Die akute Graft-versus-Host-Krankheit (GvHD) ist eine der Hauptkomplikationen nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation, die die Effizienz der Therapie und deren Einsatz limitiert. Aktuelle Präventionsstrategien und Therapien beinhalten systemisch wirkende Immunsuppressiva. Diese haben oft zahlreiche Nebenwirkungen und erhöhen die Rate von Tumorrezidiven und schweren Infektionen. Therapierefraktäre Verläufe der GvHD sind häufig und können mit einer schlechten Prognose vergesellschaftet sein. Neuartige Präventions- und Behandlungsansätze sind daher Gegenstand intensiver Forschung. Eine zentrale Rolle in der Pathogenese der akuten GvHD spielen CD4+ T Zellen. Alloreaktive T Zellen vermitteln eine proinflammatorische Immunantwort, produzieren entsprechende Zytokine und aktivieren weitere Effektorzellen. Diese Immunkaskade induziert eine systemische Entzündungsreaktion und führt zu Organ- und Gewebsschädigung. Der spezifischen Modulation dieser alloreaktiven CD4+ T Zellen hin zu einer Toleranzentwicklung gegenüber dem Empfängergewebe wird eine große Bedeutung in der Entwicklung innovativer GvHD-Präventionsstrategien beigemessen. Es konnte in murinen Modellen gezeigt werden, dass die ex vivo-Behandlung eines allogenen bzw. xenogenen Transplantats mit dem CD4-gerichteten nicht-depletierenden Antikörper MAX.16H5 zu einer verminderten GvH-Reaktion führte. Eine Beeinträchtigung des Graft-versus-Leukämie-Effekts war nicht nachweisbar. Toleranzinduktionen durch monoklonale Antikörper gegen Oberflächenrezeptoren von Immunzellen im Rahmen von Autoimmunerkrankungen und GvHD werden in zahlreichen Studien untersucht. Darüber hinaus ist bekannt, dass in der GvHD-Pathogenese bestimmte microRNAs, 17 bis 25 Nukleotide lange, nicht kodierende, einzelsträngige RNA-Moleküle, eine Schlüsselrolle spielen. Die molekularen Mechanismen, die der Toleranzentwicklung des MAX.16H5 Antikörpers zugrunde liegen, sind jedoch nicht abschließend geklärt. Daher war es Ziel der vorliegenden Doktorarbeit (i) ein in vitro Stimulationsmodell für weitergehende Untersuchungen am MAX.16H5 Antikörper zu etablieren und (ii) durch Quantifizierung der microRNA-Expression unter T Zellstimulierung zur Aufklärung von molekularen Mechanismen der Toleranzinduktion des Antikörpers beizutragen. Das etablierte in vitro Stimulationsmodell diente zur Analyse und Phänotypisierung von CD4+ T Zellen nach Antikörperinkubation und Stimulation. Es konnte gezeigt werden, dass eine MAX.16H5-Behandlung zu einer verminderten Aktivierung (CD25-Expression) von T Zellen nach 24 h und 72 h in Kokultur mit murinen Milzzellen bei einem 10:1 bzw. 8,2:1 Verhältnis (humane CD4+ T Zellen zu murinen Milzzellen) führte. Dieses Modell kann als Grundlage für weitere in vitro Studien dienen, um Prozesse der Toleranzinduktion durch monoklonale Antikörper zu untersuchen, und liefert einen wichtigen Beitrag für die präklinische Analyse des MAX.16H5 Antikörpers im Hinblick auf die Entwicklung funktioneller Tests. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Expression von microRNAs in CD4+ T Zellen nach Bindung des MAX.16H5 Antikörpers untersucht. Hierzu wurden humane CD4+ T Zellen mit dem MAX.16H5 Antikörper behandelt und (i) ohne Stimulation, (ii) mit murinen Milzzellen bzw. (iii) mit Phytohämagglutinin inkubiert. Das microRNA-Expressionsprofil wurde mit Next Generation Sequencing bestimmt. In dieser Screeninganalyse wurden zahlreiche microRNAs gefunden, die unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen nach MAX.16H5-Inkubation differentiell exprimiert waren. Die Expression der miR-18a-3p und miR-598-3p wurde anschließend mit qPCR näher untersucht. Eine statistisch signifikante Regulation konnte für miR-598-3p nach 72 h Inkubation nachgewiesen werden. Es ist der bisher einzige Hinweis auf einen molekularen Effekt der MAX.16H5-Behandlung auf CD4+ T Zellen. Ob dieser Unterschied funktioneller Natur, im Sinne eines Toleranz-induzierenden Phänotyps ist, werden zukünftige Studien zeigen. Zudem wird aktuell die miR-598-3p als potenzieller Biomarker für den Nachweis einer erfolgreichen Inkubation mit MAX.16H5 untersucht, was für zukünftige klinische Studien von großer Wichtigkeit ist.:1. Einleitung 1 1.1 Literaturübersicht 1 1.1.1 Die hämatopoetische