anti-apoptótica à ANKHD1. Em conclusão, o presente estudo identificou ANKHD1 como uma nova proteína altamente expressa em leucemias agudas, associada à SHP2 e SIVA em diferentes células, e, possivelmente, envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica através de uma função anti-apoptótica. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia da leucemia no futuro, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e leucêmicas / Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of actively expressed genes and the function of their coding proteins. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 protein (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, its expression pattern and its function have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene and protein expression pattern of ANKHD1 in normal hematopoietic cells and in leukemia cells, and its role in signaling pathways. In the present study, the overexpression of ANKHD1 mRNA and its protein was demonstrated in human leukemia cell lines (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi and Namalwa) and in 38 patients with a diagnosis of acute leukemia, compared to normal hematopoietic cells. The ANKHD1 protein was found to have a variable expression in different normal tissues (kidney, spleen, stomach, small intestine, skeletal muscle, liver, lung and lymph node). An association of ANKHD1 and SHP2 was found, through imunopreciptation and Western Blotting, in the chronic myeloid leukemia blastic phase cell line (K562) and in LNCaP cells. However, this association was not detected in the leukemia cell lines, KG1, HL60, Daudi and Jurkat. ANKHD1 was found located in the cytoplasm of normal hematopoietic cells and leukemia cells. ANKHD1 was found to be phosphorylated at serine in leukemic cells, but not in normal hematopoieitic cells. Through the yeast two-hybrid system, using a cDNA library from normal human bone marrow, the interaction of ANKHD1 with SIVA1 and SIVA2 was detected. SIVA isoforms are pro-apoptotic proteins, overexpressed in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Preliminary studies showed that the inbition of ANKHD1 expression, through RNAi, resulted in increased apoptosis in leukemic cells, which suggests an anti-apoptotic function for ANKHD1. In conclusion, the present study identified ANKHD1 as a new protein that is overexpressed in leukemic cells. The protein interacts with SHP2 and SIVA in different cells and is probably associated with the abnormal phenotype of the leukemia cell through its anti-apoptotic function. These findings suggest that ANKHD1 may be a molecular target for a rational therapy for leukemia in the near future, and open a new field of investigation to better define the specific roles of ANKHD1 in different normal and leukemic hematopoietic cells / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

A Doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos da substância nigra (SN) e conseqüente depleção de dopamina no corpo estriado. Os tratamentos disponíveis não impedem a progressão da doença, evidenciando a importância da procura de novas terapias. Estudos anteriores demonstraram que um extrato ciclo-hexânico de Hypericum polyanthemum inibe a recaptação sinapotossomal de monoaminas e é capaz de alterar a ligação de GTP induzida por monoaminas em receptores em cérebro de ratos, de forma mais potente para dopamina no corpo estriado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da administração de um extrato ciclo-hexânico das partes aéreas de H. polyanthemum em modelo de DP induzido por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar receberam duas infusões de 6-OHDA (5,5 μL, 3 μg/μL) no feixe prosencefálico medial direito através de cirurgia estereotáxica. Foram realizados os seguintes regimes de tratamento do extrato: (regime 1) três administrações iniciadas 4 h após a lesão; (regime 2) três administrações iniciadas 24 h após a lesão; (regime 3) três administrações iniciadas 48 h após a lesão; (regime 4) três administrações iniciadas antes dos testes comportamentais, em que a última administração foi realizada 1 hora antes de cada teste. Em cada um desses regimes, as administrações (90 mg/kg, v.o.) foram realizadas em 24 h com intervalos de 6 h. Por último, foram realizadas também duas administrações diárias iniciadas 48 h após a lesão (90 mg/kg, v.o.) durante 5 dias consecutivos (regime 5). Controles receberam veículo (salina + polissorbato 80 5%). Os animais foram submetidos ao teste da fita adesiva 62 dias após a lesão e à avaliação do comportamento rotacional induzido por metilfenidato (20 mg/kg, i.p.) 10, 45 e 85 dias após a cirurgia estereotáxica. Foi realizada avaliação do conteúdo de tirosina-hidroxilase (TH) nos animais submetidos ao regime 2. Observou-se aumento no número de rotações ipsilaterais nos animais tratados com o extrato no regime 2 [ANOVA de medidas repetidas; efeito fator GRUPO F(1,13)=6,63; p<0,0185] e regime 5 [ANOVA de medidas repetidas; efeito fator GRUPO F(1,12)=5,10; p<0,043]. No teste da fita adesiva, os animais controle (teste de Wilcoxon; p<0,004) e tratado (teste de Wilcoxon; p<0,045) do regime 2 demoraram mais para perceber a fita da pata esquerda, mas não houve