Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Frankfurt (Main), Universiẗat, Diss., 2003.

Universiẗat, Diss., 2003--Frankfurt (Main).

Efficient synaptic neurotransmission requires the exact apposition of presynaptic terminals and matching neurotransmitter receptor clusters on the postsynaptic side. The receptors are embedded in the postsynaptic density, which also contains scaffolding and regulatory proteins that ensure high local receptor concentrations. At inhibitory synapses the cytosolic scaffolding protein gephyrin assumes an essential organizing role within the postsynaptic density by the formation of self-oligomers which provide a high density of binding sites for certain -amino butyric acid type A (GABAA) and the large majority of glycine receptors (GlyR). Gephyrin contains two oligomerization domains: In isolation, the 20 kDa N-terminal G domain (GephG) and the 46 kDa E domain (GephE) trimerize and dimerize, respectively. In the full-length protein the domains are interconnected by a central ~150 amino acid linker, and only GephG trimerization is utilized, whereas GephE dimerization is prevented, thus suggesting the need for a trigger to release GephE autoinhibition, which would pave the way for the formation of higher oligomers and for efficient receptor clustering. The structural basis for this GephE autoinhibition has remained elusive so far, but the linker was reported to be sufficient for autoinhibition. This work dealt with the biochemical and structural characterization of apo-gephyrin and gephyrin in complexes with ligands which are known to promote the formation of synaptic gephyrin clusters (collybistin and neuroligin 2) and reorganize them (dynein light chain 1). For full-length gephyrin no structural information has been available so far. Atomic force microscopy (AFM) and small-angle X-ray scattering (SAXS) analyses described in this thesis disclosed that the gephyrin trimer forms a highly flexible assembly, which, due to the long linker, can switch between compact and extended conformational states in solution, with a preference for compact states. This partial compaction and potentially GephE autoinhibition are achieved by interactions of parts of the linker with the G and E domains, as suggested by circular dichroism spectroscopy. However, the linker on its own cannot account for GephE blockage, as size exclusion chromatography experiments coupled with multi angle light scattering detection (SEC-MALS) and SAXS analyses revealed that a gephyrin variant only encompassing the linker and GephE (GephLE) forms dimers and not monomers as suggested by an earlier study. The oligomeric state of GephLE and the observation that several gephyrin variants, in which linker segments of varying length were deleted, predominantly formed trimers, suggested the presence of a linker independent mechanism of GephE dimerization blockade. Taken together, the data indicated that linker-dependent and linker-independent mechanisms mediate gephyrin autoinhibition. In the second project gephyrin’s interaction with DYNLL1 (Dynein LC8 Light Chain 1) was characterized. DYNLL1 is a 25 kDa dimer incorporated into the dynein motor and provides two binding sites, each of which can accommodate an octapeptide derived from gephyrin’s linker region (referred to as GephDB). Originally, DYNLL1 was regarded as a cargo adaptor, linking gephyrin-GlyR complexes to the dynein motor, thus driving their retrograde transport and leading to a decrease of synaptic gephyrin-GlyR complexes. Building on these studies, this thesis assessed the cargo hypothesis as well as the so far unclear stoichiometry of the gephyrin-DYNLL1 complex. The cargo scenario would require ternary complex formation between gephyrin, DYNLL1 and the dynein intermediate chain (DIC) of the dynein motor. However, such a complex could not be detected by analytical size exclusion chromatography (aSEC) experiments – presumably because gephyrin and DIC competed for a common binding site in DYNLL1. This finding was consistent with a single DYNLL1 dimer capturing two linker segments of a single gephyrin trimer as suggested by a 26 kDa mass increase of the gephyrin species in the presence of DYNLL1 in SEC-MALS experiments. aSEC experiments at even higher concentrations (~20 µM gephyrin and ~80 µM DYNLL1) indicated that the affinity of GephDB was significantly impaired in the context of full-length gephyrin but also in a variant that bears only GephG and the first 39 residues of the linker (GephGL220). Presumably due to avidity effects two linkers stably associated with a single DYNLL1 dimer, whereas the third DYNLL1 