Le métabolisme de phase II est assuré par les UDP-glucuronosyltransférases (UGT), qui sont des enzymes régulant l'inactivation de nombreux médicaments et molécules endogènes. Cette voie métabolique est caractérisée par une variabilité interindividuelle significative, tant au niveau de l’expression génique qu’au niveau de l’activité de glucuronidation. La mesure des capacités de glucuronidation et la compréhension des mécanismes participant à cette variabilité dans les tissus humains sont un enjeu important. Cependant, le manque de spécificité des substrats des UGT, la grande similarité des séquences protéiques et le manque de corrélation entre l’expression en ARNm et en protéine, rend la mesure de la voie de glucuronidation difficile et complexe. En réponse à ces problèmes, des techniques de quantification des UGT par spectrométrie de masse ont été récemment développées. Il est alors possible de déterminer si les profils d’expression protéique des UGT ainsi obtenus par ces quantifications permettent de prédire le potentiel de glucuronidation dans les tissus humains. En plus d’une grande variabilité interindividuelle, mes travaux montrent que les profils d’expression protéique des UGT des tissus hépatiques et rénaux sont corrélés avec les activités de glucuronidation de quatre enzymes UGT pour lesquelles des substrats spécifiques sont connus. Par ailleurs, nous avons également démontré que la capacité de glucuronidation des tissus rénaux est fortement diminuée dans les tumeurs comparativement aux tissus normaux. Bien que de nombreux mécanismes de régulation des UGT aient été décrits, une fraction significative de la variabilité d’expression des ARNm, des protéines et de l’activité des UGT demeure inexpliquée et peut impliquer des mécanismes épigénétiques, tels que la régulation par microARN. Ainsi, nous avons identifié quatre microARN (miR-331, miR-376c, miR-409, et miR-494) comme des régulateurs potentiels des UGT2B15/2B17. Parmi ces microARN, nous avons mis en évidence l’implication de miR-376c dans la régulation de ces deux UGT, et déterminé que ces microARN pourraient influencer la biodisponibilité de la dihydrotestostérone (DHT) dans les cellules de cancer de la prostate in vitro et dans les tumeurs prostatiques de patients. / Phase II metabolism is conveyed by UDP-glucuronosyltransferases (UGT), which are enzymes regulating the inactivation of many drugs and endogenous molecules. This metabolic pathway is characterized by a significant interindividual variability at the level of gene expression and activity. The measurement of glucuronidation capacity and understanding of the mechanisms involved in this variability in human tissues are an important issue. However, the lack of substrate specificity for most UGT enzymes, the high similarity of their protein sequences and the lack of correlation between mRNA and protein expression complexifies accurate measurements of glucuronidation capacities in human tissues. To circumvent these issues, UGT quantification techniques by mass spectrometry have been recently developed. This allow us to determine whether expression patterns of UGT proteins, thus obtained by these quantifications, predict the potential of glucuronidation in human tissues. The results of our studies show a wide interindividual variability, but that the protein expression profiles of four UGT in liver and kidney tissues correlate with glucuronidation activities of their respective probe substrates. Furthermore, we also demonstrated that the glucuronidation capacity in tumor kidney tissues is greatly diminished relative to normal kidney tissues. Although many UGT regulatory mechanisms have been described, a significant part of their variability in mRNA, protein expression and activity remains unexplained and may involve epigenetic mechanisms, such as a regulation by microRNAs. Thus, we identified four microRNAs (miR-331, miR-376c, miR-409 and miR-494) as potential regulators of UGT2B15 / 2B17. Among these microRNAs, we have demonstrated the involvement of miR-376c in the regulation of UGT2B15 / 2B17, and determined that microRNAs could thus influence the bioavailability of dihydrotestosterone (DHT) in prostate cancer cells in vitro and prostatic tumors in vivo.

