Glycine receptors (GlyRs) are essential for fast inhibitory neurotransmission in the mammalian central nervous system. GlyRs form pentameric ligand-gated chloride channels and consist either of α subunits as homomers located at presynapses and extrasynaptic sites or of α and β subunits as heteromers located at the postsynapse via binding of the GlyR β subunit to the scaffold protein gephyrin. Failure in glycinergic inhibition leads to moto-neurological diseases. While mutations in genes (GLRA1, GLRB) encoding GlyR subunits are associated with hyperekplexia (startle disease), autoantibodies (aAbs) targeting GlyRs elicit the autoimmune diseases Stiff Person Syndrome (SPS) and progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus (PERM). In these diseases, symptoms are variable including excessive startle and stiffness in limb muscles. Hyperekplexia mutations directly interfere with ion channel functions or prevent correct receptor folding and trafficking to the membrane. In SPS, binding of GlyR aAbs leads to internalisation of receptors or directly impairs receptor function. The diseases can be treated symptomatically, but not all patients respond well to treatment options. This thesis provides further insights in hyperekplexia and SPS pathology. The involvement of the GlyR β subunit in hyperekplexia was investigated by characterisation of three novel missense mutations in GLRB: Y252S, S321F and A455P. We identified loss- or gain-of-function in combination with reduced synaptic localisation of mutated GlyRs eliciting the phenotype in patients. Furthermore, the role of unaffected GlyR β in the presence of GLRA1 mutations in mouse models for hyperekplexia carrying a missense mutation (shaky) or completely lacking GlyR α1 (oscillator) was investigated. While synaptic targeting of GlyR β was unaltered, different compensatory mechanisms were found in the mutant mice. In shaky animals, functionally impaired GlyR α1 gets transported to membranes together with GlyR β. In oscillator mice, overexpression of GlyR α2 was found to possibly compensate for the missing GlyR α1. However, compensation remains functionally insufficient in both mouse mutants. In SPS/PERM, novel targeted sites of GlyR aAbs were identified. Screening of 58 patient sera revealed autoimmune reactivity against the GlyR β subunit. Binding and specificity of aAbs to GlyR β was verified with recombinant cells, peptide microarrays, primary spinal cord neurons and tissue. Functional consequences of GlyR β aAbs differ from those of GlyR α1 aAbs. In contrast to reduced glycine potency upon binding of aAbs to GlyR α1, GlyR β aAbs decrease receptor efficacy for glycine. In addition, GlyR aAbs were shown to bind presynaptic homomeric GlyR α. We established a novel protocol to specifically culture interneurons from murine spinal cords and analysed binding of GlyR aAbs to pre- and postsynaptic sites with super-resolution microscopy. Binding to presynapses could thereby demonstrate novel insights on disease pathology mechanisms. Specification of individual targeting profiles of aAbs in SPS/PERM patients will help to further understand phenotypic differences and to develop new and more personalized treatment approaches. / Glyzin Rezeptoren (GlyR) sind essentiell für schnelle inhibitorische Neurotransmission im zentralen Nervensystem von Säugetieren. GlyR formen pentamere, Liganden-gesteuerte Chlorid Kanäle und bestehen entweder aus α Untereinheiten als Homomere lokalisiert an der Präsynapse oder extrasynaptischen Seiten oder aus α und β Untereinheiten als Heteromere lokalisiert an der Postsynapse durch Bindung von der GlyR β Untereinheit an das Gerüst-Protein Gephyrin. Versagen von glyzinerger Inhibition führt zu moto-neurologischen Krankheiten. Während Mutationen in Genen (GLRA1, GLRB) welche GlyR Untereinheiten codieren in Verbindung mit Hyperekplexie (engl. startle disease) gebracht werden, führen Autoantikörper (aAb, vom engl. autoantibody) gegen den GlyR zu den autoimmun Krankheiten Stiff Person Syndrome (SPS) und progressive Enzephalomyelitis mit Steifheit und Myoklonus (PERM, vom engl. progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus). Symptome dieser Krankheiten sind variabel und beinhalten übermassiges Erschrecken und Steifheit in Muskeln der Gliedmaßen. Hyperekplexie Mutationen beeinträchtigen direkt die Ionenkanal Funktion oder