binding motif remained predominantly unoccupied unless high concentrations of GephGL220 (50 µM) and DYNLL1 (200 µM) were used. These findings indicate that an interplay between GephG and the N-terminal linker segment mediates the attenuation of GephDB affinity towards DYNLL1 and that preventing DYNLL1 from the induction of higher gephyrin oligomers is either advantageous for DYNLL1-mediated reorganization of gephyrin-GlyR clusters or that DYNLL1 exerts possibly two (concentration-dependent) actions on gephyrin. The gephyrin-collybistin-neuroligin 2 complex was the subject of the third project. Previously, collybistin and gephyrin were observed to mutually trigger their translocation to the postsynaptic membrane, where the disordered cytoplasmic tail of the postsynaptic cell adhesion molecule NL2 (NL2cyt) causes the anchoring of collybistin 2 (CB2) by binding to its SH3 domain, thereby releasing SH3 domain mediated autoinhibiton of CB2 binding to the membrane phospholipid phosphatidylinositol-3-phosphate. Critical for this event is the binding of gephyrin to both CB2 and NL2, presumably via GephE. Following up on these previous studies biochemical data presented in this thesis confirm the formation of the ternary complex. Unexpectedly, analyses by means of native polyacrylamide gel electrophoresis pointed to: (1) The existence of a complex containing NL2cyt and CB2 lacking the SH3 domain and consequently an additional NL2 binding site in CB2. (2) Attenuated gephyrin-collybistin complex formation in the presence of the SH3 domain. (3) A requirement for high NL2cyt concentrations (> 30 µM) during the formation of the ternary complex. This might allow for the regulation by other factors such as additional binding partners or posttranslational modifications. Although of preliminary character, these results provide a starting point for future studies, which will hopefully elucidate the interplay between gephyrin, collybistin, NL2 and certain GABAA receptors. / Eine effiziente synaptische Neurotransmission macht es erforderlich, dass sich presynaptische Nervenenden und die Schar (engl. Cluster) der dazugehörigen Neurotransmitterrezeptoren auf der postsynaptischen Seite exakt gegenüberliegen. Die Rezeptoren sind in der postsynaptischen Dichte eingebettet, die auch Gerüstproteine und regulatorische Proteine enthält, die hohe lokale Rezeptor-Konzentrationen gewährleisten. An inhibitorischen Synapsen übernimmt das cytosolische Gerüstprotein Gephyrin eine essentielle Rolle in der postsynaptischen Dichte durch die Bildung von Homo-Oligomeren, die für eine hohe Dichte an Bindungsstellen für bestimmte -Aminobuttersäure Typ A- (GABAA)- und die große Mehrheit der Glyzin-Rezeptoren (GlyR) sorgen. Gephyrin enthält zwei Oligomerisierungsdomänen: In isolierter Form bildet die N-terminale 20 kDa große G-Domäne (GephG) und die C-terminale 46 kDa große E-Domäne (GephE) Trimere beziehungsweise Dimere. Im Volllängenprotein sind die Domänen durch einen zentrale ~150 Aminosäure lange Region (auch Linker genannt) verknüpft, und nur von der GephG-Trimerisiung wird Gebrauch gemacht, wohingegen die GephE-Dimerisierung unterbunden ist, was nahelegt, dass ein Auslöser benötigt wird, der die Autoinhibierung von GephE aufhebt und dadurch den Weg zur Bildung höherer Oligomere ebnet. Die strukturelle Basis für die GephE- Autoinhibierung ist bislang nicht bekannt, aber eine veröffentlichte Studie kam zu dem Schluss, dass der Linker ausreicht, um die GephE-Dimerisierung zu inhibieren. Diese Arbeit beinhaltet die biochemische und strukturelle Charakterisierung von apo-Gephyrin und Gephyrin in Komplexen mit Liganden, von denen bekannt ist, dass sie entweder die Bildung von synaptischen Gephyrin-Selbstoligomeren begünstigen (Collybistin und Neuroligin 2) oder die Gephyrin-Selbstoligomere reorganisieren (Dynein leichte Kette 1). Für Volllängen-Gephyrin gab es bislang keine strukturellen Informationen. Rasterkraftmikroskopie (engl. AFM)- und Röntgenkleinwinkelbeugungs (engl. SAXS)-Analysen, die in dieser Arbeit beschrieben sind, deckten auf, dass das Gephyrin-Trimer eine hoch flexible Einheit ist, die – durch den langen Linker – zwischen kompakten und extendierten Zuständen hin- und herwechselt, mit einer leichten Präferenz für kompakte Zustände. Spektroskopische Messungen des zirkulären Dichroismus legten nahe, dass die partielle Kompaktierung und möglicherweise auch die GephE-Autoinhibition durch Interaktionen von Teilen des Linkers mit den G- und E-Domänen erreicht werden. Aber der Linker alleine kann nicht für die GephE-Blockade verantwortlich zeichnen, weil Größenausschluss-Chromatographie-Experimente gekoppelt mit Multiwinkel-Lichtstreudetektion (englische Abkürzung SEC-MALS) offenlegten, dass eine Gephyrin-Variante, die nur den Linker und GephE umfasst (GephLE), Dimere und keine Monomere ausbildet, wie in einer früheren Studie postuliert wurde. Der oligomere Zustand von GephLE und die Beobachtung, dass alle Gephyrin-Varianten, in denen Linker-Segmente verschiedener Länge deletiert wurden, überwiegend Trimere bildeten, legen nahe, dass ein Linker-unabhängiger Mechanismus für die GephE-Dimerisierungsblockade existiert. Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass Linker-abhängige und -unabhängige Mechanismen die GephE-Autoinhibtion vermitteln. Im zweiten Projekt wurde die Interaktion von Gephyrin mit DYNLL1 (Dynein LC8 Light Chain 1) charakterisiert. DYNLL1 is ein 25 kDa-Dimer, das im Dynein-Motor integriert ist, und bietet zwei Bindestellen, die beide ein von der Gephyrin-Linker-Region abgeleitetes Oktapeptid (im Weiteren GephDB) aufnehmen können. Ursprünglich wurde DYNLL1 als ein Ladungsadapter betrachtet, der Gephyrin-GlyR-Komplexe mit dem Dynein-Motor verknüpft und dadurch ihren retrograden Transport vorantreibt und somit zu einer Abnahme synaptischer Gephyrin-GlyR-Komplexe führt. Auf diesen Studien aufbauend, wurde in dieser Arbeit die Ladungsadapter-Hypothese analysiert ebenso wie die bislang unklare Stöchiometrie des Gephyrin-DYNLL1-Komplexes. Das Ladungsadapter-Szenario würde einen ternären Komplex aus Gephyrin, DYNLL1 und der mittleren Dynein-Kette (englische Abkürzung DIC) voraussetzen. Ein solcher Komplex konnte mittels analytischer Größenausschlusschromatographie (englische Abkürzung aSEC) nicht detektiert werden – vermutlich, weil Gephyrin und DIC um eine gemeinsame Bindungsstelle in DYNLL1 konkurrierten. Dieser Befund war konsistent mit einem Modell, in dem ein einzelnes DYNLL1-Dimer zwei Linker eines (einzelnen) Gephyrin-Trimers bindet, wie es auch durch eine 26 kDa-Massen-Zunahme der Gephyrin-Spezies in der Anwesenheit von DYNLL1 in SEC-MALS-Experimenten nahegelegt wurde. aSEC-Experimente auch bei hohen Konzentrationen (~20 µM Gephyrin und ~80 µM DYNLL1) deuteten darauf hin, dass die Affinität von GephDB im Kontext von Volllängen-Gephyrin signifikant beeinträchtigt war, aber auch bei einer Gephyrin-Variante, die nur GephG und die ersten 39 Reste des Linkers entielt (GephGL220). Voraussichtlich aufgrund von Aviditätseffekten banden zwei Linker stabil an ein einzelnes DYNLL1-Dimer, wohingegen das dritte DYNLL1-Bindungsmotiv unbesetzt blieb, so lange nicht hohe Konzentrationen an GephGL220 (50 µM) und DYNLL1 (200 µM) eingesetzt wurden. Diese Ergebnisse deuteten an, dass ein Zusammenspiel von GephG und dem N-terminalen Linker-Segment die Abschwächung der GephDB-Affinität zu DYNLL1 vermittelt und dass die Verhinderung der Induktion höherer Oligomere durch DYNLL1 entweder vorteilhaft für die Reorganization von Gephyrin-GlyR-Clustern ist oder dass DYNLL1 zwei (konzentrationsabhängige) Wirkungen auf Gephyrin ausübt. Der Gephyrin-Collybistin-Neuroligin 2-Komplex war Gegenstand des dritten Projektes. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde festgestellt, dass Collybistin und Gephyrin gegenseitig ihre Translokation zur postsynaptischen Membran einleiten, wo der ungeordnete, cytosolische Anteil des postsynaptischen Zelladhäsionsmembranmoleküls Neuroligin 2 (NL2cyt) die Verankerung von Collybistin 2 (CB2) durch das Binden an seine “src homology 3”-Domäne (SH3-Domäne) bewirkt und dadurch die SH3-Domänen-vermittelte Autoinhibition der CB2-Bindung an das Membran-Phospholipid Phosphatidylinositol-3-phosphat aufhebt. Entscheidend für dieses Ereignis ist, dass Gephyrin sowohl an CB als auch an NL2cyt bindet, vermutlich vermittelt durch GephE. In einer Fortsetzung dieser frühreren Studien bestätigen biochemische Daten in dieser Arbeit die Bildung des ternären Komplexes. Unerwarteterweise deuteten Analysen mittels nativer Polyacrylamidgelektrophorese auf: (1) Die Existenz eines Komplexes aus NL2cyt und CB2 ohne SH3-Domäne und damit auf eine zusätzliche NL2-Bindungsstelle in CB2. (2) Abgeschwächte Gephyrin-Collybistin-Komplexbildung in der Anwesenheit der SH3-Domäne. (3) Hohe NL2-Konzentrationen (>30 µM) als Voraussetzung für die Bildung des ternären Komplexes. Dies könnte die Regulation durch andere Faktoren wie zusätzliche Bindungspartner oder posttranslationale Modifikationen ermöglichen. Wenngleich die Ergebnisse von vorläufigem Charakter sind, stellen sie einen Startpunkt für künftige Arbeiten dar, welche hoffentlich das Zusammenspiel von Gephyrin, Collybistin, NL2 und bestimmten GABAA-Rezeptoren weiter aufklären werden.