diferença entre os grupos. Foi encontrada uma redução significativa do conteúdo de TH na SN dos animais tratados com o extrato pertencentes ao regime 2 (teste de Mann-Whitney, p=0,034). O extrato, no regime 2, aumenta a atividade rotacional induzida por MF de ratos lesionados com 6-OHDA e reduz o conteúdo de TH na SN, indicando ação neurotóxica do extrato no modelo testado. / Parkinson´s Disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of dopaminergic neurons of substantia nigra (SN) and consequent depletion of dopamine in the striatum. The available treatments do not prevent the disease progression, demonstrating the importance of researching new therapies. Previous studies demonstrated that the extract of Hypericum polyanthemum presents an antidepresant-like effect in mice that is meditated by inhibition of synaptossomal inhibits the monoamines reuptake and it’s able to change the GTP binding to monoamine receptors in the rat brain, which is more pronounced for dopamine receptors in the striatum. The aim of this study was to evaluate the effect of H. polyanthemum cyclohexane extract administration in a PD model induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Wistar rats received two infusions of 6-OHDA (5.5 mL, 3 mg/mL) into the right medial forebrain bundle through stereotaxic surgery. We conducted the following treatments with the extract: (1) three administrations initiated 4 h after injury, (2) three administrations started 24 h after injury, (3) three administrations initiated 48 h after injury, (4) three administrations initiated before the behavioral tests, in which the last administration was performed 1 hour before each test and (5) two administration for 5 consecutive days. In each scheme, the administrations (90 mg/kg po each) were performed in 24 h with intervals of 86 h. Lastly, were performed twice daily administrations (90 mg/kg po each) for five consecutive days (5). Controls received vehicle. The assessment of rotational behavior induced by methylphenidate (MF) (20 mg / kg, ip) was performed 10, 45 and 85 days after stereotactic surgery. The animals were tested for sticky tape 62 days after infusion. The assessment of tyrosine hydroxylase (TH) content was performed in animals subjected to treatment 2. There was an increase in the number of ipsilateral rotations in animals treated with the extract in treatment 2 and treatment 5 [repeated measures ANOVA group effect, F(1,13)=6.63, p<0.0185; F(1,12)=5.10, p<0.043;, respectively]. In the sticky tape test, both groups of treatment 2 took longer to see the tape of the left paw, but did not differ from each other (Wilcoxon test, p<0.005). There was significant reduction in the content of TH in the SN of animals treated with extract in the treatment 2 (Mann-Whitney testone-way ANOVA, p=0.0034). The treatment 2 increases the rotational behavior and reduces de content of TH in the SNpc, indicating the toxic effect of the extract in the animal PD model.

A tirosinemia tipo II é um erro inato do metabolismo que se caracteriza por altos níveis plasmáticos e teciduais de tirosina, cujo efeito sobre o Sistema Nervoso Central pode variar de retardo mental leve a grave, podendo estar associado com outras anomalias neurológicas. No presente estudo nosso objetivo foi investigar in vitro e in vivo os efeitos de elevadas concentrações de tirosina sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos de 14 dias de idade. Os resultados mostraram que 1,0-2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da creatinaquinase (CK) citosólica e mitocondrial em um padrão dependente da concentração e que esta inibição é prevenida por glutationa reduzida (GSH), sugerindo a alteração de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Os resultados também indicam que somente a atividade da CK mitocondrial é inibida pela tirosina em uma maneira dependente do tempo. Além disso, uma única injeção de L-tirosina metil éster (TME) diminuiu a atividade da CK citosólica e mitocondrial em córtex cerebral de ratos. Observou-se que 2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da piruvatoquinase (PK) e que esta inibição é prevenida por GSH nos tempos de 30, 60 e 90 min de pré-incubação. Além disso, a administração TME reduziu a atividade da PK e essa redução é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Por outro lado, a tirosina não alterou a atividade da adenilatoquinase (AK) in vitro, mas a administração de TME aumentou a atividade da AK. Finalmente, administração de TME diminuiu a atividade da CK da fração citosólica e mitocondrial e esta diminuição é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Considerando os resultados em conjunto, podemos presumir que a tirosina altera grupos sulfidrilas essenciais para a atividade da CK e PK, possivelmente por estresse oxidativo. