G protein-coupled receptors (GPCRs) are a large family of trans-membrane receptors that transmit signals from extracellular stimuli to target intracellular signal transduction pathways. The gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRH-R) is a GPCR which binds the decapeptide GnRH. In the pituitary gonadotrope, GnRH stimulates gonadotropin (LH and FSH) biosynthesis and secretion to regulate reproduction. GnRH and the GnRH-Rs are also present in many extra-pituitary tissues, although their role at these sites remains largely undetermined. GnRH-Rs are known to recruit a diverse array of signalling pathway mediators in different cell-types. These include; Gq/11-PLCβ-IP3/DAG-Ca2+/PKC signalling, monomeric G-proteins and integrins to mediate cell adhesion and migration, the activation of the major members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) super-family (extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal Kinase (JNK) and p38MAPK), and β-catenin and other mediators of the canonical Wnt signalling pathway. This thesis describes the regulation of Forkhead Box O (FOXO) transcription factors by GnRH. The mammalian FOXO transcription factors, FOXO1, FOXO3a and FOXO4, are emerging as an important family of proteins that modulate the expression of genes involved in cell-cycle regulation, induction of apoptosis, DNA damage repair and response to oxidative stress. In this thesis, emphasis is placed on delineating the novel role of FOXO transcription factors in mediating two important and widely-researched areas of GnRH biology. Firstly, the role of FOXO transcription factors in mediating cell-growth inhibition in response to GnRH treatment is assessed in a heterologous HEK293/GnRH-R expressing cell line. Secondly, the role of transcription factors in regulating luteinising hormone-β (LHβ)-subunit expression is investigated in the LβT2 gonadotrope cell line. Activation of the GnRH-R can inhibit cell proliferation and induce apoptosis in certain tumour-derived cell lines. Several studies have reported that these events can occur as a result of changes in the expression profiles of specific cell-cycle regulatory and apoptotic genes, many of which are FOXO-target genes, including GADD45, FasL, p21Cip1 and p27Kip1. In this thesis, a role for FOXOs in targeting the expression of several of these genes in response to GnRH is assessed, highlighting a specific role for FOXO3a in mediating GADD45 and FasL expression. The signalling mechanisms through which FOXO3a regulates GADD45 expression in response to GnRH is also described. Finally, a stable FOXO3a-knock-down cell line was generated in order to further examine FOXO3a involvement in GnRH-induced cell-growth inhibition. GnRH is an essential regulator of the reproductive process by stimulating the synthesis of LH and FSH in pituitary gonadotropes, thereby regulating gametogenesis and steroidogenesis. Diverse signalling pathways have been reported to regulate LHβ-subunit expression in response to GnRH, including the ERK/JNK/p38MAPK cascades and factors such as Egr1, SF1 and β-catenin. In the second part of this thesis, the role of FOXOs in regulating LHβ-subunit expression in response to GnRH is described. The data presented suggests that GnRH can regulate LHβ-subunit expression through both indirect and direct FOXO3a-mediated mechanisms. Firstly, FOXO3a was found to regulate Egr1 expression to indirectly target LHβ-promoter activity. Secondly, a role for β-catenin as a FOXO3a co-factor to directly regulate LHβ-subunit expression, together with Egr1 and SF1, is also proposed. FOXO3a expression and sub-cellular localisation was assessed and demonstrated in LβT2 cells and in adult human male pituitary sections. The research presented in this thesis adds to the diversity of signalling pathways and mediators that GnRH can target in different cellular backgrounds in order to mediate a variety of cellular processes. The antiproliferative and apoptotic effects of GnRH on tumour-derived cell lines are well-documented, and this research highlights a novel role for FOXO3a in mediating these events. The regulation of gonadotropin synthesis remains an important topic of research, and the novel implication of FOXO3a in mediating LHβ-subunit expression adds further complexity to gonadotrope physiology.

A major area of interest is the identification of proteins that play a role in hormone dependent cancers and in collaboration with the MRC Centre for Reproductive Health we studied the gonadotropin releasing hormone receptor (GnRH-R). Other targets described in the thesis are the SH3 domain of PSD-95 and the protein BLyS. In order to identify potential inhibitory small molecules we have used a variety of computational data base mining approaches as well as using and developing experimental binding assays. It has become increasingly challenging to evaluate the most representative drug like small molecule compounds when using traditional high throughput screening methods. This thesis assesses the use of in silico tools to probe key protein-protein and protein-peptide interactions. These tools provide a means to identify enriched compound datasets which can be purchased and tested in vitro in a time and cost efficient way. The transmembrane protein GnRH-R provides an interesting opportunity to identify small molecules that could inhibit the binding of its peptide ligand GnRH. This is a challenging project as there are few examples in the literature of drug-like molecules that bind to such protein-peptide interfaces. The first step involved receptor modelling using solved crystal structures of homologous proteins. The model was then validated by developing structure activity relationships for established high affinity ligands. We also performed crystallographic and biophysical studies on the native GnRH decapeptide. Two other protein-protein systems were also examined using the same virtual screening and experimental ligand binding methodology. SH3 domains play an important role in cell signalling and we used the PSD-95 protein as our target for study as a crystal structure has been published. As well as identifying potential ligands we characterised structural properties of PSD-95 fusion proteins and also developed the basis for compound assay. The third system studied was B Lymphocyte Stimulator (BLyS) which is a target for treatment of a number of autoimmune diseases. This presented an interesting target for study as the protein binds to multiple receptors depending on its multimeric state. BLyS protein was characterised using electron microscopy and other biophysical techniques.