Neurons are specialized cells dedicated to transmit the nerve impulses throughout the human body across specialized structures called synapses. At the synaptic terminals, a crosstalk between multiple macromolecules regulates the structure and function of the presynaptic nerve endings and the postsynaptic recipient sites. Gephyrin is the central organizer at inhibitory postsynaptic specializations and plays a crucial role in the organization of these structures by anchoring GABAA receptors (GABAAR) and glycine receptors (GlyR) to the postsynaptic membrane. This 93 kDa protein features an N-terminal G domain and a C-terminal E domain and the latter interacts directly with the intracellular loop between transmembrane helices 3 and 4 of certain subunits of the GlyRs and GABAARs. Biochemical and structural analyses have already provided valuable insights into the gephyrin-GlyR interaction. Interestingly, biochemical studies on the gephyrin-GABAAR interaction demonstrated that the GABAARs also depend on the same binding site as the GlyRs for the interaction with the gephyrin, but the molecular basis for this receptor specific interaction of gephyrin was still unknown. Co-crystal structures of GephE-GABAAR α3- derived peptides with supporting biochemical data presented in this study deciphered the receptor-specific interactions of gephyrin in atomic detail. In its moonlighting function, gephyrin also catalyzes the terminal step of the evolutionarily conserved molybdenum cofactor biosynthesis. Molybdenum, an essential transition element has to be complexed with a pterin-based cofactor resulting in the formation of the molybdenum cofactor (Moco). Moco is an essential component at the active site of all molybdenum-containing enzymes with the exception of nitrogenase. Mutations in enzymes involved in this pathway lead to a rare yet severe disease called Moco deficiency, which manifest itself in severe neurodevelopmental abnormalities and early childhood death. Moco biosynthesis follows a complex multistep pathway, where in the penultimate step, the N-terminal G domain of gephyrin activates the molybdopterin to form an adenylated molybdopterin intermediate. In the terminal step, this intermediate is then transferred to the C-terminal E domain of gephyrin, which catalyzes the metal insertion and deadenylation reaction to form active Moco. Previous biochemical and structural studies provided valuable insights into the penultimate step of the Moco biosynthesis but the terminal step remained elusive. Through the course of my dissertation, I crystallized the C-terminal E domain in the apo-form as well as in complex with ADP and AMP. These structures shed lightonto the deadenylation reaction and the formation of a ternary E-domain-ADP-Mo/W complex and thus provide structural insight into the metal insertion mechanism. Moreover, the structures also provided molecular insights into a mutation leading to Moco deficiency. Finally, ternary complexes of GephE, ADP and receptor-derived peptides provided first clues regarding the integration of gephyrin’s dual functionality. In summary, during the course of the dissertation I was able to derive high resolution structural insights into the interactions between gephyrin and GABAARs, which explain the receptor-specific interaction of gephyrin and, furthermore, these studies can be extended in the future to understand GABAAR subunit-specific interactions of gephyrin. Finally, the understanding of Moco biosynthesis shed light on the molecular basis of the fatal Moco deficiency. / Neurone sind spezialisierte Zellen, die über die Synapsen Nervenimpulse im menschlichen Körper übertragen. An den synaptischen Enden reguliert ein Netzwerk aus einer Vielzahl von Makromolekülen die Struktur und die Funktion der präsynaptischen Nervenenden und der postsynaptischen Kontaktstellen. Gephyrin ist der Hauptorganisator an inhibitorischen, postsynaptischen Spezialisierungen und spielt durch die Verankerung von GABAA-Rezeptoren (GABAAR) und Glycinrezeptoren (GlyR) in der postsynaptischen Membran eine zentrale Rolle für den Aufbau dieser Strukturen. Dieses 93 kDa Protein enthält eine N-terminale G-Domäne (GephG) und eine C-terminale E-Domäne (GephE), wobei letztere direkt mit der intrazellulären unstrukturierten Region zwischen Transmembranhelices 3 und 4 bestimmter Untereinheiten der GlyR und GABAAR interagiert. Biochemische und strukturelle Analysen lieferten bereits wertvolle Erkenntnisse über die Gephyrin-GlyR Interaktion. Interessanterweise zeigten Versuche zur Gephyrin-GABAAR Interaktion, dass GABAARs die gleiche Bindungsstelle auf Gephyrin benutzen wie GlyRs, wobei die molekulare Basis für diese Interaktion nicht bekannt war. In dieser Arbeit zeige ich Co-Kristallstrukturen von GephE-GABAARα3 sowie unterstützende biochemische Daten, die die atomaren Details der rezeptorspezifischen Interaktionen von Gephyrin entschlüsseln. Als zweite Funktion katalysiert Gephyrin den terminalen Schritt der evolutionär konservierten Molybdän Cofaktor Biosynthese. Dabei muss das essentielle Übergangselement Molybdän mit einem Pterin-basierten Cofaktor komplexiert werden, um den Molybdän Cofaktor (Moco) zu bilden. Moco ist essentieller Bestandteil im aktiven Zentrum aller Molybdän-enthaltenden Enzyme mit Ausnahme der Nitrogenase. Mutationen in Enzymen, die in die Molybdän Cofaktor Biosynthese involviert sind, verursachen eine Moco Defizienz, eine seltene, jedoch schwere Erkrankung, die sich durch schwere neurologische Entwicklungsstörungen und Tod im frühen Kindesalter äußert. Die Moco Biosynthese folgt einem komplexen mehrstufigen Ablauf. Im vorletzten Schritt adenyliert GephG das Molybdopterin und ein Zwischenprodukt entsteht. Im letzten Schritt wird dieses Zwischenprodukt auf GephE übertragen, das die Insertion des Metalls und die Deadenylierungsreaktion katalysiert, wodurch der aktive Moco entsteht. Frühere biochemische und strukturelle Studien brachten wertvolle Erkenntnisse über den vorletzten Schritt der Moco Biosynthese, aber die Kenntnisse über den letzten Schritt blieben vage. Während meiner Dissertation kristallisierte ich GephE in der apo-Form sowie im Komplex mit ADP oder AMP. Diese Strukturen gaben Aufschluss über die Deadenylierungsreaktion und die Formation eines ternären GephE-ADP-Mo/W Komplexes und gewährten so einen strukturellen Einblick in den Mechanismus der Metallinsertion. Darüber hinaus ermöglichten die Strukturen eine Mutation, die zu Moco Mangel führt, auf molekularer Ebene zu verstehen. Schließlich lieferten ternäre Komplexe aus GephE, ADP und von Rezeptoren abgeleiteten Peptiden ersten Aufschluss bezüglich der Verflechtung von Gephyrins dualer Funktion. Zusammenfassend konnte ich während der Dissertation hochauflösende strukturelle Einblicke in den Komplex aus GephE und GABAAR α3 Untereineinheit gewinnen, die die rezeptorspezifische Interaktion von Gephyrin erklären. Weiterhin können diese Studien in der Zukunft ausgeweitet werden, um die GABAAR-untereinheitenspezifische Interaktion mit Gephyrin zu verstehen. Schließlich erlauben die Studien zur Moco Biosynthese die tödliche Moco Defizienz auf molekularer Ebene zu verstehen.

γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren vom Typ A (GABAARs) und Glyzin-Rezeptoren (GlyRs) sind die wichtigsten Vermittler der schnellen synaptischen Inhibition im zentralen Nervensystem. Von wesentlicher Bedeutung für ihre ordnungsgemäße Funktion in der inhibitorischen Signalübertragung ist ihre präzise Lokalisation und Konzentration innerhalb der neuronalen Oberflächenmembran. Diese Eigenschaften werden durch Gerüstproteine vermittelt, welche direkt an die großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren, sowie an Bausteine des neuronalen Zytoskeletts binden. In meiner Dissertation habe ich die molekularen Details mehrerer zugrunde liegenden Protein-Protein Wechselwirkungen untersucht. Im Speziellen habe ich die Interaktion ausgewählter GABAAR und GlyR Untereinheiten mit den Gerüstproteinen Gephyrin, Radixin und Collybistin analysiert. Ich habe kurze lineare Aminosäuren-Motive innerhalb der großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren identifiziert, welche die direkten und Untereinheit-spezifischen Interaktionen vermitteln. Die Quantifizierung der jeweiligen Bindungsstärke ergab, dass Gephyrins E-Domäne vor allem an die GABAAR α1 (Kd = 17 M) und α3 (Kd = 5 M) -Untereinheiten bindet, wohingegen die SH3-Domäne von Collybistin hauptsächlich mit der GABAAR α2-Untereinheit interagiert (Kd = 1 M). Demgegenüber bindet die FERM-Domäne von Radixin fest an die α5-Untereinheit des GABAAR (Kd = 8 µM). Weiterhin zeigt meine Arbeit, dass diese einfache Beziehung durch (i) fehlende oder (ii) überlappende Bindungsspezifitäten zwischen den Gerüstproteinen und den Rezeptor-Untereinheiten komplex reguliert wird. Ferner beschreibe ich hier, wie im Folgenden ausgeführt, die Möglichkeit einer (iii) negativen Modulation mittels posttranslationaler Modifikation, sowie einer Verstärkung der Bindung durch (iv) Aviditäts-Effekte. (i) Als erstes habe ich mit Hilfe biochemischer Methoden die Radixin-GABAAR α5 Interaktion im Detail untersucht. Meine Strukturanalyse und Kompetitionsstudien legen den Schluss nahe, dass Radixin die betreffende Rezeptor-Untereinheit mittels einer universellen Bindungstasche in der F3 Subdomäne innerhalb seiner FERM Domäne bindet. Diese Bindungsstelle wird durch zwei markante Strukturelemente gebildet: Einer α-Helix, die eine große hydrophobe Tasche bildet, welche eine Vielzahl unterschiedlicher hydrophober Reste in verschiedenen Konformationen akzeptiert, sowie ein β-Strang, der Peptidrückgrat-Interaktionen eingehen kann. Es überrascht nicht, dass eine Vielzahl an Studien die Beteiligung dieser Bindungsseite mit unterschiedlichen Liganden beschrieben hat. Diese Promiskuität unterstreicht die Bedeutung des Aktivierungsmechanismus der zuvor für die Radixin FERM GABAAR α5-Untereinheit beschrieben wurde und impliziert weitere Regulationsmechanismen, die eine koordinierte Interaktion in vivo ermöglichen. (ii) Weiterhin habe ich mich ausführlich der Analyse der Gephyrin-vermittelten GABAAR Clusterbildung gewidmet. Meine röntgenkristallographischen Studien und Bindungsstudien zeigen, dass Gephyrin mit den GABAAR α1, α2 und α3 Untereinheiten über eine universelle Bindungsstelle interagiert, welche auch die Wechselwirkungen mit der β-Untereinheit des GlyR vermittelt. Mittels Struktur-basierter Mutagenesestudien konnte ich die Schlüsselreste innerhalb von Gephyrin und der Rezeptor-Untereinheiten identifizieren, die einen entscheidenden Beitrag zur Gesamt-Bindungsstärke liefern. Insbesondere zwei konservierte aromatische Reste in der N-terminalen Hälfte der Rezeptorbindungsregion gehen entscheidende hydrophobe Wechselwirkungen mit Gephyrin ein. Dementsprechend konnte J. Mukherjee, ein Mitarbeiter in der Gruppe unseres Kooperationspartners Steven J. Moss, zeigen, dass der Austausch dieser Reste innerhalb der α2-Untereinheit des GABAAR ausreicht, um einen deutlichen Rückgang der Rezeptor Cluster-Anzahl und ihrer Größe in primären hippokampalen Neuronen zu verursachen. Die Ausweitung meiner Rezeptor-Interaktions-Studien auf Collybistin (CB) ergab, dass dieses Protein im Vergleich zu Gephyrin eine umgekehrte, aber dennoch überlappende Rezeptor-Untereinheiten-Präferenz aufweist. Die GABAAR α3-Untereinheit bindet ausschließlich an Gephyrin (Kd = 5 µM), während die GABAAR α1-Untereinheit zwar vor allem Gephyrin bindet (Kd = 17 µM), zusätzlich jedoch eine schwache Affinität (Kd ≈ 400 µM) für die SH3-Domäne von CB aufweist. Im Gegensatz dazu bindet die GABAAR α2-Untereinheit hochaffin an die SH3-Domäne von CB (Kd = 1 µM) und zeigt zusätzlich eine schwache Gephyrin Affinität (Kd ≈ 500 µM). Interessanterweise konnte ich Synergieeffekte zwischen der GABAAR α2-Untereinheit, Gephyrins E-Domäne und CBs SH3-Domäne ausschließen und statt dessen zeigen, dass diese Rezeptor-Untereinheit exklusiv entweder Gephyrin oder CB bindet. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Rolle von CB in der Rezeptor-Anhäufung allein durch die konkurrierenden Bindungs-Ereignisse seiner konstituierenden Domänen bestimmt wird. Die intramolekulare Assoziation zwischen der PH und der DH-Domäne mit der SH3-Domäne von CB konkurriert mit unterschiedlichen intermolekularen Wechselwirkungen von CB. Und zwar mit der GABAAR α2-Untereinheit-Bindung an die SH3-Domäne, mit der PIP2-Bindung an die PH-Domäne, sowie mit der Gephyrin-Bindung, welche vermutlich von der PH und DH-Domäne von CB vermittelt wird. (iii) Interessanterweise bestätigen frühere Studien, dass die Rezeptor-Motive, die ich hier identifiziert habe und welche direkt mit den Gerüst-Proteinen wechselwirken, in vivo posttranslational modifiziert vorliegen. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Gephyrin-Bindemotive der GABAAR α1-Untereinheit und GlyR β-Untereinheiten Ziele des ERK/MAPK und PKC-Phosphorylierungs-Weges sind, während das Radixin-Bindungs-Motiv innerhalb der GABAAR α5-Untereinheit ubiquitiniert vorliegt. In dieser Dissertation habe ich im Besonderen die ERK-Phosphorylierung von Thr348 in der GABAAR α1-Untereinheit untersucht. Tatsächlich konnten meine Bindungs-Assays eine starke Reduktion der direkten Gephyrin Bindungsstärke beim Einbringen eines phosphomimetischen Restes bestätigen. Darüber hinaus konnte J. Mukherjee eine signifikante Reduktion der Cluster-Anzahl und Größe beim Einführen der gleichen Mutation in die α1-Untereinheit beinhaltenden GABAARs in hippokampalen Neuronen beobachten. Der ERK/MAPK-Regulation-Weg ist daher ein aussichtsreicher Kandidat für die Regulation der GABAergen-Signalübertragung. (iv) In vivo bildet Gephyrin vermutlich durch Selbstorganisation seiner G (GephG) und E-Domänen (GephE) ein multivalentes Gerüst. Angesichts der multimeren Natur Gephyrins und der pentameren Rezeptorarchitektur habe ich die Möglichkeit von Aviditäts-Effekten im Prozess der synaptischen Neurotransmitter-Rezeptor-Anhäufung untersucht. Die Kristallstrukturen von GephE im Komplex mit ausgewählten Peptiden zeigen zwei Rezeptor-Bindungsstellen in räumlicher Nähe (15 Å). Auf der Basis dieser Information habe ich bivalente Peptide entworfen, welche beide Rezeptor-Bindungsstellen in Gephyrin simultan besetzen können und, wie erwartet, konnte ich mit Hilfe verschiedener biophysikalischen Methoden eine unübertroffen hohe, durch Avidität potenzierte, Gephyrin-Affinität nachweisen. Mir gelang es diesen Aviditäts-Effekt für einen schwachen Gephyrin Liganden, ein GABAAR-abgeleitetes Peptid, welcher nicht mit herkömmlichen monomeren Liganden untersucht werden konnte, nutzbar zu machen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass diese Verbindung gezielt die Rezeptor-Bindungsstelle in GephE besetzt und auf diese Weise hemmend auf Gephyrins Rezeptorbindungsaktivität wirkt. Eine weitere Entwicklung dieser Verbindung könnte die Möglichkeit eröffnen, spezifisch die Wirkung der Entkopplung der Gephyrin Rezeptor-Interaktion in der Zellkultur-Experimenten zu analysieren ohne dabei die Anzahl oder die Funktion der Proteine zu beeinträchtigen, was einen Nebeneffekt von konventionellen Methoden wie Gen „knock-out“, RNA-Interferenz oder den Einsatz von Antikörpern darstellt. / γ-Aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) and glycine receptors (GlyRs) are the major mediators of fast synaptic inhibition in the central nervous system. For proper synaptic function their precise localization and exact concentration within the neuronal surface membrane is essential. These properties are mediated by scaffolding proteins which directly contact the large intracellular loops of the receptors and tether them to cytoskeletal elements of the neuronal cells. In my thesis I deciphered the molecular details of several underlying protein-protein interactions, namely the interaction of a subset of GABAAR and GlyR subunits with the scaffolding proteins gephyrin, radixin and collybistin. I determined short linear motifs within the large intracellular loops of the receptors that directly engage in subunit specific scaffold protein interactions. My quantitative binding studies revealed that gephyrins E domain primarily recognizes the GABAAR α1 (Kd = 17 M) and α3 (Kd = 5 M) subunits, in contrast, the SH3 domain of collybistin mainly interacts with the GABAAR α2 subunit (Kd = 1 µM), while the FERM domain of radixin tightly binds to the GABAAR α5 subunit (Kd = 8 µM). My work additionally demonstrated that this simple relationship is complicated by (i) missing or (ii) overlapping binding specificities between the scaffold proteins and the receptor subunits. Moreover, this thesis addressed the possibility of (iii) posttranslational negative regulation as well as amplification generated by (iv) avidity effects as summarized below. (i) First, using biochemical methods I mapped the radixin-GABAAR α5 interaction in detail. My structural analysis and competition assays suggest that radixin mediates the receptor subunit binding via a universal binding site within the F3 subdomain of its FERM domain. This binding site is formed by an α-helix