Les hormones stéroïdiennes jouent un rôle important dans le développement sexuel normal de l’homme et de la femme. Le développement et la progression de plusieurs cancers hormonaux-dépendants tels que le cancer du sein, des ovaires et de la prostate sont également influencés par la disponibilité des stéroïdes actifs et de leurs précurseurs gonadiques et surrénaliens. Les enzymes UDP- glucuronosyltransferase (UGT) font partie de la phase II du métabolisme des médicaments également impliqués dans l’inactivation des stéroïdes. Ces enzymes ont le potentiel de jouer un rôle important sur la biodisponibilité des stéroïdes aux niveaux tissulaire et circulant. Mes travaux portaient sur l’étude de la glucuronidation de précurseurs (13) impliqués dans la formation de la dihydrotestostérone (DHT) et de ses métabolites. Nous avons d’abord déterminé la formation de dérivés glucuronides (-G) de ces stéroïdes au foie, rein et intestin, démontrant la formation de stéroïde-G pour pratiquement tous ceux testés. Quinze enzymes UGT humaines ont été investiguées individuellement pour leur participation à la formation de ces stéroïdes-G. En plus de la sous-famille UGT2B déjà reconnue, l’UGT1A4 est parmi celle qui jouerait un rôle prédominant dans la conjugaison de la plupart des précurseurs surrénaliens et de l’androgène actif DHT, alors que l’enzyme UGT1A10 est active pour la formation de DHT-G et d’androstanediol-G. De plus, nos données indiquent que les isoformes variantes des enzymes UGT1A4 et UGT2B7, issues de polymorphismes génétiques fréquents (>5%) aux codons 24 (UGT1A4*2), 48 (UGT1A4*3) et 268 (UGT2B7*2), pourraient entrainer des variations hormonales significatives en affectant l’activité enzymatique de ces enzymes. Enfin, la mesure de certains de ces métabolites chez un groupe d’hommes et de femmes pré- et post–ménopausées, supporte la variabilité interindividuelle dans les niveaux circulants de stéroïdes-G, toutefois, un plus grand nombre de sujets sera nécessaire afin de déterminer si les variations génétiques des enzymes UGT impliquées sont en cause. / Steroid hormones play a critical role in the sexual development of both men and women. The development and progression of several hormono-dependent cancers such as breast, ovarian, uterine and prostate cancers are also influenced by the bioavailability of active steroids as well as their gonadal and adrenal precursors. UDP-glucuronosyltransferase enzymes represents phase II drug-metabolizing enzymes involved in the inactivation of steroids in addition to therapeutic drugs. Variability in this pathway has the potential to affect steroids bioavailability in tissues and in blood. My work focused on the study of glucuronidation of steroid precursors (13) of dihydrotestosterone (DHT) synthesis and its metabolites. We first determined whether glucuronide (-G) derivatives of these precursors are formed in the liver, kidney and intestine. Steroid–glucuronides (-G) were demonstrated for almost every steroids tested. Of the 15 human UGT enzymes tested individually, UGT1A4 is one of the most active towards adrenal precursors (dehydroepiandrosterone, androstanediol and progestogens) and the active androgen DHT, whereas UGT1A10 is active for DHT and androstanediol. In addition, our data indicate that the variant isoforms of UGT1A4 and UGT2B7 resulting from the presence of frequent genetic polymorphisms (>5%) at codons 24 (UGT1A4*2), 48 (UGT1A4*3) and 268 (UGT2B7*2), affect enzyme activity for steroid substrates. Finally, quantification of some of these glucuronide metabolites in a small group of men and pre- and post-menopausal women supports their formation and highlight a significant inter-individual variability in their circulating levels. Additional studies are required to determine whether genetic variations in UGT genes might explain a fraction of the observed variability.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2014-2015 / La réaction de glucuronidation prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases est une voie majeure du système de détoxification cellulaire qui influence la biodisponibilité de molécules endogènes et exogènes. Notre laboratoire a récemment découvert l’existence de nouvelles protéines UGT nommées i2 dérivées de l’épissage alternatif du gène UGT1A. Ces protéines sont dépourvues d’activité transférase. Nous avons démontré par immunohistochimie que les enzymes i1 et les protéines alternatives i2 sont coexprimées dans plusieurs tissus du tractus gastro-intestinal, ainsi que dans les mêmes types cellulaires de ces tissus. Les i2 sont localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) avec les i1, mais sont également présentes dans le cytosol. Étant donné la proximité physique des i1 et i2 au RE, nous avons généré des modèles cellulaires surexprimant différentes combinaisons d’enzymes i1 et de protéines i2. Nos données démontrent que la coexpression de ces deux types de protéines diminue l’activité de glucuronidation de 20 à 80 % dépendamment du substrat et de l’enzyme testés. Par co-immunoprécipitation, nous avons démontré que cette répression survient via l’interaction physique des i1 avec les i2. À l’inverse, l’augmentation de l’activité de glucuronidation suite à la répression des formes i2 endogènes a permis de confirmer ce rôle de modulateur négatif des i2. Il semble aussi que les i2 soient en mesure de moduler significativement l’activité UGT même lorsque leur niveau d’expression est inférieur à celui des i1, tel que retrouvé dans plusieurs tissus humains. Nos données supportent également l’influence de ces protéines alternatives sur la réponse pharmacologique. En effet, la répression de l’expression des i2 endogènes dans une lignée de cancer de côlon entraîne un avantage de survie sous traitement chimiothérapeutique. Enfin, l’identification de l’interactome tissulaire des isoformes des UGT1A démontre qu’elles ont le potentiel d’interagir avec des enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique et la migration cellulaire. Nos données supportent que les i2 ont même la capacité de modifier le potentiel migratoire de cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les i2 ont la capacité de moduler le stress oxydatif cellulaire, entre autres via l’interaction avec des protéines antioxydantes, telle la catalase. En conclusion, nos résultats démontrent que les protéines alternatives i2 auraient le potentiel de moduler le système de défense cellulaire à plusieurs niveaux, en plus d’influencer la réponse aux médicaments. / The glucuronidation reaction mediated by the UDP-glucuronosyltransferases (UGT) enzymes is a major pathway of cellular detoxification system and has a clear effect on xenobiotic and endobiotic bioavailability. We have recently discovered nine new UGT proteins, named i2, which are derived from UGT1A alternative splicing. Those proteins are devoid of transferase activity. Using immunohistochemistry, we have demonstrated that i1 enzymes and i2 alternative proteins are coexpressed in multiple tissues of the gastrointestinal tract and also in the same cell types. Alternative i2 are localized in the endoplasmic reticulum (ER) membrane along with i1, but are also detected in the cytosol. Given the physical proximity of i1 and i2 at the ER, we have generated cellular models overexpressing different combinations of enzymes and i2 alternative proteins. Our data revealed that coexpression of those two types of proteins leads to a decrease of 20 – 80 % of the glucuronidation activity depending on the substrate and enzyme tested. By co-immunoprecipitation experiments, we have demonstrated that this modulation occurs via the physical interaction of i1 and i2. We have confirmed the negative modulator function of i2 alternative proteins by RNA interference. Our results demonstrates that repression of endogenous i2 leads to a significant increase of cellular glucuronidation activity. Data also support the importance of expression ratio of i2 :i1. Indeed, even an expression of i2 below the level of i1, as found in several tissues, consistently resulted in a significant modulation of UGT activity. Our data also support the role of i2 alternative proteins on pharmacological response. Repression of endogenous i2 in a colon cancer cell line leads to an increased cell viability under chemotherapeutic treatment. Furthermore, identification of UGT1A endogenous interactome reveals their capacity to physically interact with protein implicated in energy metabolism and cell migration. Our data support that i2 alternative proteins have the capacity to modulate migration potential of cancer cells. We have also demonstrated that i2 alternative proteins are able to modulate cellular oxidative stress, in part via protein-protein interaction with anti-oxidant proteins, such as catalase. In conclusion, our results demontrate that i2 alternative proteins have the potential to modulate the cellular defense system at multiple levels in addition to influence pharmacological response.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019 / La voie métabolique de glucuronidation, impliquant les enzymes uridine diphospho-glucuronosyltransférases (UGT), joue un rôle crucial dans le métabolisme des médicaments et contrôle l’exposition à divers composés exogènes via leur inactivation par la conjugaison à l’acide glucuronique. Cette voie métabolique a également comme rôle principal de maintenir l’homéostasie cellulaire et le contrôle de la biodisponibilité de nombreuses molécules endogènes. Nombre de ces composés sont impliqués dans des boucles de rétroaction régulant l’expression et l’activité de diverses voies métaboliques cellulaires, notamment via l’implication de récepteurs nucléaires et autres voies de signalisation. Une modification de l’expression et de l’activité de la voie de glucuronidation a donc le potentiel d’influencer le métabolisme cellulaire, au-delà du contrôle des substrats des enzymes UGT. Cette hypothèse est appuyée par des observations préliminaires démontrant la capacité des UGT à interagir avec des protéines d’autres voies métaboliques, affectant ainsi leur activité. De plus, les études récentes du laboratoire font état d’un transcriptome étendu de la grande famille de gènes UGT, permettant la production de protéines alternatives comprenant de nouveaux domaines peptidiques et dont les fonctions et les réseaux d’interaction demeurent inconnus. Dans le cadre de cette thèse, nos premières investigations ont porté sur les changements métaboliques associés à une modification de l’expression cellulaire d’enzymes UGT, ainsi que de leurs protéines alternatives nouvellement identifiées. Une approche métabolomique non-ciblée a révélé des répercussions importantes au niveau métabolique, parfois communes, parfois divergentes, selon l’enzyme et l’isoforme alternative étudiée. À titre d’exemple, les niveaux cellulaires de lipides bioactifs comme l’acide arachidonique sont grandement affectés dans les lysats de cellules exprimant des enzymes UGT, alors qu’ils ne le sont pas dans les lysats de cellules exprimant des protéines alternatives. Dans une seconde série d’investigations, nous avons établi les réseaux d’interactions protéiques des UGT dans le tissu rénal et hépatique humain. À l’aide d’anticorps développés au laboratoire et dirigés contre les enzymes ou les protéines alternatives UGT, nous avons réalisé une purification d’affinité sur bille couplée à la spectrométrie de masse. Ceci a permis d’établir de façon non-biaisée les interactomes endogènes des enzymes UGT et de leurs protéines alternatives dans un environnement protéique physiologique, révélant l’existence de partenaires communs et de partenaires spécifiques. En plus d’identifier des protéines associées au métabolisme des médicaments, nos travaux ont révélé plusieurs partenaires protéiques impliqués dans d’autres