Les GAGs, en particulier les HS et les CS, sont des polysaccharides linéaires sulfatés situés à la surface des cellules et la matrice extracellulaire où ils influencent les fonctions des cellules. Les GAGs sont connus pour se lier et réguler l'activité d'un certain nombre de protéines différentes appelées «protéines de liaison héparine», y compris les chimiokines, facteurs de croissance, des enzymes et des molécules d'adhésion. Dans le cas du développement de la tumeur, la surexpression de l'héparanase a été observée. En conséquence, une variété d'oligosaccharides de HS et de CS est libérée. Néanmoins, leurs structures et leurs effets biologiques sont inconnus.De nombreux outils existent pour la caractérisation des GAG cependant, le développement de nouvelles technologies pour isoler des fragments du HS endogènes est nécessaire. Dans ce contexte, nous proposons d'utiliser la technologie d'empreinte moléculaire, ce qui permettrait d'obtenir des polymères avec des cavités capables de reconnaître certains types d'oligosaccharides mimétiques de HS, et par la suite d'étudier les HS endogènes.Les GAGs extraits de tumeurs xénogreffes et du sang, de 3 à 8 semaines au cours de la croissance tumorale, ont été quantifiés par dosage colorimétrique. Nous avons observé une diminution de la quantité des GAG tumoraux et une augmentation des GAG sanguin, au cours de la croissance de la tumeur. En outre, les GAGs tumoraux montrent une affinité croissante pour le FGF-2 au cours de la croissance tumorale.Nous avons étudié l'applicabilité de la «technique d'empreinte moléculaire» pour la production d'hydrogels imprimés capables de reconnaître spécifiquement le fondaparinux, un oligosaccharide analogue de l'héparine. Nous avons préparé une bibliothèque d'hydrogels imprimés afin d'optimiser leur synthèse et obtenir des matériaux qui reconnaissent spécifique et sélectivement cette molécule cible. Nos résultats montrent que, par un contrôle minutieux de la stœchiométrie et de la proportion de l'agent de réticulation utilisé lors de leur synthèse ainsi que la détermination des conditions de reconnaissance, les hydrogels imprimés reconnaissent spécifiquement les oligosaccharides mimétiques de HS.Ces travaux ouvrent des intéressantes perspectives d'application de la technologie d'impression moléculaire à l'analyse des séquences de GAGs extraits d'un milieu biologique. / GAGs, and particularly heparan sulfate (HS) and chondoitin sulfate (CS), are linear and sulfated polysaccharides located at the cell surface and extracellular matrix from where they influence the functions of cells. GAGs are known to bind and regulate the activity of a number of distinct proteins known as ‘heparin binding proteins' including chemokines, growth factors, enzymes and adhesion molecules. In the case of tumor development, heparanase over-expression has been observed. As a consequence, a variety of HS and CS oligosaccharides are released which structures and biological effects are unknown.Many tools exist for GAG characterization and a need to develop a new technology to isolate fragments of endogenous HS is required. In this context, we propose to use molecular imprinting technology that could allow to obtain polymers owing cavities able to recognize specific types of HS mimetic oligosaccharides and therefore the endogenous HS.GAGs extracted from xenografted tumors and blood, at 3 to 8 weeks during tumor growth, were quantified by a colorimetric assay. We observed a decrease in the amount of GAGs tumors and an increase of GAGs blood, during the tumor growth. Moreover, tumor GAGs were tested by competition toward growth factor with enzyme immunoassay showing increasing affinity for FGF-2 during tumor growth.We investigated the applicability of ‘Molecular Imprinting Technology' to the generation of imprinted hydrogels able of specifically recognize fondaparinux, an oligosaccharide analogue of heparin. We have prepared a library of imprinted hydrogels in order to optimize their synthesis and obtain materials that specifically and selectively recognize that oligosaccharide. Our results show that, by a careful control of the stoichiometry and crossliking choice for their synthesis and by adapting rebinding conditions, namely the temperature, imprinted hydrogels can readily be prepared to specifically recognize the HS mimetic used as model.This work opens an interesting outlook to analyze GAGs extracted from a biological medium by molecular imprinting technology

La pharmaco-résistance des épilepsies du lobe temporal serait étroitement liée à une perte de neurones dans l'hippocampe qui pourrait résulter d'une inflammation. Chez le rat soumis à une épileptogenèse expérimentale, nous avons caractérisé la réponse inflammatoire de l'hippocampe. Celle-ci précède la mise en place de la neurodégénérescence et consiste en une forte production de cytokines pro-inflammatoires par la microglie activée ainsi qu'en une infiltration de monocytes/ macrophages. La progression des monocytes dans le parenchyme cérébral serait facilitée par la dégradation des chaînes de sulfate d'héparane qu'ils portent à leur surface, sous l'action de l'héparanase, spécifiquement exprimée par les neurones. Il se pourrait que le blocage des sites de liaison de l'héparanase aux chaînes de sulfate d'héparane réduise l'infiltration cérébrale des monocytes, et permette de prévenir la dégénérescence neuronale associée aux épilepsies.

