La Cathepsine D (CathD) est une protéase lysosomale surexprimée et sécrétée par de nombreuses tumeurs solides. Cette enzyme favorise la prolifération tumorale et le processus métastatique, faisant d’elle une cible intéressante pour la thérapie anticancéreuse. Il existe un très bon inhibiteur de la CathD, la pepstatine, mais celui-ci traverse trop difficilement la membrane cellulaire pour être actif. C’est pourquoi des vecteurs de pénétration cellulaire, basés sur l’oligomérisation de mimes contraints de dipeptide, ont été développés au laboratoire. De ce travail, un bioconjugué, le JMV4463, a été développé. Composé d’un vecteur AMPA4 (tétramère de l’acide 2-(aminométhyl)phénylacétique), de la pepstatine, et d’une partie hydrophile aidant à la solubilisation du conjugué, ce bioconjugué est capable d’entrer dans les cellules et possède une activité antiproliférative sur différentes lignées de cellules cancéreuses. Partant de ce travail, la synthèse de nouveaux vecteurs potentiels de pénétration cellulaire, oligomères de mimes contraints de dipeptide, a été réalisée. Leur capacité d’internalisation a été établie sous la forme de conjugués avec la pepstatine. Les monomères envisagés étaient des analogues des motifs AMPA et acide (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acétique (DBT), motif ayant également montré une importante capacité d’internalisation. Ainsi, des analogues de l’AMPA en série indole, pyrrole et cyclohexane ont été préparés. De plus, la synthèse d’analogues de l’AMPA possédant différentes substitutions a été réalisée, tels que les méta- et para-AMPA, un homologue inférieur ou les 4,5-diméthoxy-, 4,5-dihydroxy- et 4-bromo-AMPA. Un analogue en série benzodiazépine du DBT a également été étudié. Tous les vecteurs correspondants sont capables d’internaliser la pepstatine dans les cellules mais, de façon surprenante, aucun des conjugués n’a montré d’activité anti-proliférative, indiquant un rôle essentiel du vecteur AMPA4. Une étude des relations structure / activité du JMV4463 a confirmé que le vecteur AMPA4 possédait un mode d’action unique mais celui-ci n’a pu être identifié à ce jour. Dans cette étude, il a également été montré qu’il était possible de simplifier la structure de la pepstatine, en remplaçant un de ses motifs statine par un motif gamma-alanine, permettant un coût de production réduit. Enfin, une étude in vivo sur un modèle xénogreffé de souris a montré un fort potentiel anti-tumoral du conjugué JMV4463. / Cathepsin D (CathD) is an overexpressed lysosomal protease secreted by several solid tumors. This enzyme is involved in tumor proliferation and metastasis, which makes it a promising target for cancer therapy. There exists a potent CathD inhibitor called Pepstatin, but it presents a too poor ability to cross the plasmic membrane in order to be active. To overcome this drawback, the development of cell penetrating vectors based on the oligomerization of constrained dipeptide mimetics has been undertaken in our lab. From this work, the bioconjugate JMV4463 has been developed. This bioconjugate is made of an AMPA4 (2-(aminomethyl)phenylacetic acid) vector, the pepstatin and a hydrophilic part which increases its solubility. This bioconjugate is able to penetrate the cells and has an antiproliferative effect on different cancer cell lines. Based on this work, synthesis of new potential cell penetrating vectors, oligomers of constrained dipeptide mimetics, was performed. Their internalization ability was established as their conjugate with pepstatin. We developed analogues of AMPA scaffold and (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acetic acid (DBT), which showed an important internalization ability. Thus, AMPA derivatives in indole, pyrrole and cyclohexane series were prepared. Furthermore, the synthesis of AMPA analogues having different substitutions on its aromatic part was performed, such as meta- and para- AMPA, an inferior homologue or 4,5-dimethoxy-, 4,5-dihydroxy- and 4-bromo-AMPA. An analogue of DBT in the benzodiazepin series has also been studied. All the corresponding vectors were able to internalize the pepstatin into the cells. Surprisingly, none of the conjugates showed an anti-proliferative activity, indicating the essential role of the AMPA vector. A structure/activity relationships study was performed for JMV4463. The obtained results confirmed that the AMPA vector has a unique mode of action that has not been identified yet. Furthermore, it has been demonstrated that it was possible to simplify the pepstatin structure by replacing one of its statin residues by a gamma alanine, which allows decreasing the production cost. Finally, an in vivo study on a xenografted mouse model showed a high anti-tumour potential for the JMV4463 conjugate.

