Short functional peptidic probes can maximize the potential of high-end microscopy techniques and multiplex imaging assays and provide new insights into normal and aberrant molecular, cellular and tissue function. Particularly, the visualization of inhibitory synapses requires protocol tailoring for different sample types and imaging techniques and relies either on genetic manipulation or on antibodies that underperform in tissue immunofluorescence. Starting from an endogenous activity-related ligand of gephyrin, a universal marker of the inhibitory post-synapse, I developed a short peptidic multivalent binder with exceptional affinity and selectivity to gephyrin. By tailoring fluorophores to the binder, I have obtained Sylite, a probe for the visualization of inhibitory synapses, with an outstanding signal-to-background ratio, that bests the “gold standard” gephyrin antibodies both in selectivity and in tissue immunofluorescence. In tissue Sylite benefits from simplified handling, provides robust synaptic labeling in record-short time and, unlike antibodies, is not affected by staining artefacts. In super-resolution microscopy Sylite precisely localizes the post-synapse and enables accurate pre- to post-synapse measurements. Combined with complimentary tracing techniques Sylite reveals inhibitory connectivity and profiles inhibitory inputs and synapse sizes of excitatory and inhibitory neurons in the periaqueductal gray brain region. Lastly, upon probe optimization for live cell application and with the help of novel thiol-reactive cell penetrating peptide I have visualized inhibitory synapses in living neurons. Taken together, my work provided a versatile probe for conventional and super-resolution microscopy and a workflow for the development and application of similar compact functional synthetic probes. / Kurze funktionelle peptidische Sonden können das Potenzial von High-End-Mikroskopietechniken und Multiplex-Imaging-Assays maximieren und neue Erkenntnisse über normale und abweichende Molekulare-, Zelluläre- und Gewebefunktionen liefern. Insbesondere die Visualisierung inhibitorischer Synapsen erfordert eine Anpassung des Protokolls an verschiedene Probentypen und Bildgebungsverfahren und ist entweder auf genetische Manipulationen oder auf Antikörper angewiesen, die in der Gewebeimmunfluoreszenz unterdurchschnittlich abschneiden. Ausgehend von einem endogenen aktivitätsbezogenen Liganden von Gephyrin, einem universellen Marker der hemmenden Postsynapse, habe ich einen kurzen peptidischen multivalenten Binder mit außergewöhnlicher Affinität und Selektivität zu Gephyrin entwickelt. Durch die Anpassung von Fluorophoren an das Bindemittel habe ich Sylite erhalten, eine Sonde für die Visualisierung inhibitorischer Synapsen mit einem hervorragenden Signal-Hintergrund-Verhältnis, das die "Goldstandard"-Gephyrin-Antikörper sowohl in der Selektivität als auch in der Gewebe-Immunfluoreszenz übertrifft. Im Gewebe profitiert Sylite von einer vereinfachten Handhabung, bietet eine robuste synaptische Markierung in rekordverdächtig kurzer Zeit und wird im Gegensatz zu Antikörpern nicht durch Färbungsartefakte beeinträchtigt. In der Super-Resolution-Mikroskopie lokalisiert Sylite präzise die Post-Synapse und ermöglicht genaue Messungen von Prä- zu Postsynapse. In Kombination mit ergänzenden Tracing-Techniken deckt Sylite die hemmende Konnektivität auf und erstellt Profile der hemmenden Eingänge und Synapsengrößen von erregenden und hemmenden Neuronen in der periaquäduktalen Grau Hirnregion. Schließlich habe ich nach Optimierung der Sonde für die Anwendung in lebenden Zellen und mit Hilfe eines neuartigen thiolreaktiven zelldurchdringenden Peptids hemmende Synapsen in lebenden Neuronen visualisiert. Insgesamt lieferte meine Arbeit eine vielseitige Sonde für konventionelle und superauflösende Mikroskopie und einen Arbeitsablauf für die Entwicklung und Anwendung ähnlicher kompakter funktioneller synthetischer Sonden.

