La creciente demanda de información genética en campos cada vez más variados ha llevado al desarrollo de nuevas metodologías de análisis de DNA. El Proyecto Genoma Humano ha contribuido en favorecer la creación de metodologías analíticas que den información genética de manera rápida y fiable para poder culminarlo. Además, los resultados derivados del PGH han generado nuevos mercados para la genética, abriendo las puertas a nuevas posibilidades analíticas. Para continuar con estos avances, los dispositivos de análisis futuros deben reunir ciertas características tales como alta eficacia, rapidez, simplicidad y bajo coste. En la presente tesis se ha planteado como objetivo la construcción de genosensores robustos y económicos y cuya utilización no requiera supervisión profesional. Por este motivo, los transductores electroquímicos fueron nuestros candidatos de estudio por sobre otras transducciones como la óptica. Nuestros esfuerzos se dirigieron hacia la inmovilización por adsorción física del DNA debido a que es compatible con el desarrollo de dispositivos de fabricación masiva y de bajo coste. Así, se han estudiado y caracterizado distintos transductores y el que mostró propiedades físicas y electroquímicas extraordinarias fue el composite grafito-epoxi.En una primera instancia nos planteamos la construcción de genosensores amperométricos de membranas recambiables en las que el DNA se inmovilice sobre el nylon, que es el soporte más utilizado en los métodos de análisis clásicos de DNA. Los protocolos de inmovilización, hibridación y marcación enzimática sobre este soporte son muy conocidos y utilizados de manera masiva. Por primera vez una membrana de nylon modificada con DNA se integró al transductor grafito-epoxi para la detección del evento de hibridación. Vale la pena destacar además que debido a las falencias en las metodologías de detección del DNA en genosensores electroquímicos, se utilizó por primera vez un sistema de marcación basado en la enzima HRP, acoplada al DNA mediante la interacción biotina-estreptavidina, hasta ahora no utilizado en genosensores electroquímicos.Los resultados obtenidos se compararon con genosensores en los cuales el DNA se inmovilizó por adsorción física sobre un composite grafito-epoxi. Estos genosensores mostraron unas propiedades excelentes en comparación con los genosensores de membranas recambiables. Las señales amperométricas fueron sensiblemente superiores, el tiempo de hibridación se consiguió reducir desde 15 horas a 45 minutos, se pudieron detectar de 10 a 100 veces menos cantidad de analito, y la adsorción inespecífica fue notablemente inferior.Finalmente, el genosensor basado en un composite grafito-epoxi se ha aplicado también a diversos formatos. El formato de captura es el más idóneo para ser implementado en forma de kit, ya que permite tener pre-preparados los dispositivos genosensores con la sonda de captura inmovilizada. Los genosensores se podrían fabricar con procedimientos planares de fabricación masiva, lo que aumentaría sus perspectivas comerciales.Finalmente, se ha demostrado la utilidad de los dispositivos genosensores en la determinación de Salmonella, mediante el acoplamiento de la PCR y la detección del amplicón con el genosensor amperométrico. El procedimiento total de análisis fue de 6 a 8 hs, en contraste con los 3 a 5 días requeridos para la determinación con métodos microbiológicos clásicos. El nuevo dispositivo genosensor que se ha desarrollado, basado en un composite grafito-epoxi, cumple con todos los requerimientos que se habían planteado en los objetivos: es robusto, sensible, de bajo coste, capaz de ser miniaturizado y de ser construido en distintas configuraciones, su uso es sencillo y su respuesta es rápida, se ha demostrado su capacidad de ser utilizado para medidas de campo, y es viable su implementación en kits genosensores. Además, puede aplicarse a diversas situaciones analíticas y en campos de análisis genético tan variados como medicina, biotecnología y biología molecular y en determinaciones forenses, medioambientales y, principalmente, industriales. / The growing demand for genetic information in increasingly varied fields has generated new methodologies for DNA analysis. The Human Genome Project (HGP) has multiplied the demand for these techniques as it requires analytical methodologies that produce genetic information quickly and reliably. Furthermore, the knowledge obtained from the HGP has expanded the market which requires genetic devices, hence, generating new applications. To sustain these advancements, future analytical devices should be highly efficient, quick, simple and low-cost. The aim of the present thesis is to build robust and economical genosensors that can be used without professional supervision. For these reasons, electrochemical transducers were our obvious choice over other possibilities such as optical devices. Our efforts were directed towards the immobilisation of DNA using physical adsorption as this procedure is compatible with the development of mass-produced and low-cost devices. Several transducers were studied and characterised in the course of this work and we found that