verhindern die korrekte Rezeptorfaltung und den Transport zur Membran. Bindung von GlyR aAb in SPS führen zur Internalisierung der Rezeptoren oder beschädigen direkt die Rezeptorfunktion. Die Krankheiten sind symptomatisch behandelbar aber nicht alle Patienten reagieren gut auf die Behandlungsoptionen. Diese Arbeit liefert weitere Kenntnisse in der Pathologie von Hyperekplexie und SPS. Die Beteiligung der GlyR β Untereinheit in Hyperekplexie wurde untersucht indem drei neue GLRB missense-Mutationen, Y252S, S321F und A455P, charakterisiert wurden. Wir identifizierten Funktionsverlust oder -gewinn in Kombination mit reduzierter synaptischer Lokalisation von mutierten GlyR als Auslösung der Phänotypen in Patienten. Darüber hinaus untersuchten wir die Rolle von unbeeinträchtigtem GlyR β in Gegenwart von GLRA1 Mutationen in Mausmodellen für Hyperekplexie welche eine missense-Mutation (shaky) tragen oder in welchen GlyR α1 komplett fehlt (oscillator). Während die synaptische Binding von GlyR β unverändert war, fanden wir verschiedene Kompensationsmechanismen in den mutierten Mäusen. In shaky Tieren werden funktionell gestörte GlyR α1 zusammen mit GlyR β zur Membran transportiert. In oscillator Mäusen wurde eine Überexpression von GlyR α2 festgestellt welche möglicherweise das fehlende GlyR α1 kompensiert. Allerdings verbleibt die Kompensation in beiden Mäuse-Mutanten funktionell unzureichend. In SPS/PERM identifizierten wir neue Bindungsziele von GlyR aAb. Screening von 58 Patientenseren enthüllte eine autoimmune Reaktivität gegen GlyR β. Bindung und Spezifizität von aAb gegen GlyR β wurde mit rekombinanten Zellen, Peptid Mikro-arrays, primären Rückenmarksneuronen und -gewebe überprüft. Funktionelle Konsequenzen von GlyR β aAb unterschieden sich von GlyR α1 aAb. Im Kontrast zu reduzierter Wirksamkeit von Glyzin nach Bindung von aAb an GlyR α1, verringern GlyR β aAb die Effizienz von Glyzin. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass GlyR aAb an präsynaptische, homomere GlyR α binden. Wir etablierten ein neues Protokoll, um spezifische Interneuronen-Kulturen von murinen Rückenmärkern zu kultivieren und analysierten die Bindung von GlyR aAb an prä- und postsynaptische Seiten mit hochauflösender Mikroskopie. Bindung an Präsynapsen kann dabei neue Einblicke über die Mechanismen der Krankheitspathologie aufzeigen. Spezifizierung von individuellen Bindungsprofilen von aAb in SPS/PERM Patienten wird dabei helfen die phänotypischen Unterschiede mehr zu verstehen und neue, personalisierte Behandlungsansätze zu entwickeln.

γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren vom Typ A (GABAARs) und Glyzin-Rezeptoren (GlyRs) sind die wichtigsten Vermittler der schnellen synaptischen Inhibition im zentralen Nervensystem. Von wesentlicher Bedeutung für ihre ordnungsgemäße Funktion in der inhibitorischen Signalübertragung ist ihre präzise Lokalisation und Konzentration innerhalb der neuronalen Oberflächenmembran. Diese Eigenschaften werden durch Gerüstproteine vermittelt, welche direkt an die großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren, sowie an Bausteine des neuronalen Zytoskeletts binden. In meiner Dissertation habe ich die molekularen Details mehrerer zugrunde liegenden Protein-Protein Wechselwirkungen untersucht. Im Speziellen habe ich die Interaktion ausgewählter GABAAR und GlyR Untereinheiten mit den Gerüstproteinen Gephyrin, Radixin und Collybistin analysiert. Ich habe kurze lineare Aminosäuren-Motive innerhalb der großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren identifiziert, welche die direkten und Untereinheit-spezifischen Interaktionen vermitteln. Die Quantifizierung der jeweiligen Bindungsstärke ergab, dass Gephyrins E-Domäne vor allem an die GABAAR α1 (Kd = 17 M) und α3 (Kd = 5 M) -Untereinheiten bindet, wohingegen die SH3-Domäne von Collybistin hauptsächlich mit der GABAAR α2-Untereinheit interagiert (Kd = 1 M). Demgegenüber bindet die FERM-Domäne von Radixin fest an die α5-Untereinheit des GABAAR (Kd = 8 µM). Weiterhin zeigt meine Arbeit, dass diese einfache Beziehung durch (i) fehlende oder (ii) überlappende Bindungsspezifitäten zwischen den Gerüstproteinen und den Rezeptor-Untereinheiten komplex reguliert wird. Ferner beschreibe ich hier, wie im Folgenden ausgeführt, die Möglichkeit einer (iii) negativen Modulation mittels posttranslationaler Modifikation, sowie