voies métaboliques, telles que les voies énergétiques (glycolyse, cycle des acides tricarboxyliques, oxydation des lipides, etc.). À l’aide de modèles cellulaires, nous avons démontré que certaines de ces interactions sont fonctionnelles et entrainent une modification significative de l’activité du partenaire des UGT, induisant des perturbations métaboliques et phénotypiques associées à la progression tumorale. Enfin, nos données ont révélé une induction différentielle de l’expression d’une enzyme UGT et de ses variants alternatifs suite à un traitement pharmacologique, influençant possiblement l’activité cellulaire en réponse à ces stimuli. Nos travaux soutiennent une interconnexion entre le métabolisme de glucuronidation et le métabolisme cellulaire. Ils appuient également un rôle plus vaste et complexe des protéines UGT, impliquant notamment la production d’isoformes alternatives aux structures protéiques distinctes et possédant des fonctions régulatrices possiblement différentes de celles des enzymes. Ces travaux démontrent également des interactions protéiques avec diverses voies métaboliques, permettant sans doute de moduler la réponse cellulaire à divers stimuli tout en optimisant les ressources métaboliques de la cellule. / The glucuronidation pathway, catalyzed by uridine diphospho-glucuronosyltransferases (UGTs), is crucial for drug metabolism and controls the body’s exposure to several exogenous compounds by the conjugation of a glucuronic acid moiety leading to their inactivation. A main role for this pathway is also to controls cellular levels of several endogenous compounds in order to maintain homeostasis. Many of those compounds are involved in feedback loops and control the expression and activity of numerous metabolic pathways through the regulation of nuclear receptors and other signaling events. Altered expression or activity of the glucuronidation pathway thus has the potential to influence cellular metabolism, beyond UGT substrate regulation. This hypothesis is supported by preliminary observations showing that UGTs possess the capacity to interact with enzymes from other metabolic pathways, affecting their activity. Furthermore, recent studies from our laboratory exposed an extended transcriptome for UGT genes, producing new alternative proteins comprising new domains and for which the functions and interaction networks remain unknown. In the context of this work, our first investigations explored the metabolic alterations induced by a modification in the cellular levels of UGT enzymes, as well as selected novel alternative proteins. A non-targeted metabolomics approach uncovered significant metabolic alterations, sometimes common or divergent, depending on the enzyme and the alternative isoform. As an example, bioactive lipids such as arachidonic acid were among the most modulated metabolites in lysates of cells expressing UGT enzymes but remained unchanged in cells expressing alternate proteins. In a second set of investigations, we established the interaction networks of UGT proteins in human liver and kidney tissues. We used in-house antibodies directed against UGT enzymes or their alternative proteins to conduct affinity purification coupled to mass spectrometry. These assays exposed an unbiased endogenous interactome in a physiologically relevant protein environment, revealing common and specific partners to UGT enzymes and alternative isoforms. In addition to proteins involved in drug metabolism, our work uncovered numerous partners implicated in other metabolic routes such as energetic pathways (glycolysis, tricarboxylic acids cycle, lipid oxidation, etc.). Using cellular models, we showed some of these interactions had a functional impact on cellular activity of the protein partners, triggering metabolic alterations associated with tumor progression. Lastly, our data further support a differential expression of UGT enzymes and their alternative isoforms following treatment with pharmacological compounds that could lead to variable metabolic activity in response to stimuli. Our results demonstrate functional crosstalk between UGT proteins and cell metabolism. This works also supports an extended and rather complex role for UGTs, notably through the production of numerous alternative isoforms presenting different peptide structures and likely diverse regulatory functions. Our findings indicate that one of the underlying mechanisms is related to protein-protein interactions between UGTs and proteins of other metabolic routes, likely permitting a fine regulation of cell response to stimuli while optimizing metabolic resources.

Une dérégulation du métabolisme des androgènes peut induire de graves pathologies comme le CaP (CaP). Pour le traiter, on utilise la thérapie de déprivation en androgène (ADTh). Néanmoins, le CaP s’adaptant, les traitements deviennent inefficaces. Trouver de nouvelles cibles thérapeutiques est donc essentiel. Nous sommes intéressés par la glucuronidation via les enzymes UGT2B15 et UGT2B17, la voie majeure d’inactivation des androgènes. Ce projet de recherche avait deux objectifs. 