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes com tirosinemia tipo II, é possível que alterações no metabolismo energético contribuem, pelo menos em parte, para a disfunção neurológica característica dessa doença metabólica. / Tyrosinemia type II is an inborn error of metabolism, where tyrosine levels are highly elevated in tissues and physiological fluids of affected patients. The central nervous system involvement can range from mild to severe mental retardation and may be associated with other neurologic abnormalities. The present study investigated the in vitro and in vivo effects of high concentrations of tyrosine on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex homogenates from 14-day-old Wistar rats. It was observed that 1.0-2.0 mM tyrosine inhibit in vitro the enzymatic activity of mitochondrial and cytosolic creatine kinase (CK) in a concentration-dependent pattern and that this inhibition is prevented by reduced glutathione (GSH), suggesting that creatine kinase inhibition was caused by altering essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Results also indicate that mitochondrial, but not cytosolic CK activity is inhibited by tyrosine in a time-dependent way. In addition, a single injection of L-tyrosine methyl ester (TME) decreased cytosolic and mitochondrial CK activities of brain cortex from rats. It was observed that 2.0 mM tyrosine inhibit the pyruvate kinase (PK) activity in vitro and that this inhibition is prevented by GSH at 30 min, 60 and 90 min of pre-incubation. Moreover, TME administration reduced the PK activity and this reduction is prevented by pre-treatment with creatine. On the other hand, tyrosine did not alter the adenylate kinase (AK) activity in vitro, but the administration of TME increased the activity of AK. Finally, TME administration decreased the CK activity of cytosolic and mitochondrial fractions and this decrease is prevented by creatine pre-treatment. Taken together all the results, it can be presumed that tyrosine alters sulfhydryl groups essential for CK and PK functions possibly through oxidative stress. If these effects also occur in patients with tyrosinemia type II, it is possible that energy metabolism alterations contribute, at least in part, to the neurological dysfunction characteristic of this metabolic disease.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-24T09:37:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 262482.pdf: 2464435 bytes, checksum: 50ce73712dd06e2df347fb6c893b0017 (MD5) / No presente estudo foi analisado o potencial antioxidante e protetor do composto orgânico sintético de selênio difenil disseleneto contra dano oxidativo induzido por H2O2 em fatias hipocampais de ratos adultos. Além disso, o efeito pró-apoptótico deste composto foi testado na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Paralelamente, o potencial antidepressivo do composto de selênio ebselen foi investigado em modelos animais de depressão. Neste estudo foi também avaliado o efeito do manganês sobre a fosforilação e atividade de tirosina hidroxilase em células PC12.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T12:22:59Z No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-11T12:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Entamoeba histolytica, o agente etiológico da amebíase, constitui a segunda maior causa de morte por protozooses, sendo considerado um grave problema de saúde pública, particularmente em países em desenvolvimento. A morte celular induzida por este parasito entérico é dependente de contato e mediada por proteínas específicas, as quais modulam diversos eventos fisiológicos no hospedeiro. Dentre os mecanismos reguladores de tais respostas está a desfosforilação de grupos fosfotirosil de proteínas, através da atuação de proteína tirosina fosfatases (PTPases), tanto expressas na superfície celular como secretados pelo trofozoíto. Alguns estudos demonstram uma rápida diminuição nos níveis de fosforilação de resíduos tirosina em proteínas de células-alvo após o contato com E. histolytica. Estas PTPases têm sido descritas como tendo importante papel na patogênese da amebíase. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de atividade fosfatásica em diferentes cepas de E. histolytica, assim como caracterizar a sua sensibilidade a conhecidos inibidores de proteína tirosina fosfatases, e os efeitos destes moduladores em mecanismos envolvidos na patogênese, a exemplo de fagocitose e efeito citopático. Inicialmente, a sensibilidade aos moduladores da via de sinalização celular em trofozoítos de E. histolytica (cepas ICB – 452, ICB – CSP e HM1:IMSS) foi caracterizada através de avaliação da proliferação celular, onde inóculos de parasitos foram incubados em presença ou ausência de inibidores de PTPases. Dentre os moduladores testados, o derivado de vanádio bisperoxo (1, 10 - fenantrolina) oxovanadato de potássio (bpVphen) e o óxido de fenilarsina (PAO) demonstraram efetiva capacidade antiproliferativa. Estas células apresentaram uma maior sensibilidade ao PAO em comparação ao bpV(phen), com valores de IC50 para a cepa HM1:IMSS de 0,9 μM e 38,4 μM, respectivamente. A análise bioquímica revelou que há uma maior atividade secretória e ectofosfatásica na linhagem HM1:IMSS (24,48 nM p-NP/40 min./3 x 106 células e 297 nM p-NP/40 min./2 x 105 células, respectivamente), e uma redução desta atividade foi detectada na presença dos derivados de vanádio na superfície do parasito (31,3 nM p-NP/40 min./2 x 105 células). O mesmo não foi observado após a adição de PAO. A análise da eritrofagocitose e da destruição da monocamada de células epiteliais da linhagem