Stammzelltransplantation 1 1.1.2 Die allogene Stammzelltransplantation 2 1.1.3 Die Graft-versus-Host-Krankheit 5 1.1.4 Die Prävention und Behandlung der akuten GvHD 8 1.1.5 Neue Strategien zur GvHD-Behandlung und -Prävention 10 1.1.6 Der Graft-versus-Leukämie-Effekt 13 1.1.7 Der CD4-gerichtete MAX.16H5 Antikörper zur Prävention der GvHD 14 1.1.8 Die Toleranzinduktion durch monoklonale Antikörper 16 1.1.9 Die microRNA 19 1.1.10 Die Rolle von miRNAs in der GvHD 20 1.1.11 Die Rationale für die Untersuchung von miR-18a-3p 21 1.1.12 Die Rationale für die Untersuchung von miR-598-3p 22 2 Fragestellung und Experimentdesign 23 3 Material und Methoden 25 3.1 Materialien 25 3.1.1 Verwendete Zellen 25 3.1.2 Geräte 25 3.1.3 Chemikalien, Medien und Reagenzien 26 3.1.4 Verbrauchsmaterialien 27 3.1.5 Oligonukleotide 28 3.1.6 Antikörper 28 3.1.6.1 Antikörper für Durchflusszytometrie 28 3.1.6.2 Antikörper für Zellinkubation 29 3.2 Methoden 29 3.2.1 Schematische Darstellung der methodischen Arbeitsschritte 29 3.2.2 Zellkulturarbeiten 31 3.2.2.1 Auftauen von Zellen 31 3.2.2.2 Konservierung von Zellen 31 3.2.2.3 Bestimmung der Zellzahl von PBMCs und Splenozyten 32 3.2.3 Isolation humaner PBMCs aus Spenderblut 32 3.2.4 Isolation muriner Milzzellen 33 3.2.5 Isolation humaner CD4+ T Zellen und MACS-Separation humaner und muriner Zellen 33 3.2.6 Inkubation mit dem murinem MAX.16H5 IgG1 Antikörper 35 3.2.7 Inkubation humaner CD4+ T Zellen 35 3.2.8 Durchflusszytometrie 36 3.2.9 RNA-Isolation 37 3.2.10 RNA-Fällung 38 3.2.11 Next Generation Sequencing von miRNAs 38 3.2.12 Next Generation Sequencing – Analyseschema 41 3.2.13 Reverse Transkription und qPCR 41 3.2.13.1 Reverse Transkription 42 3.2.13.2 qPCR 43 3.2.14 Statistische Analyse, Tabellen und Abbildungen 44 4. Ergebnisse 46 4.1 Etablierung eines in vitro Stimulationsmodells zur Analyse humaner CD4+ T Zellen nach Antikörperinkubation 46 4.2 Next Generation Sequencing zur miRNA-Expressionsanalyse in CD4+ T Zellen nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation 50 4.2.1 FACS-Analyse isolierter CD4+ T Zellen vor und nach Antikörperinkubation 50 4.2.2 Separation muriner Milzzellen von humanen CD4+ T Zellen 53 4.2.3 NGS-miRNA-Expressionsanalyse in stimulierten und unstimulierten CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 55 4.2.3.1 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und PHA-Stimulation 57 4.2.3.2 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und Stimulation mit murinen Milzzellen 59 4.2.3.3 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und ohne Stimulation 61 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der NGS-Analyse 63 4.3 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 24 h und 72 h Inkubation 64 4.3.1 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 24 h Inkubation 64 4.3.2 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 67 4.4 Validierung der Kandidaten-miRNA mittels qPCR 72 4.4.1 Expression von miR-18a-3p und miR-598-3p nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation in CD4+ T Zellen nach 72 h 72 4.4.1.1 FACS-Analyse isolierter CD4+ T Zellen vor und nach Antikörperinkubation 72 4.4.1.2 FACS-Analyse der CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 74 4.4.1.3 Separation muriner Milzzellen von humanen CD4+ T Zellen 78 4.4.1.4 Expression von miR-18a-3p und miR-598-3p 80 5. Diskussion 85 5.1 Die Expression von miR-18a-3p und der miR-17–92 Cluster 86 5.2 Die Expression von miR-598-3p 88 5.3 Die Differentielle Expression weiterer miRNAs 90 5.3.1 miR-223 90 5.3.2 Let-7d 91 5.3.3 miR-21 91 5.3.4 miR-181c 91 5.3.5 miR-10a 92 5.3.6 miR-150 92 5.3.7 miR-199a 92 5.3.8 miR-155 93 5.4 Die miRNA-Expressionsanalyse mit Next Generation Sequencing 93 5.5 Die Etablierung eines in vitro Stimulationsmodells 96 5.6 Verminderte T Zell-Aktivierung durch MAX.16H5 IgG1 98 6 Zusammenfassung der Arbeit 101 7 Literaturverzeichnis 104 A Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 129 B Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung des Titels Dr. med. 130 C Darstellung des wissenschaftlichen Werdegangs 131 D Danksagung 133