1) déterminer comment l’expression des UGT2B15 et UGT2B17 est régulée in vivo et in vitro avec ou sans ADTh, 2) créer une souris transgénique confirmant in vivo le rôle d’UGT2B15 dans la biodisponibilité des androgènes. Nous avons donc étudié la glucuronidation des androgènes par les Ugt2bs de souris, avant d’y insérer le gène UGT2B15 avec son promoteur endogène. Nous montrons qu’UGT2B15, et non UGT2B17, est inhibée dans les CaP les plus avancés tandis que l’ADTh induit les 2 UGT2Bs. In vitro, cette induction contribue à l’efficacité de l’ADTh, mais in vivo seule l’augmentation d’UGT2B15 est durable alors que celle d’UGT2B17 est transitoire. Nous constatons que la glucuronidation murine des androgènes est due aux Ugt2bs hépatiques et rénales, moins importante chez les femelles et régulée par les androgènes. La souris est donc un bon modèle pour induire une UGT2B humaine dans la prostate murine. Notre souris transgénique montre une expression d’UGT2B15 exclusivement dans le foie mâle et contrôlée par les androgènes. UGT2B15 augmente la LH plasmatique tandis que dans les souris transgéniques castrées et traitées à la DHT, le poids global et celui des muscles sont altérés. En conclusion, UGT2B15 est une cible thérapeutique pour traiter le CaP. Avec UGT2B17, elle participerait déjà à l’efficacité de l’ADTh, bien que les 2 enzymes aient une régulation différentielle. Ainsi, l’induction transitoire d’UGT2B17 serait un biomarqueur pour la résistance à l’ADTh. L’importance d’UGT2B15 est démontrée avec nos souris transgéniques où une expression hépatique a un effet systémique sur le système endocrinien. Notre modèle constitue un modèle pour étudier in vivo les régulations d’UGT2B15 et son impact sur les androgènes et pourrait servir à tester des inducteurs de cet enzyme afin d'améliorer l’ADTh. / Disregulation of androgen metabolism leads to serious diseases such as prostate cancer (PCa). Androgen déprivation (ADTh) is a common approach to treat PCa. Although most patients initialy respond to the treatment, up to 80% will develop resistant tumors (CRPC). New therapeutic approaches are therefore urgently needed. Our work focused is glucuronidation by the human UGT2B15 and UGT2B17 enzymes, a major inactivation pathway for androgens. Two parallel strategies were devepopped. First, we analyzed how UGT2B15 and UGT2B17 expression regulated in vitro and in vivo, in PCa from patient treated or not with ADTh. Second, we have engineered mouse strain expressing the UGT2B15 human gene. These animals were used to study the role of UGT2B15 in vivo, in particularly how this enzyme affects androgen biodisponibility. Before establishing the transgenic models, we investigated the Ugt2b enzyme implicated in androgen glucuronidation in mice. We observed that UGT2B15, and not UGT2B17, is down-regulated in advanced and metastatic PCa and CRPC, while using ADTh up-regulated the 2 proteins in vivo. In vitro, this increase contributed to the anti-proliferative effect of ADTh but in vivo, UGT2B15 is stably induced while UGT2B17 was only transiently up-regulated. In mice, androgen glucuronidation is mainly observed with hepatic and renal tissues, while Ugt2b peripheral expression is almost undetectable. Moreover this Ugt2b expression is lower in female and controlled by androgen. In our transgenic mouse, human UGT2B15 is also expressed in male liver only, and likewise controlled by androgen. Its expression significantly increases LH plasma concentration, while castrated transgenic mice treated with DHT display altered body and muscle weight. In conclusion we demonstrated that UGT2B15 is a pharmacological target for PCa treatment. With UGT2B17, UGT2B15 contributes to improve ADTh but the 2 enzymes have a differential expression. So, UGT2B17 is a potential biomarker for the emergence of ADTh resistance. The important UGT2B15 function is demonstrated using our transgenic mice: a liver limited expression is enough to alter the endocrine regulation with a hepatic limited expression. Also, our mouse constitutes a model to study in vivo the UGT2B15 regulation and function, in example to identify a UGT2B15 inductor to improve ADTh.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / L'une des principales voies du métabolisme des médicaments est prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT). Nos récentes découvertes ont mis à jour l'existence de nouvelles protéines nommées isoformes 2 (i2) produites par épissage alternatif du gène UGT1A humain. Ces produits d'épissage ne possèdent pas d'activité enzymatique mais démontrent une distribution tissulaire similaire à celles des isoformes 1 actives. Les enzymes i 1 et les nouvelles formes i2 sont présentes notamment au foie, dans le tractus digestif et le rein et leur localisation subcellulaire est similaire. Par immunohistochimie, nous avons également pu observer leur présence dans les tissus tumoraux. Basé sur les profils d'expression tissulaire, nous avons démontré un impact significatif de l'expression hétérologue stable d'i2 sur la conjugaison de divers médicaments, en présence d'il. Nous avons établi diverses lignées cellulaires surexprimant différentes combinaisons d'il et i2. Une réduction significative de 20 à 82% de la production de metabolites glucuronides est observée en essais enzymatiques pour plusieurs substrats dont l'agent anticancéreux SN-38 et de l'immunosuppresseur MPA. Les expériences de co-immunoprécipitation supportent que cette répression survient via l'interaction directe des protéines il et i2 dans la membrane du reticulum endoplasmique, formant ainsi des complexes inactifs. La fonction répressive d'i2 sur l'activité UGT a en parallèle été validée par des expérimentations en cellules intactes visant la répression des isoformes i2 endogènes par interférence à l'ARN qui entraînaient pour leur part une augmentation significative de l'activité de glucuronidation. Ce phénomène pourrait donc avoir une importance physiologique et pharmacologique significative, alors que l'abondance relative des formes il et i2 interagissant sous la forme de complexes actifs (il-il) et inactifs il-i2) serait déterminante de l'activité de glucuronidation cellulaire. Nous avons également identifié la présence de sept nouvelles isoformes d'UGT2B4 qui sont inactives. Toutefois, la co-expression de trois d'entre elles avec la forme active classique d'UGT2B4 (il) provoque une diminution de l'activité de conjugaison. En conclusion, nos résultats démontrent que des événements d'épissage alternatif des gènes UGT humains influencent la voie de glucuronidation suggérant un mécanisme d'auto-régulation, et par conséquent pourraient modifier la susceptibilité et la réponse au traitement de plusieurs pathologies telles que le cancer.