Le cancer du sein triple-négatif est un sous-type représentant environ 15 % des cancers du sein, qui est caractérisé par l'absence de récepteurs hormonaux aux œstrogènes et à la progestérone et l'absence d'expression du facteur de croissance HER-2. Le cancer du sein triple-négatif est également associé à un profil clinique défavorable avec un haut risque de rechute métastatique précoce. Actuellement, de nombreuses molécules sont testées comme cible thérapeutique dans ce type de cancer. La cathepsine D, une aspartyl protéase lysosome, est un marqueur de mauvais pronostic du cancer du sein associé au risque métastatique. Cette protéase est surexprimée par les cellules cancéreuses mammaires et hypersécrétée dans le microenvironnement tumoral. Notre équipe a apporté des contributions importantes pour élucider le rôle de la cath-D dans le cancer du sein. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance et l'angiogenèse tumorales ainsi que la formation des métastases. Au niveau moléculaire, le proenzyme sécrété par la cellule tumorale stimule la croissance invasive du fibroblaste mammaire via le récepteur LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1). De plus, au pH extracellulaire acide des tumeurs, la pro-cathepsine D secrétée dégrade un des plus puissants inhibiteurs des cystéines cathepsines, la cystatine C, stimulant ainsi leurs activités protéolytiques.Mon travail a consisté à développer des anticorps anti-cath-D, présentant un effet thérapeutique dans le cancer du sein triple-négatif. Nous avons utilisé deux approches l'une par la technologie des hybridomes qui a permis d'isoler 50 anticorps, qui se sont avérés être des IgM. L'autre, par phage display, où 8 anticorps fragments scFv anti-cath-D ont été sélectionnés par ELISA. Ces 8 scFv ont été criblés pour leur capacité à bloquer l'activité biologique de la cathepsine D : inhibition de l'interaction avec LRP1 et inhibition du clivage d'un substrat fluorescent. Les anticorps E2 et F1 reformatés en IgG1 inhibent in vitro le phénomène de cicatrisation, la clonogénéicité, la croissance tridimensionnelle dans le matrigel et in vivo la croissance tumorale des cellules de cancer du sein triple-négatif MDA-MB-231. Cette étude est une première étape vers le développement de thérapie anti-cath-D dans le cancer du sein. / Cancer is the leading cause of death in the developed world. This project focuses t on the high incidence triple-negative breast cancers (ER- and PR-negative, HER2-non amplified) who present unsatisfactory treatments. Tumor progression is known to be due to cross-talk between cancer cells and their surrounding supporting tissue, the tumor stroma. The lysosomal aspartic protease cathepsin D is over-produced and abnormally hypersecreted by epithelial breast cancer cells. This protease is an independent marker of poor prognosis in breast cancer correlated with the incidence of clinical metastasis. Cathepsin D stimulates tumor progression by both proteolytic and non-proteolytic molecular mechanisms. Our team has shown that secreted pro-cathepsin D can alter the tumor microenvironment by interacting with partners such as the LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1) receptor, and/or by cleaving endogenous substrates like cystatin C. My pHD project aimed to target extracellular procathepsin D released in breast cancer by developing specific therapeutic antibodies to block its catalytic and binding capacities. We have isolated 50 hybridomas, that secreted IgM, a pentameric antibody format with high avidity but low affinity, and 8 anti-cath-D scFv by phage display. The anti-human cath-D scFv were selected by functional screenings for their ability to inhibit both the proteolytic activity of Cath-D and its binding to the fibroblastic LRP1 receptor. Two scFv cloned under IgG1 format (F1 and E2) inhibited wound healing, colony formation and three-dimensional outgrowth in Matrigel of MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells, and their tumor growth in athymic nude mice. Our findings strongly suggest that antibody-based targeting of Cath-D within the breast tumor microenvironment may have therapeutic efficacy for breast cancer treatment.