the graphite-epoxy composite showed extraordinary physical and electrochemical properties. At first we directed our efforts towards the development of amperometric genosensors with exchangeable membranes where DNA is immobilised on nylon as it is the more widely used support material in classical DNA techniques. The protocols for immobilisation, hybridisation and enzyme labelling using this support material are widely known and used. For the first time a nylon membrane modified with DNA was integrated to a graphite-epoxy transducer for the detection of the hybridisation event. It is worth noticing that a labelling system based on the HRP enzyme coupled to DNA through the biotin-streptavidin interaction was used for the first time due to the shortcomings of DNA detection methodologies using electrochemical genosensors. This setup had not been reported previously for electrochemical genosensors. The results obtained were compared to those of genosensors where DNA was immobilised using physical adsorption on a graphite-epoxy composite. The latter genosensors showed excellent properties compared to those with changeable membranes. Amperometric signals were sizeably larger, hybridisation time was reduced from 15 hours to 45 minutes, 10 to a 100 times less analyte could be detected and unspecific adsorption was noticeably lower. Finally, genosensors based on a graphite-epoxy composite was applied to several formats. The capture format is the most suitable for use in a kit form as it allows to have the genosensing devices already prepared with the immobilised capture probe. Genosensors could be built using mass-production planar procedures, raising their commercial potential. Lastly, the usefullness of genosensors was demonstrated in the detection of Salmonella using PCR coupling and the detection of the amplicon using the amperometric genosensor. The total analytical procedure took from 6 to 8 hs, in contrast to the 3 to 5 days required with classical microbiological methods. The new genosensor developed based on a graphite-epoxy composite fulfils all the requirements stated as part of the objectives of the present work. These requirements include robustness, sensitivity, low-cost, capability of miniaturisation, capability of being built in several configurations, ease of use and quickness. The devices proved to be useful in field studies and they can be used to produce genosensor kits. Additionally, they can be applied to a wide range of analytical situations and in a wide range of genetic analytical fields including medicine, biotechnology and molecular biology as well as forensic examinations, and environmental and industrial applications.

La creciente demanda de metodologías analíticas simples, selectivas y de bajo coste para el análisis cuantitativo o semicuantitativo de analitos de variada naturaleza en muestras complejas ha favorecido el desarrollo de alternativas analíticas a los métodos clásicos de análisis. En este contexto, en la presente tesis se ha planteado como objetivo la construcción de biosensores robustos y económicos y cuya utilización no requiera supervisión profesional, para la detección descentralizada y fiable de compuestos de interés en la seguridad alimentaria y en el control medioambiental. Debido a la experiencia de nuestro grupo de trabajo y a las demostradas ventajas del material grafito-epoxi (GEC) como transductor electroquímico, se dirigieron los esfuerzos hacia la construcción de nuevos transductores basados en compósitos rígidos grafito-epoxi. Así, se abordaron dos líneas distintas de investigación: la primera, dirigida hacia la construcción de transductores biocompósitos grafito-epoxi (GEB) modificados en volumen con biomoléculas de afinidad universal, para la inmovilización de enzimas, anticuerpos, u oligonucleótidos y, la segunda, en el desarrollo de nuevos protocolos para la detección electroquímica de biomoléculas inmovilizadas en partículas magnéticas, mediante el diseño de un sensor con propiedades magnéticas, m-GEC. Abordando el primer eje de esta tesis, se estudiaron diferentes moléculas de afinidad universal para la preparación de biocompósitos, tales como la proteína A y la proteína G (para la inmovilización de anticuerpos de diferentes especificidades a través del Fc) y la estrept(avidina), para la inmovilización de prácticamente cualquier analito biotinilado, sea este enzimas, oligonucleótidos o anticuerpos. Así, se construyeron exitosamente biocompósitos de avidina (Av-GEB) capaces de inmovilizar con una excelente orientación, oligonucleótidos, enzimas y anticuerpos. Del mismo modo se diseñaron y construyeron plataformas universales para la inmovilización de anticuerpos basados en biocompósitos grafito-epoxi de proteína A (ProtA-GEB). Usando esta plataforma se consiguieron inmovilizar anticuerpos de las más variada naturaleza a través de su fracción constante para la detección de diferentes analitos como, por ejemplo, atrazina en zumo de naranja o en aguas embotelladas, alcanzando límites de detección por debajo del límite de 0.1 ?g L-1 fijado por la legislación europea. Además de estas plataformas electroquímicas de afinidad universal, se