Le suivi de molécules uniques est utile pour comprendre le déroulement d'un processus biologique.<br />Il permet de sonder des propriétés dynamiques inaccessibles pas des mesures d'ensemble.<br />Nous présentons les nanocristaux semiconducteurs et montrons qu'ils permettent de combiner<br />les avantages des autres marqueurs fluorescents avec une grande photostabilité et un très bon rapport<br />signal à bruit.<br />Nous exposons une approche de suivi automatique dédiée à ces nano-objets scintillants. Nous<br />discutons les méthodes spécifiquement adaptées à l'analyse des trajectoires ainsi obtenues.<br />Nous appliquons ces techniques d'imagerie ultrasensible à l'étude de la dynamique membranaire<br />du récepteur de la glycine (RGly) dans les milieux vivants. Nous présentons une étude sur<br />l'implication du cytosquelette dans la régulation du nombre de RGly aux synapses. Nous examinons<br />les interactions entre le RGly et la géphyrine (sa protéine d'ancrage) dans des systèmes cellulaires<br />modèles et caractérisons l'équilibre correspondant.

La synapse est une structure macromoléculaire dont les composants sont renouvelés en permanence alors que l’assemblage est quasi-stable. A l’échelle mésoscopique, les récepteurs aux neurotransmetteurs (RN) sont accumulés dans le compartiment post-synaptique (PSD). Cette accumulation résulte de la diffusion latérale des RNs dans la membrane neuronale et de leurs immobilisations transitoires dans la PSD. Les protéines d’échafaudage (PE) localisées sous la membrane post-synaptique constituent des sites de capture en interagissant avec les RNs. Mon travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec des chimistes et des physiciens afin de comprendre les paramètres impliqués dans le processus de diffusion-capture. Nous nous sommes intéressés au cas de la capture du récepteur de la glycine (RGly) par les agrégats de PEs des synapses inhibitrices, les géphyrines. Nous avons étudié l’impact de la liaison RGly-géphyrine sur le processus de diffusion-capture sous deux aspects. Le premier est lié à la nature bimodale de liaison du RGly. Le second aborde l’impact des phosphorylations de la boucle M3-M4 de la sous-unité β du RGly sur la liaison avec la géphyrine.Mon travail de thèse montre qu’il est maintenant possible, en utilisant des approches de microscopie super-résolutive, de quantifier les aspects thermodynamiques des interactions moléculaires dans les cellules vivantes. / The synapse is a macromolecular structure whose components are constantly renewed while the assembly remains quasi-stable. At the mesoscopic level, neurotransmitter receptors (RNs) accumulate in the post-synaptic compartment (PSD). This accumulation is the result of the lateral diffusion of RNs in the neuronal membrane and transient immobilization within the PSD. This mechanism, called diffusion-trapping has been highlighted by single-molecule-tracking techniques. Scaffold proteins (PE) are localized under the post-synaptic membrane. These proteins form trapping-sites by interacting with RNs. Through an interdisciplinary approach in collaboration with chemists and physicists, the aim of my doctoral research was to understand the parameters that are involved in diffusion-trapping mechanisms. We especially focused on glycine receptor (RGly) trapping by PE clusters at inhibitory synapses, namely the scaffold protein gephyrin. The gephyrin- interaction motif of the GlyR is located within the cytoplasmic domain of the β-subunit of the receptor, the so-called β-loop. Two aspects of the impact of RGly-gephyrin binding on diffusion-trapping were studied. The first was to identify the source of the RGly-gephyrin bimodal binding. The second one addressed the regulation of gephyrin binding by phosphorylation of the GlyR βLoop.My research thus shows that it is now possible to quantify thermodynamic aspects of molecular interactions in living cells using high-density single-molecule-tracking.

La microscopie optique stochastique de reconstruction (STORM) contourne la limite de diffraction en enregistrant des signaux monomoléculaires spatialement et temporellement séparés, atteignant une résolution de ~10-40 nm. Dans mon étude, j'ai développé une stratégie d'imagerie et d'analyse de données dSTORM bicolore afin d'étudier l'ultrastructure des synapses inhibitrices mixtes. Mes résultats ont montré que les GlyRs, les GABAARs, la géphyrine et RIM1/2 présentent une organisation intra-synaptique hétérogène et forment des domaines sous-synaptiques (SSDs). Les GlyR et les GABAAR ne sont pas complètement mélangés, mais peuvent occuper des espaces différents à la densité post-synaptique (PSD). De plus, les SSD de géphyrine postsynaptique sont alignées avec les SSD de RIM1/2 pré-synaptiques, formant des nanocolonnes trans-synaptiques. Au cours d'une activité neuronale élevée par traitement 4-AP, la corrélation spatiale entre les GlyRs, les GABAARs et la géphyrine a augmentée au PSD. De plus, la corrélation spatiale des GlyRs et RIM1/2 a également augmenté, tandis que celle des GABAARs et RIM1/2 n'a pas changé. Le nombre de SSD par synapse pour ces protéines synaptiques n'est pas modifié par 4-AP. Cette étude fourni un nouvel angle de compréhension des mécanismes sous-jacents à la co-transmission GABAergique/glycinergique. / Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) bypasses the diffraction limit by recording spatially and temporally separated single molecule signals, achieving a resolution of ~10-40 nm. In my study, I have developed a two-color dSTORM imaging and data analysis strategy, in order to investigate the ultrastructure of mixed inhibitory synapses. My results show that GlyRs, GABAARs, gephyrin and RIM1/2 exhibit a heterogeneous intra-synaptic organization and form sub-synaptic domains (SSDs). GlyRs and GABAARs were not fully intermingled, but sometimes occupied different spaces at the post-synaptic density (PSD). In addition, post-synaptic gephyrin SSDs were aligned with pre-synaptic RIM1/2 SSDs, forming trans-synaptic nanocolumns. During elevated neuronal activity by 4-AP treatment, the spatial correlation between GlyRs, GABAARs and gephyrin was increased at the PSD. Moreover, the spatial correlation of GlyRs and RIM1/2 was also increased, while that of GABAARs and RIM1/2 did not change. The number of SSDs per synapse for these synaptic proteins was not changed by 4-AP. My study thus provides a new angle for understanding the mechanisms underlying GABAergic/glycinergic co-transmission.