Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327744.pdf: 3387181 bytes, checksum: f953d00b12dd357296a0d6cf6ed03852 (MD5) Previous issue date: 2014 / Este trabalho teve como objetivo principal a síntese e caracterização de 22 chalconas derivadas do 4-carboxibenzaldeído, e avaliação da sua atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. As chalconas foram sintetizadas através do método de condensação de Claisen-Schmidt, utilizando quatro condições reacionais distintas. Todas as chalconas foram caracterizadas através de espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, ponto de fusão e espectros de massa (EM). As chalconas obtidas por via ácida (VA) forneceram primeiramente produtos esterificados, que foram hidrolisados para obter as chalconas com carboxila livre, que foram confirmadas pelo ponto de fusão. Entre as 22 chalconas obtidas, 13 são inéditas Q1VA, Q2VA, Q5VA, Q18VA, Q16VB, Q17VB, Q20VB, Q22VB, Q26VB, Q7VBR, Q3MC, Q4MC e Q9MC. As chalconas Q22VB e Q26VB foram as que apresentaram melhor atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. O composto Q23VB, análogo ao composto (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) anteriormente publicado pelo grupo e que tem alta atividade frente a estas enzimas, não teve atividade significativa.<br> / Abstract : This work aimed to the synthesis and characterization of 22 chalcones derived from 4 - carboxybenzaldehyde , and evaluation of their biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The chalcones were synthesized by the method of Claisen -Schmidt condensation using four different reaction conditions . All chalcones were characterized by nuclear magnetic resonance spectra ( NMR) 1H and 13C NMR , melting point and mass spectra ( MS). The chalcones obtained via acid (VA) provided first esterified product , which was hydrolyzed to obtain chalcones with free carboxyl , which was confirmed by melting point. Among the 22 chalcones obtained , 13 are new Q1VA , Q2VA , Q5VA , Q18VA , Q16VB , Q17VB , Q20VB , Q22VB , Q26VB , Q7VBR , Q3MC , Q4MC and Q9MC . The Q22VB and Q26VB chalcones showed the best biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The compound Q23VB , analogous to compound (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) previously published by the group and has high activity against these enzymes had no significant activity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biologicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:32:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290250.pdf: 1651252 bytes, checksum: 16dd2b4c210960ba463863c566109f87 (MD5) / Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esta doença afeta de 15 a 16 milhões de pessoas na América Latina e, mesmo após um centenário de sua descoberta, ainda não se conseguiu desenvolver uma vacina e nem tratamentos totalmente eficazes. O presente trabalho apresenta a caracterização de uma arsenato redutase de T. cruzi. Esta enzima, apesar de ter significante homologia com fosfatases de dupla-especificidade, apresenta uma baixa capacidade de defosforilar o substrato p-nitrofenilfosfato. Quando testada em um sistema de oxi-redução, a PTP putativa de T. cruzi é capaz de reduzir o arsenato [As(V)] à arsenito [As(III)] e esta redução requer a presença da enzima glutaredoxina. Este é o primeiro trabalho que descreve uma arsenato redutase de T. cruzi. A fosfotirosina fosfatase YopH é um fator de virulência relevante na patogenicidade das bactérias Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. A YopH tem a capacidade de modular a resposta inflamatória à bactéria através de processos que envolvem a quebra de adesões focais, liberação de fator de necrose, inibição da fagocitose, além de também impedir a função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. Devido à sua importância, a YopH emerge como um potencial alvo terapêutico. Neste trabalho foram analisados 265 compostos sintéticos, dos quais 4 apresentaram valores de IC50 inferiores a 50 µM, sendo eles L46 (38,55 µM), P4 (15,08 µM), P11(9,92 µM) e R28 (20,29 µM). Estes compostos são chalconas e atuam como inibidores competitivos da YopH com Ki de 11,01 µM (L46), 3,13 µM (P4), 2,41 µM (P11) e 14,93 µM (R28). / Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. This illness affects 15 to 16 million people in Latin America and even after a century of its discovery,it has not managed to develop a vaccine and effective treatment. This work presents the characterization of an harsenate reductase from T. cruzi. This enzyme, despite having a significant homology with dual specificity phosphatases, has a low capacity to dephosphorylate the substrate p-nitrophenyl phosphate. When tested in an oxi-reduction system, the putative PTP from T. cruzi is able to reduce arsenate to arsenite and this reduction requires the presence of glutaredoxin. This is the first study that describes an arsenate reductase from T. cruzi. The phosphotyrosine phosphatase YopH is a relevant virulence factor in the pathogenicity of the bacteria Yersinia pestis; Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. YopH is able to modulate the inflammatory response to the bacteria through processes that involves the disruption of focal adhesion, release of tumor necrosis factor , inhibition of phagocytosis and also block the fuction of T and B lymphocyte preventing the adaptive immune response. Due to its importance, YopH emerges as a potencial therapeutic target. In this work, it was analysed 265 synthetic compounds, among these 4 presented IC50 values below 50 ìM which are L46 (38.55 ìM), P4 (15.08 ìM), P11(9.92 ìM) and R28 (20.29 ìM). These four compounds are chalcones and act as competitive inhibitors. They present the following Ki values: 11.01 ìM (L46), 3.13 ìM (P4), 2.41 ìM (P11) and 14.93 ìM (R28).