L’angiogénèse tumorale correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins afin d’alimenter la tumeur et d’amplifier son développement. Cette étape constitue un facteur pronostique défavorable pour les patients et son inhibition représente un fort intérêt thérapeutique. Parmi les acteurs participant à l’angiogénèse tumorale, on retrouve l’enzyme de dégradation héparanase au sein du microenvironnement tumoral de nombreux cancers. Ces travaux de thèse ont pour objectif de développer des inhibiteurs spécifiques de l’héparanase à partir de polysaccharides sulfatés pour le traitement de l’angiogénèse tumorale. La première partie de ces travaux a été consacrée à l’élaboration de polysaccharides sulfatés de bas poids moléculaires issus de sources animales (Héparine, Chrondroïtine sulfate), algales (Fucoïdanes, Carraghénane-λ-ι-κ) ou bactérienne (Dextran sulfate). Nous avons utilisé pour cela un procédé de dépolymérisation radicalaire assisté par ultrasons, développé en 2013 au laboratoire, que nous avons associé à un procédé de modification chimique appelé glycol-split. Les composés produits ont été évalués pour leurs activités d’inhibition de l’héparanase et de la coagulation sanguine. Ce criblage a notamment permis l’identification d’un dérivé de bas poids moléculaire issu de Carraghénane-λ possédant une forte inhibition de l’héparanase pour une faible inhibition de la coagulation. La deuxième partie de ces travaux s’est ensuite concentrée sur l’évaluation du potentiel anti-angiogénique des inhibiteurs de l’héparanase. Dans ce but, nous avons dans un premier temps évalué le rôle de l’hypoxie et/ou le manque de nutriments sur la production d’héparanase par des cellules de cancers mammaires. Dans ces conditions de stress, nous avons observé que la lignée MCF-7 excrétait une forte quantité d’héparanase. L’analyse en Matrigel 3D du réseau angiogénique formé par des cellules microvasculaires HskMEC, en présence du surnageant de MCF-7 riche en héparanase, a montré une forte stimulation de l’angiogénèse. Les mêmes tests réalisés en présence des inhibiteurs de l’héparanase ont montré une inhibition de l’angiogénèse qui semblait corrélée avec l’inhibition de l’héparanase. / Tumor angiogenesis is defined by the spouting of new blood vessels from preexisting ones in order to sustain and amplify the tumor development. This crucial step is associated with poor prognosis for patients and it’s inhibition is therefore considered as a primising way to treat cancer. Among several actors participating in the angiogenesis process, the degradative enzyme heparanase is active in the tumor microenvironment of many cancers. The work presented in this thesis aim to develop specific heparanase inhibitors using sulfated polysaccharides for the treatment of tumor angiogenesis. The first part of this work is dedicated to the conception of low molecular weights sulfated polysaccharides obtainable from animal source (Héparine, Chondroïtine sulfate), algal source (Fucoidan, Carrageenan-λ-ι-κ) and bacterial source (dextran sulfate). To do so, we used a depolymeriation process based on free radicals associated to ultrasonic waves developed in 2013 in the laboratory. This depolymerization method was then coupled with a chemical process called glycol-split. The produced compounds were evaluated for their capacity to inhibit heparanase and blood coagulation. This screening phase lead to the identification of a low molecular weight compound produced from λ-carrageenan endowed with a strong heparanase inhibition power and a low impact on the blood coagulation. The second part of this work was then focused on the evaluation of the anti-angiogenic properties of our best heparanase inhibitors. To do so, we first evaluated the role of hypoxia and lack of nutrients on the heparanase production from breast cancer cell lines. In these higly stressful conditions, we observed that the MCF-7 cell line secreted a huge amount of heparanase. 3D Matrigel angiogenesis network formation using Hsk-MEC microvascular cells in the presence of MCF-7 heparanase rich supernatant showed a strong angiogenesis stimulation. Same tests realized in the presence of heparanase inhibitors showed an angiogenesis inhibition power that seemed correlated with heparanase inhibition.

