Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine. / The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Techn. Hochsch., Diss., 2002--Aachen.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt um der Immunantwort eines Wirtes zu entkommen und eine persistente Infektion innerhalb dessen aufrechtzuerhalten. Ein zentrales Element seiner Verteidigungsstrategie stützt sich auf die Schutzfunktion seines Proteinmantels auf der Zelloberfläche. Dieser Mantel besteht aus einer dichten Schicht aus identischen, Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten variablen Oberflächenglykoproteinen (VSG). Der VSG Mantel verhindert die Erkennung der darunterliegenden, invarianten Epitope durch das Immunsystem. Obwohl es notwendig ist die Funktionsweise des VSG Mantels zu verstehen, vor allem um ihn als mögliches Angriffsziel gegen den Parasiten zu verwenden, sind seine biophysikalischen Eigenschaften bisher nur unzureichend verstanden. Dies ist vor allem der Tatsache geschuldet, dass die hohe Motilität der Parasiten mikroskopische Studien in lebenden Zellen bisher weitestgehend verhinderten. In der vorliegenden Arbeit wird nun hochmoderne Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie (EMFM) als Möglichkeit für mikroskopische Untersuchungen im Forschungsbereich der Trypanosomen vorgestellt. Die Arbeit umfasst Untersuchungen der VSG Dynamik unter definierten Bedingungen künstlicher Membransysteme. Es wurde zuerst der Einfluss der lateralen Proteindichte auf die VSG Diffusion untersucht. Experimente mittels Fluoreszenz- Wiederkehr nach irreversiblem Photobleichen und komplementäre Einzelmolekül- Verfolgungs Experimente offenbarten, dass ein molekularer Diffusionsschwellenwert existiert. Über diesem Schwellenwert wurde eine dichteabhänige Reduzierung des Diffusionskoeffizienten gemessen. Eine relative Quantifizierung der rekonstituierten VSGs verdeutlichte, dass der Oberflächenmantel der Trypanosomen sehr nahe an diesem Schwellenwert agiert. Der VSG Mantel ist optimiert um eine hohe Proteindichte bei gleichzeitiger hoher Mobilität der VSGs zu gewährleisten. Des Weiteren wurde der Einfluss der VSG N-Glykosylierung auf die Diffusion des Proteins quantitativ untersucht. Die Messungen ergaben, dass die N-Glykosylierung dazu beiträgt eine hohe Mobilität bei hohen Proteindichten aufrechtzuerhalten. Eine detaillierte Analyse von VSG Trajektorien offenbarte, dass zwei unterschiedliche Populationen frei diffundierender VSGs in der künstlichen Membran vorlagen. Kürzlich wurde entdeckt, dass VSGs zwei strukturell unterschiedliche Konformationen annehmen können. Die Messungen in der Arbeit stimmen mit diesen Beschreibungen überein. Die Ergebnisse der EMFM in künstlichen Membranen wurden durch VSG Einzelmolekül- Verfolgungs Experimente auf lebenden Zellen ergänzt. Es wurde eine hohe Mobilität und Dynamik einzelner VSGs gemessen, was die allgemein dynamische Natur des VSG Mantels verdeutlicht. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass der VSG Mantel auf lebenden Trypanosomen ein dichter und dennoch dynamischer Schutzmantel ist. Die Fähigkeit der VSGs ihre Konformation flexibel anzupassen, unterstützt das Erhalten der Fluidität bei variablen Dichten. Diese Eigenschaften des VSG Mantels sind elementar für die Aufrechterhaltung einer presistenden Infektion eines Wirtes. In dieser Arbeit werden des Weiteren verschiedene, auf Hydrogel basierende Einbettungsmethoden vorgestellt. Diese ermöglichten die Zellimmobilisierung und erlaubten EMFM in lebenden Trypanosomen. Die Hydrogele wiesen eine hohe Zytokompatibilität auf. Die Zellen überlebten in den Gelen für eine Stunde nach Beginn der Immobilisierung. Die Hydrogele erfüllten die Anforderungen der Superresolution Mikroskopie (SRM) da sie eine geringe Autofluoreszenz im Spektralbereich der verwendeten Fluorophore besaßen. Mittels SRM konnte nachgewiesen werden, dass die Hydrogele die Zellen effizient immobilisierten. Als erstes Anwendungsbeispiel der Methode wurde die Organisation der Plasmamembran in lebenden Trypanosomen untersucht. Die Untersuchung eines fluoreszenten Tracers in der inneren Membranschicht ergab, dass dessen Verteilung nicht homogen war. Es wurden spezifische Membrandomänen gefunden, in denen das Molekül entweder vermehrt oder vermindert auftrat. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass diese Verteilung durch eine Interaktion des Tracers mit Proteinen des zellulären Zytoskeletts zustande kam. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse zeigen, dass EMFM erfolgreich für verschiedene biologische Untersuchungen im Forschungsfeld der Trypanosomen angewendet werden kann. Dies gilt zum Beispiel für die Untersuchung von der VSG Dynamik in künstlichen Membransystemen, aber auch für Studien in lebenden Zellen unter Verwendung der auf Hydrogelen basierenden Zelleinbettung. / The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to escape the host immune response and maintain a persistent infection inside a host. One central feature of the parasite’s defense mechanism relies on the shielding function of their surface protein coat. This coat is composed of a dense arrangement of one type of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored variant surface glycoproteins (VSGs) which impair the identification of epitopes of invariant surface proteins by the immune system. In addition to the importance of understanding the function of the VSG coat and use it as a potential target to efficiently fight the parasite, it is also crucial to study its biophysical properties as it is not yet understood sufficiently. This is due to the fact that microscopic investigations on living trypanosomes are limited to a great extent by the intrinsic motility of the parasite. In the present study, state-of-the-art single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) is introduced as a tool for biophysical investigations in the field of trypanosome research. The work encompasses studies of VSG dynamics under the defined conditions of an artificial supported lipid bilayer (SLB). First, the impact of the lateral protein density on VSG diffusion was systematically studied in SLBs. Ensemble fluorescence after photobleaching (FRAP) and complementary single-particle tracking experiments revealed that a molecular crowding threshold (MCT) exists, above which a density dependent decrease of the diffusion coefficient is measured. A relative quantification of reconstituted VSGs illustrated that the VSG coat of living trypanosomes operates very close to its MCT and is optimized for high density while maintaining fluidity. Second, the impact of VSG N-glycosylation on VSG diffusion was quantitatively investigated. N-glycosylation was shown to contribute to preserving protein mobility at high protein concentrations. Third, a detailed analysis of VSG trajectories revealed that two distinct populations of freely diffusing VSGs were present in a SLB, which is in agreement with the recent finding, that VSGs are able to adopt two main structurally distinct conformations. The results from SLBs were further complemented by single-particle tracking experiments of surface VSGs on living trypanosomes. A high mobility and free diffusion were measured on the cell surface, illustrating the overall dynamic nature of the VSG coat. It was concluded that the VSG coat on living trypanosomes is a protective structure that combines density and mobility, which is supported by the conformational flexibility of VSGs. These features are elementary for the persistence of a stable infection in the host. Different hydrogel embedding methods are presented, that facilitated SMFM in immobilized, living trypanosomes. The hydrogels were found to be highly cytocompatible for one hour after cross-linking. They exhibited low autofluorescence properties in the spectral range of the investigations, making them suitable for super-resolution microscopy (SRM). Exemplary SRM on living trypanosomes illustrated that the hydrogels efficiently immobilized the cells on the nanometer lever. Furthermore, the plasma membrane organization was studied in living trypanosomes. A statistical analysis of a tracer molecule inside the inner leaflet of the plasma membrane revealed that specific membrane domains exist, in which the tracer appeared accumulated or diluted. It was suggested that this distribution was caused by the interaction with proteins of the underlying cytoskeleton. In conclusion, SMFM has been successfully introduced as a tool in the field of trypanosome research. Measurements in model membranes facilitated systematic studies of VSG dynamics on the single-molecule level. The implementation of hydrogel immobilization allowed for the study of static structures and dynamic processes with high spatial and temporal resolution in living, embedded trypanosomes for the first time.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 2007 / Hergestellt on demand. - Auch im Internet unter der Adresse http://uvka.ubka.uni-karlsruhe.de/shop/isbn/978-3-86644-216-0 verfügbar

Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 2007

Zur Kontrolle und Steigerung der Fruchtbarkeitsleistung von hochleistenden Milchkühen muss eine frühzeitige, sichere Methode zur Feststellung einer Trächtigkeit erfolgen. Neben der transrektalen Ultraschalldiagnostik als direkte Methode gibt es hierzu über den Nachweis boviner trächtigkeitsassoziierter Glykoproteine (bovine Pregnancy Associated Glycoproteins = bPAGs) eine indirekte, genauso früh einsetzbare Methode. Über einen Hauptversuch sollten die Praktikabilität sowie die Sensitivität und Spezifität eines laborungebundenen blutbasierten bPAG-Trächtigkeitstests unter Feldbedingungen ermittelt werden. In Teilversuchen sollten die Haltbarkeit des bPAG in kühl- und gefriergelagerten Proben beurteilt werden. Zudem sollten die Testergebnisse von unbesamten Kühen post partum (p.p.) und früh wiederbesamten Kühen unter 60 Tagen p.p. vor dem Hintergrund vorliegender Rest-bPAG-Mengen der zurückliegenden Trächtigkeit analysiert werden. Im Hauptversuch befanden sich von Juli bis Dezember 2014 109 Kühe zweier Betriebe in Mecklenburg Vorpommern. Voraussetzung war, dass sich die Tiere mindestens 60 Tage p.p. befanden, um falsch positive Ergebnisse durch noch im Blut zirkulierende bPAGs der zurückliegenden Trächtigkeit auszuschließen. Bei dem zu validierenden „IDEXX Visual Pregnancy Test“ handelt es sich um einen indirekten Antigen-Capture ELISA, welcher bPAGs im Blutserum oder im EDTA-Plasma tragender Rinder nachweist. Verlässliche Ergebnisse sind laut Herstellerangabe erstmalig ab 28 Tagen post inseminationem (p.i.) möglich. Die Testergebnisse werden visuell im Vergleich mit parallel angesetzten Positiv- und Negativkontrollen zugeordnet. Als Goldstandard wurde in der Feldstudie bei jedem Tier eine erste Trächtigkeitsuntersuchung 28 Tage p.i., eine zweite 35 Tage und eine dritte nach dem 45. Tag p.i. mit transrektaler Sonografie vorgenommen. Während der ersten beiden Befundungen erfolgte eine Blutprobenentnahme aus der V. caudalis mediana und eine Untersuchung mit dem „IDEXX Visual Pregnancy Test“. Eine dritte Blutprobenentnahme (>45 Tage p.i.) wurde veranlasst, sofern das Testergebnis am Tag 35 nicht mit dem Ergebnis der transrektalen Sonografie übereinstimmte bzw. die visuelle Zuordenbarkeit des Testergebnisses nicht eindeutig möglich war. Im Hauptversuch lag die Trächtigkeitsrate bei 51,4% (56 von 109) und 48,6% (53 von 109) nicht tragenden Tieren. Alle 56 mittels transrektaler Sonografie als tragend diagnostizierten Kühe wurden ohne Ausnahme korrekt vom Trächtigkeitstest ebenfalls als positiv getestet. Folglich betrug die Sensitivität des Tests 100%. Bei 48 von 53 sonografisch nicht für tragend befundenen Tieren stimmte dies mit dem bPAG-Bluttest überein. Fünf Probandinnen wiesen 28 Tage p.i. ein falsch positives Testergebnis auf, welches bei zwei Kühen auch bei der dritten Testdurchführung am 47. bzw. am 49. Tag p.i. unverändert eine Trächtigkeit falsch anzeigte. Somit betrug die Spezifität 90,6%. Des Weiteren wurden Gütekriterien-Validationen mittels positivem und negativem prädiktivem Wert sowie über das positive und negative Wahrscheinlichkeitsverhältnis und die Genauigkeit durchgeführt. Es resultierten jeweils sehr gute Werte hieraus. Die Teilversuche ergaben eine gute Haltbarkeit des bPAG auch bei vorheriger Kühl- oder Gefrierlagerung der Blutproben. Die bPAG aus der zurückliegenden Trächtigkeit blieben teils bis einschließlich Tag 55 p.p. nachweisbar. Der Zeitaufwand für den Bluttest betrug mindestens 175 Minuten pro Testdurchlauf; davon fielen 105 Minuten auf die eigentliche Testdurchführung. Je kleiner die Probenanzahl pro Testserie, desto teurer wird jeder einzelne Trächtigkeitstest pro Tier aufgrund der jeweils doppelt mit anzusetzenden Positiv- und Negativkontrollen. Der Trächtigkeitstest ist somit nur für größere Tierarztpraxen geeignet, die die nötige personelle Ausstattung und eine genügend große Anzahl an Trächtigkeitsuntersuchungen pro Testdurchlauf garantieren können. Aufgrund in Frage kommender falsch positiver Ergebnisse, aller Voraussicht nach dem späten embryonalen Fruchttod zuzuschreiben, wird eine direkte manuelle und/oder transrektal sonografische Nachuntersuchung zumindest aller am 28. Tag p.i. positiv getesteten Kühe nach dem 45. Tag p.i. für zwingend notwendig erachtet.