MDCK, importantes marcadores de virulência neste patógeno, demonstrou significativa redução destes processos em trofozoítos tratados com os inibidores ortovanadato de sódio (OVS) e o bpV(phen), indicando a participação de PTPases nos mesmos. Estas mesmas alterações foram observadas após o tratamento do parasito com PAO, porém dados ultraestruturais de citoquímica enzimática não indicam a redução da atividade fosfatásica por este composto. Estes dados foram confirmados após a avaliação da atividade das frações purificadas de homogenatos solubilizados de trofozoítos de E. histolytica, onde detectou-se a redução dos níveis de atividade enzimática após a adição de vanadato e seus derivados à reação, o que não pôde ser observado após o acréscimo de PAO. Os resultados obtidos indicam que PTPases estão diretamente envolvidas em importantes funções celulares exercidas por trofozoítos de Entamoeba histolytica. Ademais, novos estudos que visem à elucidação dos possíveis modos de ação do composto PAO neste patógeno poderiam contribuir, consideravelmente, com o entendimento da biologia do parasito e, consequentemente, dos mecanismos patogênicos da amebíase. / The microaerophilic protozoan Giardia lamblia inhabits the upper small intestine mucosa of vertebrate hosts, where it is exposed to different concentrations of oxygen. Despite the fermentative metabolism, Giardia trophozoites consume O2 and produce oxygen free radicals and therefore mechanism for detoxification are required. Devoid of glutathione, Giardia express high concentrations of cystein-rich proteins (CRP, also known as variable surface protein or VSP), as an antioxidant defense. This mechanism involves redox cycling for maintenance of a reduced intracellular environment and protection from oxidative stress. In this regard, substances that interfere in the antioxidant response of this protozoan could comprise a powerful chemotherapeutic strategy for Giardia lamblia infection. Here, we analyzed the effects of DETC, a superoxide dismutase (SOD) inhibitor, on parasite proliferation, thiol expression, lipid peroxidation, free radicals detection and cell architecture. DETC inhibited parasite proliferation at levels similar to metronidazole and induced peroxidation of membrane, possibly by the increase of reactive species.Ultrastructural alteration were also observed. Since this protozoan is devoid of SOD, here present data indicate SOD-independ DETC effects. Thiol groups detection with the fluorescent probe o-phthaldialdehyde (OPA). Cells treated with DETC displayed washed out cytoplasm and structures indicative of autophagy. The peripheral vesicles also had an increased volume, presumably caused by homophilic fusion. Taken together these data indicate that DETC enhance the oxidative stress in Giardia trophozoites by reacting with thiol groups.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27 / O músculo esquelético de mamífero é responsável tanto pelo desencadeamento da contração e geração de força e movimento. Por outro lado, o músculo participa do controle da homeostase energética corporal ao disponibilizar aminoácidos gerados a partir da proteólise muscular. A regulação final dessa proteólise é crucial para a manutenção da massa muscular. Até o momento, os mecanismos de regulação desse processo assim como a triagem farmacológica de drogas que interferem com a proteólise muscular tem sido realizadas pela medida da liberação de tirosina de músculos de ratos impúberes, devido ao tamanho e à má perfusão tecidual de músculos de ratos adultos. Logo, o efeito da idade ou de doenças neurodegenerativas tem sido analisado apenas com marcadores estáticos, como atrogin*1/MAFbx ou Murf*1. Além disso, músculos de ratos impúberes diferem daqueles do rato adulto quanto a resistência à insulina e alta taxa de crescimento, o que pode comprometer a extrapolação direta dos resultados obtidos em animais impúberes para adultos. No presente estudo, propusemos o estabelecimento de um novo modelo experimental in situ o músculo lumbricalis do rato adulto para a medida dinâmica da proteólise muscular, através da quantificação da liberação de tirosina pelo músculo. Além disso, adaptamos o método fluorimétrico da medida do aminoácido para microplaca de 96 fossos, o que implicou na redução de 90% da formação de rejeitos químicos. Esse estudo foi complementado pela análise do efeito de moduladores da via da proteína Gs/Adenilil ciclase/ AMP cíclico, cuja participação na regulação da proteólise muscular já havia sido demonstrada em músculos de ratos impúberes. Utilizando o músculo lumbricalis de rato adulto, comprovamos que moduladores da via de sinalização do AMPc inibem a proteólise muscular em situações basais ou catabólicas induzidas pela desnervação. Os agonistas de adrenoceptores β isoproterenol (30*100 ]M; não seletivo) e formoterol (1*10 nM; seletivo β2), o ativador de adenilil ciclase forscolina (30*100 nM) e o inibidor não seletivo de fosfodiesterases IBMX (100*1000]M) reduziram a proteólise muscular em 12a20%. Além disso, evidenciamos que a proteólise muscular de ratos impúberes (30dias de idade) é 94% maior que a de animais adultos, resultado que torna questionável a extrapolação de resultados obtidos em músculos de animais