einer Verstärkung der Bindung durch (iv) Aviditäts-Effekte. (i) Als erstes habe ich mit Hilfe biochemischer Methoden die Radixin-GABAAR α5 Interaktion im Detail untersucht. Meine Strukturanalyse und Kompetitionsstudien legen den Schluss nahe, dass Radixin die betreffende Rezeptor-Untereinheit mittels einer universellen Bindungstasche in der F3 Subdomäne innerhalb seiner FERM Domäne bindet. Diese Bindungsstelle wird durch zwei markante Strukturelemente gebildet: Einer α-Helix, die eine große hydrophobe Tasche bildet, welche eine Vielzahl unterschiedlicher hydrophober Reste in verschiedenen Konformationen akzeptiert, sowie ein β-Strang, der Peptidrückgrat-Interaktionen eingehen kann. Es überrascht nicht, dass eine Vielzahl an Studien die Beteiligung dieser Bindungsseite mit unterschiedlichen Liganden beschrieben hat. Diese Promiskuität unterstreicht die Bedeutung des Aktivierungsmechanismus der zuvor für die Radixin FERM GABAAR α5-Untereinheit beschrieben wurde und impliziert weitere Regulationsmechanismen, die eine koordinierte Interaktion in vivo ermöglichen. (ii) Weiterhin habe ich mich ausführlich der Analyse der Gephyrin-vermittelten GABAAR Clusterbildung gewidmet. Meine röntgenkristallographischen Studien und Bindungsstudien zeigen, dass Gephyrin mit den GABAAR α1, α2 und α3 Untereinheiten über eine universelle Bindungsstelle interagiert, welche auch die Wechselwirkungen mit der β-Untereinheit des GlyR vermittelt. Mittels Struktur-basierter Mutagenesestudien konnte ich die Schlüsselreste innerhalb von Gephyrin und der Rezeptor-Untereinheiten identifizieren, die einen entscheidenden Beitrag zur Gesamt-Bindungsstärke liefern. Insbesondere zwei konservierte aromatische Reste in der N-terminalen Hälfte der Rezeptorbindungsregion gehen entscheidende hydrophobe Wechselwirkungen mit Gephyrin ein. Dementsprechend konnte J. Mukherjee, ein Mitarbeiter in der Gruppe unseres Kooperationspartners Steven J. Moss, zeigen, dass der Austausch dieser Reste innerhalb der α2-Untereinheit des GABAAR ausreicht, um einen deutlichen Rückgang der Rezeptor Cluster-Anzahl und ihrer Größe in primären hippokampalen Neuronen zu verursachen. Die Ausweitung meiner Rezeptor-Interaktions-Studien auf Collybistin (CB) ergab, dass dieses Protein im Vergleich zu Gephyrin eine umgekehrte, aber dennoch überlappende Rezeptor-Untereinheiten-Präferenz aufweist. Die GABAAR α3-Untereinheit bindet ausschließlich an Gephyrin (Kd = 5 µM), während die GABAAR α1-Untereinheit zwar vor allem Gephyrin bindet (Kd = 17 µM), zusätzlich jedoch eine schwache Affinität (Kd ≈ 400 µM) für die SH3-Domäne von CB aufweist. Im Gegensatz dazu bindet die GABAAR α2-Untereinheit hochaffin an die SH3-Domäne von CB (Kd = 1 µM) und zeigt zusätzlich eine schwache Gephyrin Affinität (Kd ≈ 500 µM). Interessanterweise konnte ich Synergieeffekte zwischen der GABAAR α2-Untereinheit, Gephyrins E-Domäne und CBs SH3-Domäne ausschließen und statt dessen zeigen, dass diese Rezeptor-Untereinheit exklusiv entweder Gephyrin oder CB bindet. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Rolle von CB in der Rezeptor-Anhäufung allein durch die konkurrierenden Bindungs-Ereignisse seiner konstituierenden Domänen bestimmt wird. Die intramolekulare Assoziation zwischen der PH und der DH-Domäne mit der SH3-Domäne von CB konkurriert mit unterschiedlichen intermolekularen Wechselwirkungen von CB. Und zwar mit der GABAAR α2-Untereinheit-Bindung an die SH3-Domäne, mit der PIP2-Bindung an die PH-Domäne, sowie mit der Gephyrin-Bindung, welche vermutlich von der PH und DH-Domäne von CB vermittelt wird. (iii) Interessanterweise bestätigen frühere Studien, dass die Rezeptor-Motive, die ich hier identifiziert habe und welche direkt mit den Gerüst-Proteinen wechselwirken, in vivo posttranslational modifiziert vorliegen. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Gephyrin-Bindemotive der GABAAR α1-Untereinheit und GlyR β-Untereinheiten Ziele des ERK/MAPK und PKC-Phosphorylierungs-Weges sind, während das Radixin-Bindungs-Motiv innerhalb der GABAAR α5-Untereinheit ubiquitiniert vorliegt. In dieser Dissertation habe ich im Besonderen die ERK-Phosphorylierung von Thr348 in der GABAAR α1-Untereinheit untersucht. Tatsächlich konnten meine Bindungs-Assays eine starke Reduktion der direkten Gephyrin Bindungsstärke beim Einbringen eines phosphomimetischen Restes bestätigen. Darüber hinaus konnte J. Mukherjee eine signifikante Reduktion der Cluster-Anzahl und Größe beim Einführen der gleichen Mutation in die α1-Untereinheit beinhaltenden GABAARs in hippokampalen Neuronen beobachten. Der ERK/MAPK-Regulation-Weg ist daher ein aussichtsreicher Kandidat für die Regulation der GABAergen-Signalübertragung. (iv) In vivo bildet Gephyrin vermutlich durch Selbstorganisation seiner G (GephG) und E-Domänen (GephE) ein multivalentes Gerüst. Angesichts der multimeren Natur Gephyrins und der pentameren Rezeptorarchitektur habe ich die Möglichkeit von Aviditäts-Effekten im Prozess der synaptischen Neurotransmitter-Rezeptor-Anhäufung untersucht. Die Kristallstrukturen von GephE im Komplex mit ausgewählten Peptiden zeigen zwei Rezeptor-Bindungsstellen in räumlicher Nähe (15 Å). Auf der Basis dieser Information habe ich bivalente Peptide entworfen, welche beide Rezeptor-Bindungsstellen in Gephyrin simultan besetzen können und, wie erwartet, konnte ich mit Hilfe verschiedener biophysikalischen Methoden eine unübertroffen hohe, durch Avidität potenzierte, Gephyrin-Affinität nachweisen. Mir gelang es diesen Aviditäts-Effekt für einen schwachen Gephyrin Liganden, ein GABAAR-abgeleitetes Peptid, welcher nicht mit herkömmlichen monomeren Liganden untersucht werden konnte, nutzbar zu machen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass diese Verbindung gezielt die Rezeptor-Bindungsstelle in GephE besetzt und auf diese Weise hemmend auf Gephyrins Rezeptorbindungsaktivität wirkt. Eine weitere Entwicklung dieser Verbindung könnte die Möglichkeit eröffnen, spezifisch die Wirkung der Entkopplung der Gephyrin Rezeptor-Interaktion in der Zellkultur-Experimenten zu analysieren ohne dabei die Anzahl oder die Funktion der Proteine zu beeinträchtigen, was einen Nebeneffekt von konventionellen Methoden wie Gen „knock-out“, RNA-Interferenz oder den Einsatz von Antikörpern darstellt. / γ-Aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) and glycine receptors (GlyRs) are the major mediators of fast synaptic inhibition in the central nervous system. For proper synaptic function their precise localization and exact concentration within the neuronal surface membrane is essential. These properties are mediated by scaffolding proteins which directly contact the large intracellular loops of the receptors and tether them to cytoskeletal elements of the neuronal cells. In my thesis I deciphered the molecular details of several underlying protein-protein interactions, namely the interaction of a subset of GABAAR and GlyR subunits with the scaffolding proteins gephyrin, radixin and collybistin. I determined short linear motifs within the large intracellular loops of the receptors that directly engage in subunit specific scaffold protein interactions. My quantitative binding studies revealed that gephyrins E domain primarily recognizes the GABAAR α1 (Kd = 17 M) and α3 (Kd = 5 M) subunits, in contrast, the SH3 domain of collybistin mainly interacts with the GABAAR α2 subunit (Kd = 1 µM), while the FERM domain of radixin tightly binds to the GABAAR α5 subunit (Kd = 8 µM). My work additionally demonstrated that this simple relationship is complicated by (i) missing or (ii) overlapping binding specificities between the scaffold proteins and the receptor subunits. Moreover, this thesis addressed the possibility of (iii) posttranslational negative regulation as well as amplification generated by (iv) avidity effects as summarized below. (i) First, using biochemical methods I mapped the radixin-GABAAR α5 interaction in detail. My structural analysis and competition assays suggest that radixin mediates the receptor subunit binding via a universal binding site within the F3 subdomain of its FERM domain. This binding site is formed by an α-helix that offers a large hydrophobic pocket, which accepts a variety of different hydrophobic residues adopting different conformations, and a β-strand that readily engages in peptide backbone interactions. Not surprisingly, this binding site has been implicated in a wide variety of different scaffold interactions, thus emphasizing the importance of the essential FERM activation mechanism described earlier and suggesting additional pathways to allow tight regulation of this interaction. (ii) Next, I analyzed in detail the process of gephyrin-mediated GABAAR clustering. My X-ray crystallographic studies