Différentes études précédentes ont démontré que IL-1β et PKA peuvent réduire la transmission synaptique inhibitrice dans la LAMINA II de la moelle épinière, en contribuent de cette manière au développement de douleur chronique de tipe inflammatoire. Au niveau des sites post-synaptiques, les changements dans la transmission synaptique (par exemple suivant le relâchement de IL-1β ou après l’activation de PKA), reflètent donc des changements dans les propriétés et/ou dans le nombre des molécules présentes au niveau de la synapse. Au cours de mon doctorat, j’ai pu profiter des techniques basés sur l’imagerie des molécules uniques afin d’étudier les effets de PKA et IL-1β sur la dynamiques et le nombre absolu de GlyR dans les synapses de la moelle épinière. Mes résultats ont montré que PKA et Il-1β peuvent déplacer les GlyR des sites inhibitoires post-synaptiques ciblent différentes sous-unités α du récepteur de la glycine. Comme les sous-unités GlyRα ne se lient pas directement à la géphyrine, ces effets sont vraisemblablement le résultat d’un changement de conformation du GlyR dépendant de la sous-unité. Pendant mon projet, j’ai utilisé la technique de microscopie de super-résolution PALM pour développer une méthode pour déterminer la stœchiométrie des GlyR et le nombre absolu de récepteurs et des molécules d’échafaudage au niveau des synapse de la moelle épinière. Mes résultats décrivent que les GlyR se composent de 3 sous-unités α et de 2 sous-unités β, et proposent qu’une synapse de la moelle épinière contient en moyenne 80 GlyR et 250 molécules de géphyrine. Ces résultats sont essentiels pour mettre en relation l’ampleur des mécanismes de régulation et de plasticité agissant sur la transmission synaptique, avec les changements en nombre de molécules présentes dans les synapses de la moelle épinière. Sur la base de mes découvertes on pourra maintenant étudier les mécanismes structuraux impliqués dans la régulation de la fonction et la dynamique des GlyR dépendantes des sous-unités α que j’ai démontré. / IL-1β and PKA impair glycine receptor-mediated synaptic transmission in the lamina II of the spinal cord, contributing to the development of inflammatory types of chronic pain. At post-synaptic sites, the strength of synaptic transmission depends on the biophysical properties and on the absolute number of receptors expressed. Consequently, changes in synaptic transmission (i.e. following the release of IL-1β or the activation of PKA), reflect changes in the properties and/or number of molecules present at the synapse. During my PhD I have taken advantage of single-molecule based imaging techniques to study the effects of IL-1β and PKA on the dynamics and absolute numbers of GlyRs at spinal cord synapses.My results show for the first time that both Il-1β and PKA displace GlyRs from inhibitory post-synaptic sites, targeting different α-subunit of GlyRs. Specifically, IL-1β reduces GlyR α-containing receptors at spinal cord synapse, whereas PKA affects GlyR α3L subunit. Given that the GlyR α subunits do not bind to the gephyrin scaffold, these effects likely reflect an α-subunit dependent change in GlyR conformation that decreases the affinity of the GlyR subunits for gephryrin. Glycine receptors are composed of α- and β- subunits that assemble into heteropentameric complexes with an unclear stoichiometry. Using super resolution PALM microscopy I have developed a single-molecule counting approach to determine the stoichiometry of GlyRs and the absolute number of receptor and scaffold molecules at spinal cord synapses. According to my results GlyRs is composed by 3 α and 2 β-subunits, and an average spinal cord synapse contains around 80 GlyRs and 250 scaffold molecules. These data are fundamental to relate the magnitude of regulatory and plasticity mechanisms acting on glycinergic transmission, with quantitative changes in molecule numbers at spinal cord synapses. My research has shown how absolute quantitative approaches can help achieve a more detailed insight into the organization of complex molecular assemblies and their dynamic regulation.