impúberes para a idade adulta. A utilização do músculo lumbricalis como modelo experimental reduz em pelo menos 4 vezes o número de animais em protocolos experimentais de medida de proteólise e em 90% a quantidade de rejeitos químicos produzidos, devido à adaptação da dosagem da tirosina para microplaca, propiciando a realização de triagem farmacológica de drogas para fins terapêuticos anticatabólicos. / In vertebrates, skeletal muscle contributes to the control of body energy homeostasis by providing amino acids generated from protein breakdown. However, continued muscle protein breakdown results in muscle atrophy, such as those associated with aging, muscle wasting or neuromuscular dysfunction. The molecular mechanisms involved in regulation of muscle proteolysis as well as the pharmacological screening of drugs that interfere in this process have been addresses by measurement of tyrosine release from muscles of prepubertal rats, because they are thin enough to allow an adequate diffusion of oxygen and substrates under in vitro conditions. Therefore, the effect of aging or neurodegenerative diseases has been analyzed only with static markers, as atrogin-1/MAFbx or Murf-1. The aim of the present study was the establishment of a new in situ experimental model for the dynamic measurement of proteolysis in adult rat muscles, by quantifying the release of tyrosine from the lumbricalis muscle. In addition, the fluorimetric macromethod for tyrosine measurement was adapted for 96 wells microplate, which resulted in 90% reduction in the formation of toxic chemical waste. The results were complemented by analyzing the effect of modulators of Gs protein / adenylyl cyclase / cyclic AMP signaling pathway on proteolysis of adult muscles, whose influence had already been demonstrated in muscles from prepubertal rat. Using adult rat lumbricalis muscle, we found that modulators of the cAMP signaling pathway inhibit muscle proteolysis under basal or catabolic condition induced by denervation. â-adrenergic agonists isoproterenol (30-100 mM; non-selective) and formoterol (1-10 nM; selective â2), the adenylyl cyclase activator forskolin (30-100 nM) and nonselective phosphodiesterase inhibitor IBMX (100-1000 mM) reduced by 12% to 20% muscle proteolysis. Furthermore, our results show that muscle proteolysis in pre-pubertal rats (30 days old) is 94% higher than in adult animals, which makes questionable the direct extrapolation of results obtained from pre-pubertal muscles to adult or senile muscles. The use of lumbricalis muscle as an proteolysis experimental model reduces by 75% the number of animals in proteolysis experimental protocols and by 90% the amount of chemical waste produced, due to the adjustment of the dosage of tyrosine to 96 well microplate, optimizing the pharmacological screening of drugs for anticatabolic purposes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327744.pdf: 3387181 bytes, checksum: f953d00b12dd357296a0d6cf6ed03852 (MD5) Previous issue date: 2014 / Este trabalho teve como objetivo principal a síntese e caracterização de 22 chalconas derivadas do 4-carboxibenzaldeído, e avaliação da sua atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. As chalconas foram sintetizadas através do método de condensação de Claisen-Schmidt, utilizando quatro condições reacionais distintas. Todas as chalconas foram caracterizadas através de espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, ponto de fusão e espectros de massa (EM). As chalconas obtidas por via ácida (VA) forneceram primeiramente produtos esterificados, que foram hidrolisados para obter as chalconas com carboxila livre, que foram confirmadas pelo ponto de fusão. Entre as 22 chalconas obtidas, 13 são inéditas Q1VA, Q2VA, Q5VA, Q18VA, Q16VB, Q17VB, Q20VB, Q22VB, Q26VB, Q7VBR, Q3MC, Q4MC e Q9MC. As chalconas Q22VB e Q26VB foram as que apresentaram melhor atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. O composto Q23VB, análogo ao composto (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) anteriormente publicado pelo grupo e que tem alta atividade frente a estas enzimas, não teve atividade significativa.<br> / Abstract : This work aimed to the synthesis and characterization of 22 chalcones derived from 4 - carboxybenzaldehyde , and evaluation of their biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The chalcones were synthesized by the method of Claisen -Schmidt condensation using four different reaction conditions . All chalcones were characterized by nuclear magnetic resonance spectra ( NMR) 1H and 13C NMR , melting point and mass spectra ( MS). The chalcones obtained via acid (VA) provided first esterified product , which was hydrolyzed to obtain chalcones with free carboxyl , which was confirmed by melting point. Among the 22 chalcones obtained , 13 are new Q1VA , Q2VA , Q5VA , Q18VA , Q16VB , Q17VB , Q20VB , Q22VB , Q26VB , Q7VBR , Q3MC , Q4MC and Q9MC . The Q22VB and Q26VB chalcones showed the best biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The compound Q23VB , analogous to compound (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) previously published by the group and has high activity against these enzymes had no significant activity.

A Doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos da substância nigra (SN) e conseqüente depleção de dopamina no corpo estriado. Os tratamentos disponíveis não impedem a progressão da doença, evidenciando a importância da procura de novas terapias. Estudos anteriores demonstraram que um extrato ciclo-hexânico de Hypericum polyanthemum inibe a recaptação sinapotossomal de monoaminas e é capaz de alterar a ligação de GTP induzida por monoaminas em receptores em cérebro de ratos, de forma mais potente para dopamina no corpo estriado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da administração de um extrato ciclo-hexânico das partes aéreas de H. polyanthemum em modelo de DP induzido por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar receberam duas infusões de 6-OHDA (5,5 μL, 3 μg/μL) no feixe prosencefálico medial direito através de cirurgia estereotáxica. Foram realizados os seguintes regimes de tratamento do extrato: (regime 1) três administrações iniciadas 4 h após a lesão; (regime 2) três administrações iniciadas 24 h após a lesão; (regime 3) três administrações iniciadas 48 h após a lesão; (regime 4) três administrações iniciadas antes dos testes comportamentais, em que a última administração foi realizada 1 hora antes de cada teste. Em cada um desses regimes, as administrações (90 mg/kg, v.o.) foram realizadas em 24 h com intervalos de 6 h. Por último, foram realizadas também duas administrações diárias iniciadas 48 h após a lesão (90 mg/kg, v.o.) durante 5 dias consecutivos (regime 5). Controles receberam veículo (salina + polissorbato 80 5%). Os animais foram submetidos ao teste da fita adesiva 62 dias após a lesão e à avaliação do comportamento rotacional induzido por metilfenidato (20 mg/kg, i.p.) 10, 45 e 85 dias após a cirurgia estereotáxica. Foi realizada avaliação do conteúdo de tirosina-hidroxilase (TH) nos animais submetidos ao regime 2. Observou-se aumento no número de rotações ipsilaterais nos animais tratados com o extrato no regime 2 [ANOVA de medidas repetidas; efeito fator GRUPO F(1,13)=6,63; p<0,0185] e regime 5 [ANOVA de medidas repetidas; efeito fator GRUPO F(1,12)=5,10; p<0,043]. No teste da fita adesiva, os animais controle (teste de Wilcoxon; p<0,004) e tratado (teste de Wilcoxon; p<0,045) do regime 2 demoraram mais para perceber a fita da pata esquerda, mas não houve diferença entre os grupos. Foi encontrada uma redução significativa do conteúdo de TH na SN dos animais tratados com o extrato pertencentes ao regime 2 (teste de Mann-Whitney, p=0,034). O extrato, no regime 2, aumenta a atividade rotacional induzida por MF de ratos lesionados com 6-OHDA e reduz o conteúdo de TH na SN, indicando ação neurotóxica do extrato no modelo testado. / Parkinson´s Disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of dopaminergic neurons of substantia nigra (SN) and consequent depletion of dopamine in the striatum. The available treatments do not prevent the disease progression, demonstrating the importance of researching new therapies. Previous studies demonstrated that the extract of Hypericum polyanthemum presents an antidepresant-like effect in mice that is meditated by inhibition of synaptossomal inhibits the monoamines reuptake and it’s able to change the GTP binding to monoamine receptors in the rat brain, which is more pronounced for dopamine receptors in the striatum. The aim of this study was to evaluate the effect of H. polyanthemum cyclohexane extract administration in a PD model induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Wistar rats received two infusions of 6-OHDA (5.5 mL, 3 mg/mL) into the right medial forebrain bundle through stereotaxic surgery. We conducted the following treatments with the extract: (1) three administrations initiated 4 h after injury, (2) three administrations started 24 h after injury, (3) three administrations initiated 48 h after injury, (4) three administrations initiated before the behavioral tests, in which the last administration was performed 1 hour before each test and (5) two administration for 5 consecutive days. In each scheme, the administrations (90 mg/kg po each) were performed in 24 h with intervals of 86 h. Lastly, were performed twice daily administrations (90 mg/kg po each) for five consecutive days (5). Controls received vehicle. The assessment of rotational behavior induced by methylphenidate (MF) (20 mg / kg, ip) was performed 10, 45 and 85 days after stereotactic surgery. The animals were tested for sticky tape 62 days after infusion. The assessment of tyrosine hydroxylase (TH) content was performed in animals subjected to treatment 2. There was an increase in the number of ipsilateral rotations in animals treated with the extract in treatment 2 and treatment 5 [repeated measures ANOVA group effect, F(1,13)=6.63, p<0.0185; F(1,12)=5.10, p<0.043;, respectively]. In the sticky tape test, both groups of treatment 2 took longer to see the tape of the left paw, but did not differ from each other (Wilcoxon test, p<0.005). There was significant reduction in the content of TH in the SN of animals treated with extract in the treatment 2 (Mann-Whitney testone-way ANOVA, p=0.0034). The treatment 2 increases the rotational behavior and reduces de content of TH in the SNpc, indicating the toxic effect of the extract in the animal PD model.