Le microenvironnement des cellules tumorales présente plusieurs particularités comme l'hypoxie, l'acidification du milieu extracellulaire et l'hypersécrétion d'enzymes hydrolytiques. Ces hydrolases, comme la cathepsine D et l'héparanase, interviennent dans les étapes de la progression tumorale et notamment l'angiogenèse. Cette thèse s'intègre dans un projet dont la finalité est de concevoir un nano-objet moléculaire enzymo-sensible qui réagirait d'une manière spécifique aux enzymes hypersécrétées dans le microenvironnement tumoral pour assurer de façon simultanée, une fonction de détection et de ciblage des tumeurs. La première partie de nos travaux a été consacrée à la conception et à la validation d'un lien peptidique intégrable dans l'objet moléculaire, sensible aux formes de la cathepsine D actives du microenvironnement tumoral de cancers mammaires. Cet objectif a été réalisé suite à l'étude cinétique de l'hydrolyse de 5 peptides par la cathepsine D mature et la pro-cathepsine D dans les conditions de pH du microenvironnement tumoral. Nous avons également étudié l'effet de l'hypoxie et de l'acidification du milieu extracellulaire sur la sécrétion des formes actives de la cathepsine D par la lignée tumorale de cancer mammaire MCF-7. Dans une deuxième partie, nous avons travaillé sur l'élaboration d'héparines de bas poids moléculaire pouvant assurer la fonction thérapeutique de l'objet moléculaire grâce à leur activité anti-angiogénique. Nous avons mis au point une méthode innovante pour la dépolymérisation de l'héparine qui consiste en une hydrolyse radicalaire par le péroxyde d'hydrogène assistée par les ultrasons. Cette technique permet la production d'oligosaccharides d'héparines caractérisées par des poids moléculaires et des degrés de sulfatation contrôlés. En fonction des conditions de dépolymérisation par cette technique, les héparines de bas poids moléculaires produites peuvent être utilisées comme anticoagulant ou anti-angiogénique. / Tumor microenvironment is characterized by several particularities such as hypoxia, extracellular media acidification and the hyper-secretion of hydrolytic enzymes. These hydrolases, such as cathepsin D and heparanase, are involved in many steps of tumor progression like angiogenesis. This thesis is a part of a project that aims to develop a "smart" molecular nano-object that specifically reacts to hyper-secreted enzymes in the tumor microenvironment for the simultaneous detection and targeting of tumor. The first part of our work concerned the design and the validation of a peptide that is sensitive to active forms of cathepsin D which is a protease, unregulated in many tumors microenvironment such as breast cancers. This objective has been achieved following the kinetic study of the hydrolysis of 5 peptides by mature cathepsin D and procathepsin D in the pH conditions of the tumor microenvironment. On the other hand, we studied the effect of hypoxia and the acidification of the extracellular medium on the secretion of active forms of cathepsin D by the breast cancer cell line MCF-7. In a second part, we worked on the development of low molecular weight heparins that may provide therapeutic function of the molecular object through their anti-angiogenic activity. We have developed an innovative method for the depolymerization of heparin that consists on a radical hydrogen peroxide hydrolysis assisted by ultrasound. This technique allows the production of heparins oligosaccharides characterized by controlled molecular weight and degree of sulfatation. Depending on the depolymerization conditions by this technique, the produced low molecular weight heparins can be used as an anticoagulant or anti-angiogenic.