Graft-versus-host disease (GvHD) remains one of the major complications following allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). GvHD can occur in almost every tissue, with the skin, liver, and intestines being the mainly affected organs. T cells are implicated in initiating GvHD. T cells identify a broad range of antigens and mediate the immune response through receptors on their surfaces (T cell receptors, TCRs). The composition of TCRs within a T cell population defines the TCR repertoire of an individual, and this repertoire represents exposure to self and non-self proteins. Monitoring the changes in the TCR repertoire using TCR sequencing can provide an indication of the dynamics of a T cell population. Monitoring the frequency and specificities of specific TCR clonotypes longitudinally in different conditions and specimens (peripheral blood, GvHD-affected tissue samples) can provide insights into factors modulating immune reactions following allogeneic transplantation and will help to understand the underlying mechanisms mediating GvHD. This review provides insights into current studies of the TCR repertoire in GvHD and potential future clinical implications of TCR sequencing.

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) regulate innate and adaptive immunity. Neurotrophins and their receptors control the function of neuronal tissue. In addition, they have been demonstrated to be part of the immune response but little is known about the effector immune cells involved. We report, for the first time, the expression and immune-regulatory function of the low affinity neurotrophin receptor p75 neurotrophin receptor (p75NTR) by the antigen-presenting pDCs, mediated by toll-like receptor (TLR) 9 activation and differential phosphorylation of interferon regulatory factor 3 and 7. The modulation of p75NTR on pDCs significantly influences disease progression of asthma in an ovalbumin-induced mouse model mediated by the TLR9 signaling pathway. p75NTR activation of pDCs from patients with asthma increased allergen-specific T cell proliferation and cytokine secretion in nerve growth factor concentration-dependent manner. Further, p75NTR activation of pDCs delayed the onset of autoimmune diabetes in RIP-CD80GP mice and aggravated graft-versus-host disease in a xenotransplantation model. Thus, p75NTR signaling on pDCs constitutes a new and critical mechanism connecting neurotrophin signaling and immune response regulation with great therapeutic potential for a variety of immune disorders.

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) regulate innate and adaptive immunity. Neurotrophins and their receptors control the function of neuronal tissue. In addition, they have been demonstrated to be part of the immune response but little is known about the effector immune cells involved. We report, for the first time, the expression and immune-regulatory function of the low affinity neurotrophin receptor p75 neurotrophin receptor (p75NTR) by the antigen-presenting pDCs, mediated by toll-like receptor (TLR) 9 activation and differential phosphorylation of interferon regulatory factor 3 and 7. The modulation of p75NTR on pDCs significantly influences disease progression of asthma in an ovalbumin-induced mouse model mediated by the TLR9 signaling pathway. p75NTR activation of pDCs from patients with asthma increased allergen-specific T cell proliferation and cytokine secretion in nerve growth factor concentration-dependent manner. Further, p75NTR activation of pDCs delayed the onset of autoimmune diabetes in RIP-CD80GP mice and aggravated graft-versus-host disease in a xenotransplantation model. Thus, p75NTR signaling on pDCs constitutes a new and critical mechanism connecting neurotrophin signaling and immune response regulation with great therapeutic potential for a variety of immune disorders.

Graft-versus-host disease (GvHD) of the skin is a severe allo-immune reaction and complication following allogeneic stem cell transplantation. Over the past years, intensive pre-clinical research has led to an improved understanding of the pathophysiology of acute and to a lesser extend chronic GvHD. This has translated into the approval of several new agents for the treatment of both forms of GvHD. This review summarizes the most recent advances in underlying pathomechanisms, clinical trials and newly approved agents for GvHD, with a special focus on skin involvement.