construyeron con éxito inmunocompósitos grafito-epoxi de afinidad específica (Ab-GEB), en concreto inmunocompósitos anti-atrazina para la determinación de este analito en muestras reales con una alta sensibilidad. Resultados muy prometedores se han obtenido también con el segundo eje de la presente tesis, mediante ensayos llevados a cabo con un nuevo sensor magnético basado en compósito grafito-epoxi (m-GEC) y esferas magnéticas modificadas con bioespecies. Las partículas magnéticas representan una nueva estrategia para bioanálisis que aportan numerosas ventajas adicionales. Después de un estudio exhaustivo de la inmovilización de biomoléculas sobre diferentes tipologías de esferas magnéticas funcionalizadas por diferentes grupos químicos (tosil y carboxilo) o moléculas biológicas (proteína A), se consiguió inmovilizar con éxito anticuerpos para la determinación de una familla de antibióticos (sulfonamidas) en muestras alimentarias y de anticuerpos para la determinación de atrazina en muestras alimentarias y medioambientales. Con esta estrategia se consiguió detectar atrazina en muestras tales como agua de consumo y zumo de naranja, y sulfonamidas en leche fresca o UHT entera, desnatada y semidesnatada. En este último caso, se ha conseguido rebajar en un factor de 100 los límites de detección fijados por la legislación europea. Por último, y para concluir, con el objetivo final de desarrollar en un futuro un sistema de detección de DNA de E. coli patógenas basado m-GEC y detección electroquímica, para la aplicación en seguridad alimentaria en cuanto a bacterias patógenas, se ha desarrollado un sistema de primers específicos basados en experimentos de RT-PCR. / The increasing interest in simple, selective and cost-effective analytical methodologies for quantitative analysis in different complex samples is related with the development of analytical alternatives beside instrumental methods of analysis. This thesis is focused on the development of robust, low-cost, user-friendly biosensors, for the accurate detection of compound related with food safety and environmental monitoring. One of the main expertise area in our group is the construction of conducting and rigid graphite-epoxy composites. Due to our experience as well as the improved properties of this transducer material, the research was focused on the construction of novel transducers based on rigid graphite-epoxy composite (GEC). On one hand, this thesis was focused on the construction of graphite-epoxy biocomposite (GEB) transducer bulk-modified with universal affinity biomolecules for the improved immobilization of enzymes, antibodies and oligonucleotides. On the other hand, the development of novel strategies for the electrochemical detection of biomolecules previously immobilized on magnetic beads was also performed, by the construction of a novel magneto sensor based on graphite-epoxy composite (m-GEC). In order to design graphite-epoxy biocomposite based-transducers, different universal affinity molecules such as protein A and G -for the immobilization of antibodies through the Fc region-, and strept(avidin) -for the immobilization of almost any biotinylated biomolecules such as enzymes, DNA or antibodies- were studied. Avidin graphite-epoxy biocomposite transducers -Av-GEB- with improved immobilizing properties for biotinylated DNA, antibodies and enzymes were constructed and electrochemically evaluated. In a similar way, protein A graphite-epoxy biocomposite (ProtA-GEB) transducers for the improved immobilization of antibodies with different specificities were also constructed. Atrazine in bottled water samples as well as orange juices were determined by immunosensing with this strategy, reaching the maximum residues limits established by the European Commission (0.1 ?g L-1). Beside these universal affinity platforms, graphite-epoxy immunocomposite transducers (Ab-GEB) with specific affinity were constructed for the specific detection of atrazine in real samples with high sensitivity. On the other hand, very promising results were also achieved with a novel magneto sensor based on graphite-epoxy composite (m-GEC) and magnetic beads modified with biomolecules. Magnetic beads provide further improvement to a bioassay, such as better and easier separation of the biomolecule from the complex sample. After a carefully study of the different modified magnetic beads (such as tosyl, carboxilate and Protein A modified magnetic beads), a class specific antibodies for the determination of sulfonamides as well as the specific anti-atrazine antibody were immobilized on tosyl modified magnetic beads. The detection of atrazine in water samples and orange juices, as well as sulfonamides in skimmed, semi-skimmed and full cream UHT and raw full cream milk samples was achieved following this strategy with remarkable sensitivity and reaching by far the maximum residues limits established by the European Commission. Finally, the design of a set of specific primers for the detection of pathogenic E. Coli by RT-PCR has been described. This system will be used in the electrochemical genosensing based on m-GEC of pathogenic bacteria in a near future.