A tirosinemia tipo II é um erro inato do metabolismo que se caracteriza por altos níveis plasmáticos e teciduais de tirosina, cujo efeito sobre o Sistema Nervoso Central pode variar de retardo mental leve a grave, podendo estar associado com outras anomalias neurológicas. No presente estudo nosso objetivo foi investigar in vitro e in vivo os efeitos de elevadas concentrações de tirosina sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos de 14 dias de idade. Os resultados mostraram que 1,0-2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da creatinaquinase (CK) citosólica e mitocondrial em um padrão dependente da concentração e que esta inibição é prevenida por glutationa reduzida (GSH), sugerindo a alteração de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Os resultados também indicam que somente a atividade da CK mitocondrial é inibida pela tirosina em uma maneira dependente do tempo. Além disso, uma única injeção de L-tirosina metil éster (TME) diminuiu a atividade da CK citosólica e mitocondrial em córtex cerebral de ratos. Observou-se que 2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da piruvatoquinase (PK) e que esta inibição é prevenida por GSH nos tempos de 30, 60 e 90 min de pré-incubação. Além disso, a administração TME reduziu a atividade da PK e essa redução é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Por outro lado, a tirosina não alterou a atividade da adenilatoquinase (AK) in vitro, mas a administração de TME aumentou a atividade da AK. Finalmente, administração de TME diminuiu a atividade da CK da fração citosólica e mitocondrial e esta diminuição é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Considerando os resultados em conjunto, podemos presumir que a tirosina altera grupos sulfidrilas essenciais para a atividade da CK e PK, possivelmente por estresse oxidativo. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes com tirosinemia tipo II, é possível que alterações no metabolismo energético contribuem, pelo menos em parte, para a disfunção neurológica característica dessa doença metabólica. / Tyrosinemia type II is an inborn error of metabolism, where tyrosine levels are highly elevated in tissues and physiological fluids of affected patients. The central nervous system involvement can range from mild to severe mental retardation and may be associated with other neurologic abnormalities. The present study investigated the in vitro and in vivo effects of high concentrations of tyrosine on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex homogenates from 14-day-old Wistar rats. It was observed that 1.0-2.0 mM tyrosine inhibit in vitro the enzymatic activity of mitochondrial and cytosolic creatine kinase (CK) in a concentration-dependent pattern and that this inhibition is prevented by reduced glutathione (GSH), suggesting that creatine kinase inhibition was caused by altering essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Results also indicate that mitochondrial, but not cytosolic CK activity is inhibited by tyrosine in a time-dependent way. In addition, a single injection of L-tyrosine methyl ester (TME) decreased cytosolic and mitochondrial CK activities of brain cortex from rats. It was observed that 2.0 mM tyrosine inhibit the pyruvate kinase (PK) activity in vitro and that this inhibition is prevented by GSH at 30 min, 60 and 90 min of pre-incubation. Moreover, TME administration reduced the PK activity and this reduction is prevented by pre-treatment with creatine. On the other hand, tyrosine did not alter the adenylate kinase (AK) activity in vitro, but the administration of TME increased the activity of AK. Finally, TME administration decreased the CK activity of cytosolic and mitochondrial fractions and this decrease is prevented by creatine pre-treatment. Taken together all the results, it can be presumed that tyrosine alters sulfhydryl groups essential for CK and PK functions possibly through oxidative stress. If these effects also occur in patients with tyrosinemia type II, it is possible that energy metabolism alterations contribute, at least in part, to the neurological dysfunction characteristic of this metabolic disease.

A Doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos da substância nigra (SN) e conseqüente depleção de dopamina no corpo estriado. Os tratamentos disponíveis não impedem a progressão da doença, evidenciando a importância da procura de novas terapias. Estudos anteriores demonstraram que um extrato ciclo-hexânico de Hypericum polyanthemum inibe a recaptação sinapotossomal de monoaminas e é capaz de alterar a ligação de GTP induzida por monoaminas em receptores em cérebro de ratos, de forma mais potente para dopamina no corpo estriado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da administração de um extrato ciclo-hexânico das partes aéreas de H. polyanthemum em modelo de DP induzido por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar receberam duas infusões de 6-OHDA (5,5 μL, 3 μg/μL) no feixe prosencefálico medial direito através de cirurgia estereotáxica. Foram realizados os seguintes regimes de tratamento do extrato: (regime 1) três administrações iniciadas 4 h após a lesão; (regime 2) três administrações iniciadas 24 h após a lesão; (regime 3) três administrações iniciadas 48 h após a lesão; (regime 4) três administrações iniciadas antes dos testes comportamentais, em que a última administração foi realizada 1 hora antes de cada teste. Em cada um desses regimes, as administrações (90 mg/kg, v.o.) foram realizadas em 24 h com intervalos de 6 h. Por último, foram realizadas também duas administrações diárias iniciadas 48 h após a lesão (90 mg/kg, v.o.) durante 5 dias consecutivos (regime 5). Controles receberam veículo (salina + polissorbato 80 5%). Os animais foram submetidos ao teste da fita adesiva 62 dias após a lesão e à avaliação do comportamento rotacional induzido por metilfenidato (20 mg/kg, i.p.) 10, 45 e 85 dias após a cirurgia estereotáxica. Foi realizada avaliação do conteúdo de tirosina-hidroxilase (TH) nos animais submetidos ao regime 2. Observou-se aumento no número de rotações ipsilaterais nos animais tratados com o extrato no regime 2 [ANOVA de medidas repetidas; efeito fator GRUPO F(1,13)=6,63; p<0,0185] e regime 5 [ANOVA de medidas repetidas; efeito fator GRUPO F(1,12)=5,10; p<0,043]. No teste da fita adesiva, os animais controle (teste de Wilcoxon; p<0,004) e tratado (teste de Wilcoxon; p<0,045) do regime 2 demoraram mais para perceber a fita da pata esquerda, mas não houve diferença entre os grupos. Foi encontrada uma redução significativa do conteúdo de TH na SN dos animais tratados com o extrato pertencentes ao regime 2 (teste de Mann-Whitney, p=0,034). O extrato, no regime 2, aumenta a atividade rotacional induzida por MF de ratos lesionados com 6-OHDA e reduz o conteúdo de TH na SN, indicando ação neurotóxica do extrato no modelo testado. / Parkinson´s Disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of dopaminergic neurons of substantia nigra (SN) and consequent depletion of dopamine in the striatum. The available treatments do not prevent the disease progression, demonstrating the importance of researching new therapies. Previous studies demonstrated that the extract of Hypericum polyanthemum presents an antidepresant-like effect in mice that is meditated by inhibition of synaptossomal inhibits the monoamines reuptake and it’s able to change the GTP binding to monoamine receptors in the rat brain, which is more pronounced for dopamine receptors in the striatum. The aim of this study was to evaluate the effect of H. polyanthemum cyclohexane extract administration in a PD model induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Wistar rats received two infusions of 6-OHDA (5.5 mL, 3 mg/mL) into the right medial forebrain bundle through stereotaxic surgery. We conducted the following treatments with the extract: (1) three administrations initiated 4 h after injury, (2) three administrations started 24 h after injury, (3) three administrations initiated 48 h after injury, (4) three administrations initiated before the behavioral tests, in which the last administration was performed 1 hour before each test and (5) two administration for 5 consecutive days. In each scheme, the administrations (90 mg/kg po each) were performed in 24 h with intervals of 86 h. Lastly, were performed twice daily administrations (90 mg/kg po each) for five consecutive days (5). Controls received vehicle. The assessment of rotational behavior induced by methylphenidate (MF) (20 mg / kg, ip) was performed 10, 45 and 85 days after stereotactic surgery. The animals were tested for sticky tape 62 days after infusion. The assessment of tyrosine hydroxylase (TH) content was performed in animals subjected to treatment 2. There was an increase in the number of ipsilateral rotations in animals treated with the extract in treatment 2 and treatment 5 [repeated measures ANOVA group effect, F(1,13)=6.63, p<0.0185; F(1,12)=5.10, p<0.043;, respectively]. In the sticky tape test, both groups of treatment 2 took longer to see the tape of the left paw, but did not differ from each other (Wilcoxon test, p<0.005). There was significant reduction in the content of TH in the SN of animals treated with extract in the treatment 2 (Mann-Whitney testone-way ANOVA, p=0.0034). The treatment 2 increases the rotational behavior and reduces de content of TH in the SNpc, indicating the toxic effect of the extract in the animal PD model.