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:19:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015 / Proteínas tirosina fosfatases (PTP) têm um importante papel na transdução de sinal e no controle de diversas funções celulares. Bactérias patogênicas como as do gênero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as células de defesa do hospedeiro. As bactérias patogênicas do gênero Yersinia possuem em comum a produção de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatória do hospedeiro à bactéria através de processos que envolvem a inibição da fagocitose, quebra de adesões focais e subversão da função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenças humanas causadas pelas espécies patogênicas de Yersinia variam desde síndromes gastrointestinais à peste bubônica, sendo esta última uma doença grave que ainda não foi erradicada e é associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doença que afeta principalmente o trato respiratório. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose foi responsável por 1,5 milhões de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasão das células de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por função burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA é responsável por modular a apoptose celular e impedir a acidificação do fagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Já a PtpB, impede a produção de IL-6 e previne a morte do macrófago pela ativação da via de sinalização de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb é de grande interesse para a produção de possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenças provocadas por estas bactérias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 µM, sendo que 3 estão na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase até o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como não competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os três complexos de vanádio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se também a citotoxicidade em células THP-1 e HepG2 além da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratório em 2012. Identificou-se dois compostos que não são citotóxicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecção intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH além de 3 complexos de vanádio com uma marcante inibição em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se não citotóxico e com atividade nos ensaios de infecção intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.<br> / Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 µM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.

A Análise de Acoplamentos Estatísticos é uma técnica computacional capaz de identificar resíduos importantes para a estrutura e função de proteínas em uma família por meio da quantificação de conservação posicional, correlação entre posições e identificação de grupos de resíduos correlacionados entre si. Neste trabalho, a análise de acoplamentos estatísticos foi implementada e aplicada ao estudo das proteínas tirosina fosfatases. Em conjunto com as proteínas tirosina quinases (PTKs), que adicionam um grupo fosforil a um resíduo de tirosina em uma proteína, as proteínas tirosina fosfatases (PTPs), que o removem, são responsáveis por diversos processos de sinalização celular. Elas são um caso de evolução convergente, onde um subgrupo (as proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular) não apresenta homologia às chamadas PTPs \"clássicas\", capazes de defosforilar apenas resíduos de tirosina, e às fosfatases de especifidicade dupla, capazes de defosforilar também resíduos de serina e treonina, além de substratos não-protéicos. Em comum, as três subfamílias apresentam apenas o motivo CX5R, característico para todas as PTPs. Através do estudo das três subfamílias utilizando a análise de acoplamentos estatísticos, foi possível obter uma descrição detalhada de suas características conservadas e correlacionadas, relacionando-as ao conhecimento acumulado sobre proteínas tirosina fosfatases e a questões em aberto como a regulação por dimerização, a especificidade e mutações relacionadas a patologias. Foi possível também apresentar um método capaz de distinguir proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular das arsenato redutases, derivadas das primeiras por evolução divergente. Adicionalmente, a técnica foi aplicada ao estudo das hexoquinases, às superóxido dismutases e às peroxidases. A tese descreve também estudos desenvolvidos pelo autor na área de cristalografia de proteínas a determinação das estruturas da Transtirretina humana em complexo com genisteína, da holo-Hexoquinase PI de S. cerevisae, do complexo IL-22/IL-22R1 e da Laminarinase de R. marinus. / The statistical coupling analysis is a computational technique which can identify important residues for the structure and function of proteins in a family by quantifying positional conservation, correlation between positions and identifying groups of self-correlating residues. Its implementation in this research group was applied to the study of the protein tyrosine phosphatases. Together with the protein tyrosine kinases (PTKs), which add a phosphoryl group to a tyrosine residue in proteins, the protein tyrosine phosphatases (PTPs), which remove it, are responsible for a variety of cell signaling processes. They are a case of convergent evolution, since one subgroup (the low molecular weight protein tyrosine phosphatases) are not homologous to the classical phosphatases, which can only dephosphorilate tyrosine residues, and the dual-specificity phosphatases, which can also dephosphorilate serine and threonine residues, and also non-proteinaceous substrates. All three sub-families have, in common, the CX5R motif, a characteristic of all PTPs. By applying the statistical coupling analysis to the study of the three sub-families, it was possible to obtain a detailed depiction of their conserved and correlated characteristics, relating them to the accumulated knowledge on protein tyrosine phosphatases and open questions such as protein regulation by dimerization, specificity and disease-related mutations. It was also possible to present a method to distinguish between low molecular weight phosphatases and arsenate reductases, which are derived by the former by divergent evolution. In addition, the technique was applied to the study of hexokinases, superoxide dismutases and peroxidases. The thesis also describe studies developed by the author in the field of protein crystallography the structure determination of human transthyretin in complex with genistein, holo-hexokinase PI from S. cerevisae, the IL-22/IL-22R1 complex and the laminarinase from R. marinus.