and binding assays revealed that gephyrin mediates binding of the GABAAR α1, α2 and α3 subunit via a universal binding site that also mediates the interactions with the GlyR β subunit. Using structure-guided mutagenesis I identified key residues within gephyrin and the receptor subunits that act as major contributors to the overall binding strength. Namely, two conserved aromatic residues within the N-terminal half of the receptor binding region engage in crucial hydrophobic interactions with gephyrin. Accordingly, J. Mukherjee from the group of our collaborator Steven J. Moss verified a substantial decrease in GABAAR cluster number and size in primary hippocampal neurons upon exchange of these residues within the GABAAR α2 subunit. Extension of my studies to collybistin (CB) revealed an overlapping but reciprocal subunit preference for this protein in comparison to gephyrin. The GABAAR α3 subunit exclusively binds gephyrin, in contrast the GABAAR α1 subunit mainly targets gephyrin (Kd = 17 µM) but additionally displays a moderate affinity (Kd ≈ 400 µM) towards the SH3 domain of CB. The GABAAR α2 subunit binds tightly to the SH3 domain of CB (Kd = 1 µM) and additionally displays a weak gephyrin affinity (Kd ≈ 500 µM). Notably, I could exclude the possibility of synergistic effects between gephyrins E domain, the SH3 domain of CB and the GABAAR α2 subunit. Instead, I found that the GABAAR α2 subunit binds gephyrin and CB in a mutually exclusive manner. These results suggest that CBs role in receptor clustering is solely determined by competing binding events of its constituting domains. Namely, the intra-molecular association between the PH/DH domain and the SH3 domain within CB competes with different inter-molecular interactions of CB: GABAAR α2 binding to the SH3 domain, PIP2 binding to the PH domain and gephyrin presumably binding to the PH and DH domain of CB. (iii) Interestingly, the receptor motifs, which have been mapped in my thesis to directly interact with the scaffold proteins, were shown in earlier studies to be posttranslationally modified in vivo. In particular, the GABAAR α1 and GlyR β subunits have been implicated as targets of the ERK/MAPK and PKC phosphorylation-pathways, respectively, while the GABAAR α5 subunit motif was shown to be ubiquitinated. In this dissertation, I analyzed Thr348, a possible ERK phosphorylation site within GABAAR α1. My binding assays verified a severe reduction of the direct gephyrin binding strength upon introduction of the respective phosphomimetic residue. The relevance of this in vitro result was highlighted by J. Mukherjee who confirmed a significant reduction in GABAAR cluster number and size upon introduction of the same mutation. The ERK/MAPK pathway is therefore a promising candidate for regulation of GABAergic transmission. (iv) In vivo, gephyrin presumably forms a multivalent scaffold, which is based on the self-association of its G (GephG) and E domains (GephE). Given the multimeric nature of gephyrin and the pentameric receptor architecture, I tested the possibility of avidity in the clustering of inhibitory neurotransmitter receptors. Cocrystallization of selected minimum peptides with GephE and their crystal structure analyses enabled me to define a receptor-derived peptide that offers a maximized gephyrin affinity. The structure of the GephE-GlyR  receptor complex reveals two receptor-binding sites in close spatial vicinity (15 Å). I therefore designed bivalent peptides that enable to target both GephE sites at the same time and, as expected, a variety of biophysical methods verified an avidity-potentiated and unmatched high gephyrin affinity for these bidentate compounds. Notably, I could extend the dimerization approach to low affinity gephyrin ligands, namely short GABAAR-derived peptides that could not be studied using conventional monomeric ligands. Additionally, I verified that this compound specifically targets GephEs receptor binding site, and that it thereby inhibits its receptor binding activity. Further development of this molecule may offer the possibility to specifically analyze the effect of uncoupling the gephyrin-receptor interaction in cell culture-based assays, without altering protein function or expression level that accompanies conventional methods such as protein knock-out, RNA interference or the usage of antibodies.