L’aspartyl protéase cathepsine D, surexprimée et hyper-sécrétée par les cellules épithéliales cancéreuses mammaires est un facteur de mauvais pronostic des cancers du sein et stimule la prolifération des cellules cancéreuses et la formation des métastases. Elle affecte également le micro-environnement tumoral en induisant la croissance invasive des fibroblastes. Les travaux de l’équipe ont montré que le LDL-receptor related protein 1, LRP1, est le récepteur fibroblastique de la cathepsine D. LRP1 est fortement exprimé par les adipocytes. Les études cliniques indiquent que l’obésité est un facteur de risque dans de nombreux cancers, dont le cancer du sein chez la femme ménopausée.Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la cathepsine D et du LRP1 dans les adipocytes, type cellulaire prédominant du micro-environnement tumoral mammaire. Nos résultats indiquent une surexpression de la cathepsine D et du LRP1 dans le tissu adipeux humain et murin obèse. De plus, l’expression de la cathepsine D est augmentée pendant la différenciation adipocytaire. Finalement, l’extinction de l’expression de la cathepsine D et du LRP1 inhibe l’adipogenèse indiquant leurs rôles clefs dans ce processus.L’ensemble de ces résultats suggère que la cathepsine D et son récepteur LRP1 pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de l’obésité. / The aspartyl protease cathepsin D, overexpressed and hyper-secreted by epithelial breast cancer cells is a poor prognosis factor in breast cancers and stimulates cancer cell growth and metastasis formation. It also affects the tumor microenvironment, inducing the fibroblasts invasive outgrowth. Our works have shown that the LDL receptor-related protein1, LRP1, is the fibroblastic receptor for cathepsin D. LRP1 is highly expressed in adipocytes. Clinical studies indicate that obesity is a risk factor in many cancers, including breast cancer in postmenopausal women.During this thesis, we studied the role of cathepsin D and LRP1 in adipocytes, which are the prominent cell type in the tumor microenvironment of breast cancers. Our results indicate that cathepsin D and LRP1 are overexpressed in human and mouse obese adipose tissue. Furthermore, the expression of cathepsin D is increased during adipocyte differentiation. Finally, the inhibition of the cathepsin D and LRP1 expression inhibits adipogenesis indicating their key role in this process.All these results suggest that cathepsin D and its receptor LRP1 could be potential therapeutic targets in the treatment of obesity.

Les cancers du sein triple-négatif (TNBC) (RE-, RP-, HER2) représentent 15% des cas de cancer du sein. Les patientes atteintes de TNBC sont traitées uniquement par chimiothérapie. A l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie ciblée efficace. Malgré une chimiosensibilité initiale, les rechutes sont fréquentes. Ainsi de nouveaux traitements sont nécessaires pour soigner ces patientes. Dans le cancer du sein, l’aspartyl protéase cathepsine D (cath-D), un marqueur de mauvais pronostic, est surexprimée par les cellules cancéreuses et est hyper-secrétée dans le microenvironnement tumoral. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance invasive des fibroblastes, la croissance tumorale, l’angiogenèse tumorale et la formation des métastases. Différentes études ont mis en exergue le rôle oncogénique de la cath-D extracellulaire dans le cancer du sein, suggérant qu’elle serait une cible thérapeutique d’intérêt. Afin de neutraliser sélectivement la forme sécrétée de la cath-D, le laboratoire a généré des anticorps humains IgG1 dirigés contre la cath-D par un crible de phage display (International patent N° PCT/EP2016/061454).Les principaux objectifs de ma thèse ont été i) de valider la cath-D comme une cible extracellulaire d’intérêt pour les patientes atteintes de TNBC, ii) d’évaluer les effets thérapeutiques et iii) de caractériser les mécanismes d’action des anticorps humains anti-cath-D.Nous avons montré que des niveaux élevés d'ARNm de CTSD sont corrélés à une survie sans récidive plus courte. Par analyse protéomique et étude immunohistochimique anti-cath-D réalisée sur Tissue Micro-Array, nous avons observé que la cath-D extracellulaire est détectée dans le microenvironnement tumoral des TNBC contrairement au tissu mammaire normal. Nos résultats mettent ainsi en exergue que la cath-D serait un biomarqueur tumoral extracellulaire, suggérant que les patientes atteintes