that offers a large hydrophobic pocket, which accepts a variety of different hydrophobic residues adopting different conformations, and a β-strand that readily engages in peptide backbone interactions. Not surprisingly, this binding site has been implicated in a wide variety of different scaffold interactions, thus emphasizing the importance of the essential FERM activation mechanism described earlier and suggesting additional pathways to allow tight regulation of this interaction. (ii) Next, I analyzed in detail the process of gephyrin-mediated GABAAR clustering. My X-ray crystallographic studies and binding assays revealed that gephyrin mediates binding of the GABAAR α1, α2 and α3 subunit via a universal binding site that also mediates the interactions with the GlyR β subunit. Using structure-guided mutagenesis I identified key residues within gephyrin and the receptor subunits that act as major contributors to the overall binding strength. Namely, two conserved aromatic residues within the N-terminal half of the receptor binding region engage in crucial hydrophobic interactions with gephyrin. Accordingly, J. Mukherjee from the group of our collaborator Steven J. Moss verified a substantial decrease in GABAAR cluster number and size in primary hippocampal neurons upon exchange of these residues within the GABAAR α2 subunit. Extension of my studies to collybistin (CB) revealed an overlapping but reciprocal subunit preference for this protein in comparison to gephyrin. The GABAAR α3 subunit exclusively binds gephyrin, in contrast the GABAAR α1 subunit mainly targets gephyrin (Kd = 17 µM) but additionally displays a moderate affinity (Kd ≈ 400 µM) towards the SH3 domain of CB. The GABAAR α2 subunit binds tightly to the SH3 domain of CB (Kd = 1 µM) and additionally displays a weak gephyrin affinity (Kd ≈ 500 µM). Notably, I could exclude the possibility of synergistic effects between gephyrins E domain, the SH3 domain of CB and the GABAAR α2 subunit. Instead, I found that the GABAAR α2 subunit binds gephyrin and CB in a mutually exclusive manner. These results suggest that CBs role in receptor clustering is solely determined by competing binding events of its constituting domains. Namely, the intra-molecular association between the PH/DH domain and the SH3 domain within CB competes with different inter-molecular interactions of CB: GABAAR α2 binding to the SH3 domain, PIP2 binding to the PH domain and gephyrin presumably binding to the PH and DH domain of CB. (iii) Interestingly, the receptor motifs, which have been mapped in my thesis to directly interact with the scaffold proteins, were shown in earlier studies to be posttranslationally modified in vivo. In particular, the GABAAR α1 and GlyR β subunits have been implicated as targets of the ERK/MAPK and PKC phosphorylation-pathways, respectively, while the GABAAR α5 subunit motif was shown to be ubiquitinated. In this dissertation, I analyzed Thr348, a possible ERK phosphorylation site within GABAAR α1. My binding assays verified a severe reduction of the direct gephyrin binding strength upon introduction of the respective phosphomimetic residue. The relevance of this in vitro result was highlighted by J. Mukherjee who confirmed a significant reduction in GABAAR cluster number and size upon introduction of the same mutation. The ERK/MAPK pathway is therefore a promising candidate for regulation of GABAergic transmission. (iv) In vivo, gephyrin presumably forms a multivalent scaffold, which is based on the self-association of its G (GephG) and E domains (GephE). Given the multimeric nature of gephyrin and the pentameric receptor architecture, I tested the possibility of avidity in the clustering of inhibitory neurotransmitter receptors. Cocrystallization of selected minimum peptides with GephE and their crystal structure analyses enabled me to define a receptor-derived peptide that offers a maximized gephyrin affinity. The structure of the GephE-GlyR  receptor complex reveals two receptor-binding sites in close spatial vicinity (15 Å). I therefore designed bivalent peptides that enable to target both GephE sites at the same time and, as expected, a variety of biophysical methods verified an avidity-potentiated and unmatched high gephyrin affinity for these bidentate compounds. Notably, I could extend the dimerization approach to low affinity gephyrin ligands, namely short GABAAR-derived peptides that could not be studied using conventional monomeric ligands. Additionally, I verified that this compound specifically targets GephEs receptor binding site, and that it thereby inhibits its receptor binding activity. Further development of this molecule may offer the possibility to specifically analyze the effect of uncoupling the gephyrin-receptor interaction in cell culture-based assays, without altering protein function or expression level that accompanies conventional methods such as protein knock-out, RNA interference or the usage of antibodies.