A Análise de Acoplamentos Estatísticos é uma técnica computacional capaz de identificar resíduos importantes para a estrutura e função de proteínas em uma família por meio da quantificação de conservação posicional, correlação entre posições e identificação de grupos de resíduos correlacionados entre si. Neste trabalho, a análise de acoplamentos estatísticos foi implementada e aplicada ao estudo das proteínas tirosina fosfatases. Em conjunto com as proteínas tirosina quinases (PTKs), que adicionam um grupo fosforil a um resíduo de tirosina em uma proteína, as proteínas tirosina fosfatases (PTPs), que o removem, são responsáveis por diversos processos de sinalização celular. Elas são um caso de evolução convergente, onde um subgrupo (as proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular) não apresenta homologia às chamadas PTPs \"clássicas\", capazes de defosforilar apenas resíduos de tirosina, e às fosfatases de especifidicade dupla, capazes de defosforilar também resíduos de serina e treonina, além de substratos não-protéicos. Em comum, as três subfamílias apresentam apenas o motivo CX5R, característico para todas as PTPs. Através do estudo das três subfamílias utilizando a análise de acoplamentos estatísticos, foi possível obter uma descrição detalhada de suas características conservadas e correlacionadas, relacionando-as ao conhecimento acumulado sobre proteínas tirosina fosfatases e a questões em aberto como a regulação por dimerização, a especificidade e mutações relacionadas a patologias. Foi possível também apresentar um método capaz de distinguir proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular das arsenato redutases, derivadas das primeiras por evolução divergente. Adicionalmente, a técnica foi aplicada ao estudo das hexoquinases, às superóxido dismutases e às peroxidases. A tese descreve também estudos desenvolvidos pelo autor na área de cristalografia de proteínas a determinação das estruturas da Transtirretina humana em complexo com genisteína, da holo-Hexoquinase PI de S. cerevisae, do complexo IL-22/IL-22R1 e da Laminarinase de R. marinus. / The statistical coupling analysis is a computational technique which can identify important residues for the structure and function of proteins in a family by quantifying positional conservation, correlation between positions and identifying groups of self-correlating residues. Its implementation in this research group was applied to the study of the protein tyrosine phosphatases. Together with the protein tyrosine kinases (PTKs), which add a phosphoryl group to a tyrosine residue in proteins, the protein tyrosine phosphatases (PTPs), which remove it, are responsible for a variety of cell signaling processes. They are a case of convergent evolution, since one subgroup (the low molecular weight protein tyrosine phosphatases) are not homologous to the classical phosphatases, which can only dephosphorilate tyrosine residues, and the dual-specificity phosphatases, which can also dephosphorilate serine and threonine residues, and also non-proteinaceous substrates. All three sub-families have, in common, the CX5R motif, a characteristic of all PTPs. By applying the statistical coupling analysis to the study of the three sub-families, it was possible to obtain a detailed depiction of their conserved and correlated characteristics, relating them to the accumulated knowledge on protein tyrosine phosphatases and open questions such as protein regulation by dimerization, specificity and disease-related mutations. It was also possible to present a method to distinguish between low molecular weight phosphatases and arsenate reductases, which are derived by the former by divergent evolution. In addition, the technique was applied to the study of hexokinases, superoxide dismutases and peroxidases. The thesis also describe studies developed by the author in the field of protein crystallography the structure determination of human transthyretin in complex with genistein, holo-hexokinase PI from S. cerevisae, the IL-22/IL-22R1 complex and the laminarinase from R. marinus.