**Problématique :** L'accumulation excessive des acides biliaires (AB) est incriminée dans la pathogénie de plusieurs maladies hépatiques et intestinales. Il a été démontré que la β-glucuronidation hépatique favorise l'élimination et la détoxification des AB. Cependant, l'action des enzymes β-glucuronidase (GUS) de la flore intestinale contrecarre ce processus d'inactivation. **Objectif :** Mettre en évidence l'action des enzymes GUS du microbiote intestinal sur les acides biliaires glucuronoconjugués (AB-G) et la possibilité du moduler cette action par des interventions nutritionnelles et pharmacologiques. **Méthodes :** Des essais enzymatiques *in vitro* dans des conditions expérimentales adaptées ont été réalisés sur différents groupes d'échantillons de fèces humaines, incluant des individus sains, des individus atteints de maladies hépatiques, ainsi que des échantillons de selles et contenus intestinaux de souris axéniques et conventionnelles, et des crottes de rats après diverses chirurgies bariatriques. De plus, deux molécules amoxapine et inhibiteur 1 de la β-glucuronidase ont été utilisés pour explorer *in vitro* leurs effets en tant qu'inhibiteurs GUS sur la réaction GUS-AB-G. En outre, l'effet d'une supplémentation de 50g/j de poudre de bleuet lyophilisée (PBL) pendant 8 semaines chez des adultes humains (n=24) sur cette réaction a également été caractérisé. **Résultats :** Le microbiote intestinal GUS (β-glucuronidase), provenant des échantillons testés, a la capacité de déconjuguer les AB-G avec des variations entre individus, entre genres et entre espèces. Les acides biliaires glucuronidés en position 24 (AB-24G) sont déconjugués de manière plus efficace que leurs analogues en position 3 et 6 (AB-3G, AB-6G). *In vitro* l'amoxapine a montré une inhibition plus marquée des enzymes GUS *d'E.coli*, humains et murins que l'inhibiteur 1 de la β-glucuronidase, avec une IC50 de 34.74 ±1.09 µM (IC50 ± SD) pour GUS d'*E.coli* envers β-MCA-24G. La supplémentation par PBL a diminué de manière significative (p<0.01) l'activité GUS envers les AB-G mais uniquement chez les hommes avec des changements dans les valeurs de Km et Vmax. **Conclusion :** Nos résultats confirment le rôle des enzymes GUS du microbiote intestinal dans la retoxification des AB et révèlent la possibilité de moduler cette activité. Cette modulation pourrait contribuer à établir ces enzymes comme une nouvelle cible pour potentialiser l'effet détoxifiant de la glucuronidation envers les AB et réduire leur toxicité. / **Background:** Excessive accumulation of bile acids (BA) is implicated in the pathogenesis of many hepatic and intestinal diseases. Hepatic glucuronidation has been shown to promote the elimination and detoxification of BA. However, the action of β-glucuronidase (GUS) enzymes in the intestinal flora counteracts this inactivation process. **Objective:** To demonstrate the action of GUS enzymes in the intestinal microbiota on bile acid glucuronides (BA-G) and the possibility of modulating this action through nutritional and pharmacological interventions. **Methods:** *In vitro* enzymatic assays under adapted experimental conditions were performed on different groups of human fecal samples, including healthy individuals, individuals with liver diseases, as well as stool samples and intestinal contents from germ-free and conventional mice, and rats fecal samples after various bariatric surgeries. Additionally, two molecules, amoxapine and β-glucuronidase inhibitor 1, were used to explore *in vitro* their effects as GUS inhibitors on the GUS-BA-G reaction. Furthermore, the impact of a supplementation of 50g/day of freeze-dried highbush blueberry powder (BBP) for 8 weeks in adult humans (n=24) on this reaction was also characterized. **Results:** The GUS (β-glucuronidase) enzymes of intestinal microbiota from the samples tested efficiently deconjugate BA-G with variations between individuals, genera, and species. Bile acid glucuronides at position 24 (BA-24G) are deconjugated more efficiently than their analogues at positions 3 and 6 (BA-3G, BA-6G). *In vitro*, amoxapine showed more marked inhibition of human, murine and *E.coli* GUS enzymes than β-glucuronidase inhibitor 1, with an IC50 of 34.74 ±1.09 µM (IC50 ± SD) for *E.coli* GUS towards β-MCA-24G. BBP supplementation significantly (p<0.01) decreased GUS activity towards BA-G but only in males with changes in Km and Vmax values. **Conclusion:** Our results confirm the role of β-glucuronidase (GUS) enzymes from the intestinal microbiota in the re-toxification of BA and reveal the potential to modulate this activity. This modulation could help establish these enzymes as a new target to enhance the detoxifying effect of glucuronidation towards BA and reduce their toxicity.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Problématique : La glucurono-conjugaison (glucuronidation) métabolise de nombreux composés exogènes et endogènes, notamment les acides biliaires (AB). Malgré leurs propriétés physiologiques, les AB sont cytotoxiques à concentration élevée, tel qu'observé dans le foie de patients souffrant de maladies cholestatiques. En catalysant le transfert du groupement glucuronosyle sur le substrat, les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT) facilitent l'élimination de ces molécules. Cette réaction est modulable, régulant ainsi la formation d'AB-glucuronides (AB-G). La glucuronidation des AB serait donc une potentielle cible anticholestatique. Cependant, son étude est limitée par l'absence d'un modèle animal caractérisé. Hypothèse :Nous posons l'hypothèse que, "comme chez l'Humain, la glucurono-conjugaison est une voie importante de détoxification des acides biliaires chez la souris, qu'elle intervient dans les organes du tractus digestif, qu'elle fait intervenir des enzymes spécifiques et qu'elle peut être