Die GABA-ergen Neurone als Teil des GnRH-Netzwerkes spielen eine Rolle bei den Veränderungen der altersabhängigen Prozesse der Reproduktionsfunktion. Um die Regulation der gonadalen Steroide auf die Expression von GAD in reproduktionsabhängigen Regionen zu untersuchen, wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit das männliche Rattenmodell gewählt. Nach der Untersuchung des endokrinen Zustands der Tiere anhand der Radioimmunoassay-Methode (RIA) wurden die zellulären Gentranskripte der beiden Isoformen von GAD, GAD65 und GAD67, mittels der Methode der in situ Hybridisierung in der POA, im Nukleus suprachiasmaticus (SCN), im mediobasalen Hypothalamus (MBH) und im Gyrus dentatus bestimmt. In allen untersuchten Regionen konnte nach der Kastration und einer anschließenden dreiwöchigen Erholungszeit kein Effekt beobachtet werden. Die Administration von Estradiol bewirkt in der POA eine signifikante Erhöhung der Expression von GAD65 und GAD67 um nahezu 40%. In den restlichen Regionen konnte dagegen kein Effekt gemessen werden. Die Testosteronbehandlung zeigte eine negative Wirkung auf die Regulation nur von GAD67: Eine 30%-ige Abnahme in der POA und eine 15%-ige im SCN. Im Gegensatz dazu trat im MBH und im Gyrus dentatus eine Verminderung der Expression nur bei GAD65 auf. Aus den hier vorgestellten Ergebnissen kann folgendes abgeleitet werden: Testosteron und Estradiol regulieren in unterschiedlicher Weise die Expression von GAD und so wiederum die inhibitorische Funktion von GABA. Da in der SCN, im MBH und im Gyrus dentatus im Gegensatz zu Estradiol eine Testosteron-Wirkung gemessen wurde, existiert eine eigene androgene Regulation von GAD. Weil die Estradiol-Zugabe eine Zunahme der Expression von GAD bewirkte und dieser Effekt von einer Abnahme der LH-Konzentration im Serum der betroffenen Tiergruppe begleitet wurde, ist die These bestätigt, dass GABA mit ihren inhibitorischen Funktionen zur Übermittlung der positiven Rückkopplung von Estradiol auf die LH-Freisetzung auf der Ebene der POA und nicht auf der Ebene der Axone agiert. Im Gegensatz zu Estradiol kann eine Progesteronbehandlung bei persistent östrischen Ratten einen LH-Peak auslösen und somit den Östrus-Zyklus wieder in Gang bringen. Aufgrund dieser Tatsache wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit ein Tiermodell zur Untersuchung der molekularbiologischen altersabhängigen Veränderungen entwickelt. Dabei wurden drei Monate alte proöstrische Ratten (Y) und 12 Monate alte persistent östrische Ratten (MA) benutzt. Die MA-Ratten wurden mit Progesteron behandelt. Sowohl die MA-Ratten als auch die Y-Ratten wurden um 13 Uhr und um 17 Uhr getötet. Eine unbehandelte MA-Gruppe, deren Tiere um 10 Uhr getötet wurden, diente hier als Kontrollgruppe. Anhand der LH-Messung der untersuchten Gruppen wurde ein Kontrollwert (5 ng/ml LH) für die positive Reaktion der Tiere auf Progesteron (responding animals) festgestellt. Es konnte bei 44% der persistent östrischen Ratten ein erhöhter LH-Spiegel erfolgreich wieder erreicht werden. In den Gruppen dieses Modells entstand eine Analogie zwischen den Gruppen der behandelten MA-13-Uhr und Y-13-Uhr Tiere sowie zwischen den responding animals und den Y-17 Uhr-Tieren. Um aussagekräftige statistische Veränderungen entlang der hypothalamo-hypophysio-ovariellen Achse in individuellen Tieren zu erhalten, wurde die Taqman®-PCR und die quantitative, kompetitive RT-PCR eingesetzt. Dabei wurden die folgenden Gene untersucht: ER α und ER β, GnRH, GnRH-R, GAD65 und GAD67, sowie FSH-β. In der POA, Hypophyse und im Ovar wurde altersabhängigen Genexpression beobachtet: Eine signifikante Abnahme der Expression von ER β sowohl in der Gruppe responding animals als auch in deren analoger Gruppe wurde in der POA (34 %), Hypophyse (44 %) und im Ovar (um die 30 %) gemessen. In der Hypophyse verzeichneten die mRNA-Transkripte von ER α bei der Gruppe der behandelten mittelalten Ratten der 13 Uhr-Gruppe eine Zunahme von 55% und bei der 13-Uhr-Gruppe der jungen Ratten einen Anstieg von 153 %. Ebenso nehmen die mRNA-Konzentrationen von FSH-β sowohl bei den responding animals als auch bei deren analoger Gruppe in gleichem Masse (ungefähr 300 %) zu. Da die Veränderungen der Expression von ER β, ER α und FSH-β bei den zwei analogen Gruppen auftritt, ist zu vermuten, dass diese Gene altersabhängig expremiert und an der Zyklusregulation ursächlich beteiligt sind. Die restlichen Gene zeigten entlang der Achse keine altersrelevanten Veränderungen. Da ER β-Expressionsveränderungen in der POA, in der Hypophyse und im Ovar gemessen wurden, konnte der wichtigste Schluss der hier vorgestellten Untersuchungen gezogen werden, dass nämlich ER β für den Erhalt des Zyklus essentiell sein kann. In diesem Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur molekular biologischen Untersuchung der altersabhängigen Veränderungen mit sehr zufriedenstellender Ausbeute zur Wiederherstellung des Östrus-Zyklus (44%) erfolgreich entwickelt. Dieses Modell ermöglichte darüber hinaus die Untersuchung einer relativ hohen Anzahl an Genen entlang der hypothalamo-hypophysio-ovariellen Achse.