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La synapse est une structure macromoléculaire dont les composants sont renouvelés en permanence alors que l’assemblage est quasi-stable. A l’échelle mésoscopique, les récepteurs aux neurotransmetteurs (RN) sont accumulés dans le compartiment post-synaptique (PSD). Cette accumulation résulte de la diffusion latérale des RNs dans la membrane neuronale et de leurs immobilisations transitoires dans la PSD. Les protéines d’échafaudage (PE) localisées sous la membrane post-synaptique constituent des sites de capture en interagissant avec les RNs. Mon travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec des chimistes et des physiciens afin de comprendre les paramètres impliqués dans le processus de diffusion-capture. Nous nous sommes intéressés au cas de la capture du récepteur de la glycine (RGly) par les agrégats de PEs des synapses inhibitrices, les géphyrines. Nous avons étudié l’impact de la liaison RGly-géphyrine sur le processus de diffusion-capture sous deux aspects. Le premier est lié à la nature bimodale de liaison du RGly. Le second aborde l’impact des phosphorylations de la boucle M3-M4 de la sous-unité β du RGly sur la liaison avec la géphyrine.Mon travail de thèse montre qu’il est maintenant possible, en utilisant des approches de microscopie super-résolutive, de quantifier les aspects thermodynamiques des interactions moléculaires dans les cellules vivantes. / The synapse is a macromolecular structure whose components are constantly renewed while the assembly remains quasi-stable. At the mesoscopic level, neurotransmitter receptors (RNs) accumulate in the post-synaptic compartment (PSD). This accumulation is the result of the lateral diffusion of RNs in the neuronal membrane and transient immobilization within the PSD. This mechanism, called diffusion-trapping has been highlighted by single-molecule-tracking techniques. Scaffold proteins (PE) are localized under the post-synaptic membrane. These proteins form trapping-sites by interacting with RNs. Through an interdisciplinary approach in collaboration with chemists and physicists, the aim of my doctoral research was to understand the parameters that are involved in diffusion-trapping mechanisms. We especially focused on glycine receptor (RGly) trapping by PE clusters at inhibitory synapses, namely the scaffold protein gephyrin. The gephyrin- interaction motif of the GlyR is located within the cytoplasmic domain of the β-subunit of the receptor, the so-called β-loop. Two aspects of the impact of RGly-gephyrin binding on diffusion-trapping were studied. The first was to identify the source of the RGly-gephyrin bimodal binding. The second one addressed the regulation of gephyrin binding by phosphorylation of the GlyR βLoop.My research thus shows that it is now possible to quantify thermodynamic aspects of molecular interactions in living cells using high-density single-molecule-tracking.

La microscopie optique stochastique de reconstruction (STORM) contourne la limite de diffraction en enregistrant des signaux monomoléculaires spatialement et temporellement séparés, atteignant une résolution de ~10-40 nm. Dans mon étude, j'ai développé une stratégie d'imagerie et d'analyse de données dSTORM bicolore afin d'étudier l'ultrastructure des synapses inhibitrices mixtes. Mes résultats ont montré que les GlyRs, les GABAARs, la géphyrine et RIM1/2 présentent une organisation intra-synaptique hétérogène et forment des domaines sous-synaptiques (SSDs). Les GlyR et les GABAAR ne sont pas complètement mélangés, mais peuvent occuper des espaces différents à la densité post-synaptique (PSD). De plus, les SSD de géphyrine postsynaptique sont alignées avec les SSD de RIM1/2 pré-synaptiques, formant des nanocolonnes trans-synaptiques. Au cours d'une activité neuronale élevée par traitement 4-AP, la corrélation spatiale entre les GlyRs, les GABAARs et la géphyrine a augmentée au PSD. De plus, la corrélation spatiale des GlyRs et RIM1/2 a également augmenté, tandis que celle des GABAARs et RIM1/2 n'a pas changé. Le nombre de SSD par synapse pour ces protéines synaptiques n'est pas modifié par 4-AP. Cette étude fourni un nouvel angle de compréhension des mécanismes sous-jacents à la co-transmission GABAergique/glycinergique. / Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) bypasses the diffraction limit by recording spatially and temporally separated single molecule signals, achieving a resolution of ~10-40 nm. In my study, I have developed a two-color dSTORM imaging and data analysis strategy, in order to investigate the ultrastructure of mixed inhibitory synapses. My results show that GlyRs, GABAARs, gephyrin and RIM1/2 exhibit a heterogeneous intra-synaptic organization and form sub-synaptic domains (SSDs). GlyRs and GABAARs were not fully intermingled, but sometimes occupied different spaces at the post-synaptic density (PSD). In addition, post-synaptic gephyrin SSDs were aligned with pre-synaptic RIM1/2 SSDs, forming trans-synaptic nanocolumns. During elevated neuronal activity by 4-AP treatment, the spatial correlation between GlyRs, GABAARs and gephyrin was increased at the PSD. Moreover, the spatial correlation of GlyRs and RIM1/2 was also increased, while that of GABAARs and RIM1/2 did not change. The number of SSDs per synapse for these synaptic proteins was not changed by 4-AP. My study thus provides a new angle for understanding the mechanisms underlying GABAergic/glycinergic co-transmission.