modulée par des facteurs environnementaux et nutritionnels". Ainsi, les travaux de ce mémoire vise à valider la souris comme modèle adéquat afin d'investiguer le potentiel de cette réaction dans le cas des maladies cholestatiques auto-immunes du foie. Objectif : Ce mémoire vise à combler le manque de modèle animal en explorant la glucuronidation des AB chez la souris et en déterminant les contributions enzymatiques et tissulaires, ainsi que sa modulation par des facteurs diététiques et environnementaux. Méthodes : Un profilage d'AB-G a été effectué sur le foie, les contenus intestinaux et les fèces de souris de souche CD1-Elite. Des essais enzymatiques ont été réalisés en incubant les AB en présence de microsomes de cellules embryoniques rénales humaines (HEK)293 exprimant chacune des Ugt2b murines (Ugt2b1, 2b5, 2b34, 2b35, 2b36, 2b37, 2b38) ou d'homogénats de foie ou d'intestins de souris conventionnelles. Les modulations environnementales (diète et température) ont ensuite été déterminées par le traitement des souris C3H/HeJ par une diète faible en lipides ou hyperlipidique, avec des variations de température. Les AB-G ont été quantifiés par spectrométrie de masse. Résultats : L'acide β-muricholique-24G (β-MCA-24G) est l'AB-G le plus fréquemment retrouvé, et sa formation fait intervenir notamment le foie et le colon, principalement via l'isoforme Ugt2b37. La glucuronidation du β-MCA est augmentée dans le foie par une diète hyperlipidique et par une température d'hébergement élevée, alors que l'inverse est observé dans le colon. Conclusion : Ces analyses démontrent la contribution des Ugt2b, ainsi que le foie et le colon dans la glucuronidation des AB chez la souris, avec la modulation de la diète et température. Les résultats suggèrent que la souris pourrait servir de modèle adéquat pour l'étude de la glucuronidation des AB en tant que cible thérapeutique dans les maladies cholestatiques auto-immunes. / Background: The glucuronidation is a phase II reaction that metabolizes numerous exogenous and endogenous compounds, such as bile acids (BAs). Their amphipatic properties enhance intestinal lipid absorption, but renders them cytotoxic in high concentrations, as observed in cholestatic liver diseases where bile flow is impaired. By catalyzing the transfer of glucuronosyl group on the substrate, UDP-glucuronosyltransferases (UGT) enzymes allow elimination. This reaction can be modulated, thereby regulating BA-glucuronide (BA-G) formation. However, its understanding is limited by the lack of an adequate, fully characterized animal model. Objective: This MSc thesis aims to characterize enzymatic and tissular contributions to murine BA glucuronidation and its regulation through dietetic and environmental modulators. Hypothesis: Despite the fact that this reaction is well known in humans, the absence of a characterized animal model limits the exploitation of this reaction. Thus, the hypothesis of this thesis aims to validate the mouse as a suitable model to investigate the potential of BA glucuronidation as a therapeutic target in autoimmune cholestatic liver diseases. Methods: BA-G profiling was achieved on murine liver, intestinal contents, and feces. Enzymatic assays were performed by incubating BA-G precursors with microsomal fractions of human embryonic kidney (HEK)293 cells expressing each murine Ugt2b (Ugt2b1, 2b5, 2b34, 2b35, 2b36, 2b37, 2b38) or liver or intestinal homogenates from conventionally raised or treated mice. Environmental modulators (diet and temperature) were then determined by treating mice with a low-fat diet (LFD) or high-fat diet (HFD), exposing them to different temperatures. BA-G were quantified by mass spectrometry. Results: β-muricholic acid-24G (β-MCA-24G) was the most frequently detected BA-G, and its formation involves the liver and the colon, mainly from the Ugt2b37 enzyme. β-MCA glucuronidation increased with a HFD and with a higher captivity temperature. Conclusion: Our results assess the contribution of Ugt2bs, as well as liver and colon, to murine BA glucuronidation, and that diet and captivity temperature strongly regulate BA-G formation. The present study reveals that the mouse is a potential suitable model for the study of BA glucuronidation as a therapeutic trget for cholestatic liver disease.

Plusieurs pathologies sont liées à un excès de cholestérol, notamment l'athérosclérose et les maladies neurodegeneratives, telles que l'Alzheimer et le Parkinson. Le cérébrostérol (24S-hydroxycholestérol) constitue la principale forme d'élimination du cholestérol du cerveau et excrété au niveau du foie. Dans le foie, environ 50% du cérébrostérol est métabolisé en un dérivé glucuronidé et sulfaté. Par ailleurs, le cérébrostérol a aussi une fonction biologique comme activateur naturel des récepteurs nucléaires LXRa et p. Nos travaux avaient pour but de clarifier le rôle de la glucuronidation dans l'homéostasie et le contrôle de l'activité biologique du 24S-hydroxycholestérol. Nous avons identifié le 24S-hydroxycholestérol et le 24S-hydroxycholestérol-3-sulfate-24-glucuronide comme étant les metabolites circulants les plus abondants chez l'humain. Également, nous avons identifié l'enzyme UDP-glucuronosyltransferase (UGT)1A4 comme étant l'enzyme responsable de la glucuronidation du 24S-hydroxycholestérol. Enfin, nous avons mis en évidence l'effet positif de l'activation de LXRa sur l'expression hépatique d'UGT1A4, suggérant ainsi que le 24S-hydroxycholestérol est capable de réguler son propre métabolisme. Ces résultats permettent de mieux comprendre les processus moléculaires régissant le métabolisme et l'inactivation du 24S-hydroxycholestérol, et méritent d'être approfondis, afin de déterminer l'intérêt thérapeutique de la glucuronidation du cérébrostérol dans le cadre de traitements visant à réduire l'excès de cholestérol au cerveau.