Hohenheim, Univ., Diss., 2008.

FFifteen to thirty-five percent of the population in the United States experience tinnitus, a subjective "ringing in the ears". Up to 10% of tinnitus patients report their symptoms are severe and disabling. Tinnitus was induced in FBN rats using 116 dB (SPL) unilateral octave-band sound exposures centered at 16 kHz for one hour in an anesthetized preparation. Rats were assessed behaviorally by an operant conditioning paradigm as well as a gap detection method to verify the development of tinnitus. Both young (7 mos.) and aged (30 mos.) sound exposed rats showed significant elevated auditory brainstem-evoked response (ABR) thresholds for clix and all tested frequencies immediately after the sound exposure. Eighty days post-exposure, ABR thresholds for the young exposed rats were significantly close to the initial young control values while aged exposed rats showed residual thresholds shifts relative to aged controls. Sixteen weeks following sound exposure, young exposed rats showed significantly reduced gap detection at 24 and 32 kHz, suggestive of high frequency tinnitus. Aged exposed animals showed significant tinnitus-related behavioral changes near 10 kHz by both behavior methods. Message and protein levels of &alpha1-3 glycine receptor subunits (GlyRs), gephyrin, BDNF and its receptor TrkB were assessed in dorsal cochlear nucleus (DCN) fusiform cells 4 months post exposure utilizing quantitative in situ hybridization and immunocytochemistry. Young exposed rats showed significant decreases of GlyR &alpha1 protein at middle and high frequency regions in DCN unlike the contrasting increase of their message levels. Aged exposed rats showed higher &alpha1 subunit protein levels in the same high and middle DCN frequency regions. The GlyR anchoring protein, gephyrin, was significantly increased in both young and aged exposed rats, suggesting an intracellular receptor trafficking change following acoustic trauma. BDNF and TrkB were also increased over fusiform cells in both young and aged exposed rats. [3H] strychnine binding was used to evaluate DCN GlyR pharmacology and function following sound exposure. The age-related decrease in GlyR α1 protein was reflected in the significant age-related down-regulation of GlyR (Bmax). Tinnitus-related changes in GlyR &alpha1 protein level was reflected in the decline of the GlyR (Bmax) in young exposed rats and up-regulated GlyRs in aged exposed animals. The GlyRs in DCN of young exposed animals also demonstrated an increase in affinity, further suggesting a post-exposure receptor composition change. These findings suggest that both aging and/or sound exposure/tinnitus are associated with GlyR changes capable of altering alter the output of the DCN. Detailed characterization of these GlyR modifications could advance the development of novel selective drugs for tinnitus and age-related hearing loss.

This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay. / Neuentwickelte, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind prinzipiell geeignet, molekulare Mechanismen und zelluläre Vorgänge im niedrigen Nanometerbereich aufzulösen. Die maximal erreichbare Auflösung wird unter anderem von der eingesetzten Fluoreszenzmarkierung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich die Synthese neuartiger, funktioneller, fluoreszierender Proben und evaluiere deren Eigenschaft Gephyrin, einen universalen Marker der neuronalen inhibitorischen Postsynapse, zu visualisieren. Hierzu wurden Peptide mittels Festphasenpeptidsyntese hergestellt und mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert, die für hochauflösende Mikroskopieverfahren geeignet sind. Der Syntheseerfolg und die Reinheit der Stoffe wurde mittels massenspektrometrischer und chromatographischer Methoden bestimmt. In einem Hochdurchsatzverfahren wurden die Proben in einem zellulären Kontext untersucht, spezifisch Gephyrin zu markieren. In einem semi-automatisierten, parallelen Verfahren wurden drei ausgewählte Proben synthetisiert und deren Kolokalisation mit dem fluoreszierenden Zielprotein in transfizierten HEK-Zellen untersucht. Aus dieser Arbeit ist NN1DC hervorgegangen, eine peptidische Sonde zur Visualisierung von Gephyrin. Diese Probe weist verbesserte Färbeeigenschaften wie eine höhere Spezifität und Sensitivität, verglichen mit bisher bekannten peptidischen Gephyrinsonden, auf. Darüber hinaus kann NN1DA als hochaffiner Binder von Gephyrin zur Entwicklung neuer gephyrinbindender Moleküle in einem high-througput Verfahren genutzt werden.