Titre de l'écran-titre (visionné le 22 novembre 2023) / Problématique : La glucuronidation métabolise de nombreux composés exogènes et endogènes, notamment les acides biliaires (AB). Leur propriété amphipathique facilite l'absorption lipidique intestinale, mais les rend cytotoxiques à haute concentration, comme dans les maladies cholestatiques du foie où le flux biliaire est réduit. En catalysant le transfert du groupement glucuronosyle sur le substrat, les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (Ugt) facilitent l'élimination. Cette réaction est modulable, permettant ainsi réguler la formation d'AB-glucuronides (-G); la glucuronidation des AB serait donc une cible anticholestatique pour réduire leur concentration intrahépatique. Cependant, son étude est limitée par l'absence d'un modèle animal caractérisé. Hypothèse : La souris constitue un modèle potentiel pour l'étude de la glucuronidation des AB. Objectif : Ce mémoire vise à pallier ce manque en déterminant les contributions enzymatique et tissulaire de la glucuronidation des AB chez la souris et de sa modulation par une diète hyperlipidique et par la température. Méthodes : Un profilage bilacidomique-G a été effectué sur le foie, les contenus intestinaux et les fèces murins. Des essais enzymatiques ont été réalisés en incubant les AB libres en présence de microsomes de cellules embryoniques rénales humaines (HEK)293 exprimant chacune des Ugt2b murines (Ugt2b1, 2b5, 2b34, 2b35, 2b36, 2b37, 2b38) ou d'homogénats de foie ou d'intestin de souris de 4 souris/sexe. Les 7-8 souris/traitement étaient nourries d'une diète normale ou hyperlipidique durant 8 semaines et hébergées à une basse température (10 °C) ou plus élevée (30 °C) durant 4 semaines. Les AB-G ont été quantifiés par chromatographie liquide couplée à de la spectrométrie de masse. Résultats : L'acide β-muricholique-24G (β-MCA-24G) est l'AB-G le plus fréquemment retrouvé, et sa formation proviendrait notamment au foie et au côlon, principalement via l'isoforme Ugt2b37. La glucuronidation du β-MCA est augmentée par une diète hyperlipidique et par une température d'hébergement supérieure. Conclusion : Ces analyses démontrent la contribution des Ugt2b, ainsi que du foie et du côlon, pour la glucuronidation des AB chez la souris. La diète et la température d'hébergement régulent leur glucuronidation par des Ugt spécifiques. Les résultats indiquent que la souris est un modèle animal potentiel pour l'étude de cette cible anticholestatique. / Background: The glucuronidation reaction metabolizes numerous exogenous and endogenous compounds, such as bile acids (BAs). Their amphipathic property enhances intestinal lipid absorption, but renders them cytotoxic in high concentrations, as observed in cholestatic liver diseases where bile flow is impaired. By catalyzing the transfer of the glucuronosyl group on the substrate, UDP-glucuronosyltransferases (Ugt) enzymes allow elimination. This reaction can be modulated, thereby regulating BA-glucuronide (BA-G) formation. However, its understanding is limited by the lack of an animal model fully characterized. Hypothesis: Mouse could serve as a potential model for the study of BA glucuronidation. Objective: This MSc thesis aims to characterize enzymatic and tissular contributions to murine BA glucuronidation and its regulation through dietetic and environmental modulators. Methods: BA-G profiling was achieved on murine liver, intestinal contents, and feces. Enzymatic assays were performed by incubating BA-G precursors with microsomal fractions of human embryonic kidney (HEK)293 cells expressing each murine Ugt2b (Ugt2b1, 2b5, 2b34, 2b35, 2b36, 2b37, 2b38) or liver or intestinal homogenates from conventionally raised or treated mice. Evaluated treatments included a high-fat diet and temperature modulation. BA-Gs were quantified by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Results: β-muricholic acid-24G (β-MCA-24G) was the most frequently detected BA-G, and its formation involves the liver and the colon, mainly from the Ugt2b37 enzyme. β-MCA glucuronidation increased with a high-fat diet and with a higher captivity temperature. Conclusion: Our results assess the contribution of Ugt2bs, as well as liver and colon, to murine BA glucuronidation, and that diet and captivity temperature strongly regulate BA-G formation. The present study reveals that the mouse is a potentially suitable model for studying BA glucuronidation as a therapeutic target for cholestatic liver diseases.