de TBNC pourraient bénéficier d’une thérapie par des anticorps anti-cath-D. Par des analyses de SPECT-CT (Single Photon Emission Computed Tomography) et de biodistribution, nous avons validé que les anticorps humains anti-cath-D, F1 et E2, s’accumulent dans les xénogreffes de la lignée TNBC MDA-MB-231 chez la souris athymique. Les anticorps F1 et E2 inhibent la croissance tumorale des xénogreffes MDA-MB-231 et améliorent la survie des souris athymiques. Notre meilleur anticorps anti-cath-D, F1, inhibe également la croissance tumorale de deux lignées de TNBC PDX (patient-tumor derived xenografts). Au niveau mécanistique, l’anticorps F1 module le microenvironnement immunitaire dans les tumeurs issues des xénogreffes MDA-MB-231. L’ensemble de nos résultats suggèrent qu’une immunothérapie avec des anticorps humains anti-cath-D pourrait être une nouvelle approche thérapeutique pour les patientes atteintes de TNBC. / Triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for 15-20% of all breast cancer cases, and chemotherapy is the only available treatment. Thus identification of new therapeutic targets is required to improve TNBC outcome. In breast cancer, the aspartic protease cathepsin D (cath-D) is a marker of poor prognosis associated with metastatic risk. This protease is overexpressed by breast cancer cells and is abnormally hypersecreted into the tumor microenvironment. Cath-D affects both cancer and stromal cells in the breast tumor microenvironment by increasing the proliferation of breast cancer cells, fibroblast invasive outgrowth, tumor growth and angiogenesis, and metastasis formation. Many studies indicated that extracellular cath-D displays oncogenic activities, suggesting it could represent a novel therapeutic target in TNBC. In order to block its oncogenic actions, the laboratory generated human IgG1 antibodies against extracellular cath-D by phage display (International patent N° PCT/EP2016/061454). The aims of my PhD project was i) to validate the potential value of cath-D as a tumor-specific extracellular target in TNBC, ii) to evaluate the therapeutic activity, and iii) to characterize the mechanisms of action of these anti-cath-D human antibodies.We showed that elevated CTSD mRNA levels correlated with shorter recurrence-free survival. Using proteomics analysis and anti-cath-D immunohistochemistry performed on Tissue Micro-Array, we observed that extracellular cath-D was detected in the tumor microenvironment of TNBC, but not in matched normal breast stroma samples. Our results thus indicate that cath-D is a tumor cell-associated extracellular biomarker and strongly suggest that it could be a good candidate for antibody-based therapy in TNBC. We found that anti-cath-D human antibodies, F1 and E2, accumulated in TNBC MDA-MB-231 tumor xenografts in athymic mice by SPECT-CT (Single Photon Emission Computed Tomography) and biodistribution analysis. F1 and E2 antibodies inhibited tumor growth of MDA-MB-231 tumor xenografts and improved mice survival without apparent toxicity. F1, the best antibody candidate, inhibited tumor growth of two TNBC patient-derived xenografts (PDX). Mechanistically, F1 treatment modulates immune tumor microenvironment in the MDA-MB-231 tumor cell xenograft model. Together, our results indicate that antibody-based targeting of cath-D may have therapeutic efficacy for TNBC treatment.

Les Glycosaminoglycannes (GAGs) sont une famille de polysaccharides principalement localisés au niveau de la matrice extracellulaire et de la membrane plasmique. Ils peuvent interagir avec des facteurs de croissance et des cytokines pour réguler leurs activités, participer à des transports protéiques à travers la membrane cellulaire, moduler les activités de certaines enzymes telles que les cathepsines (enzymes lysosomales). Toutes ces activités démontrent que les GAGs jouent des rôles primordiaux dans la régulation de la croissance, la différenciation, l'adhésion, l'inflammation et la mort cellulaire.L'implication de ces polysaccharides dans la régulation de l'apoptose via la voie mitochondriale n'a toujours pas été déterminée. Ici, nous démontrons dans un modèle cellulaire de fibroblastes de peau en culture primaire, soumis à un stress oxydatif par de l'H2O2, qu'un mimétique des GAGs, l'OTR4120, est capable de protéger la membrane du lysosome, de réduire le taux de ROS intracellulaires et d'inhiber la chute du potentiel de membrane mitochondrial et ainsi d'empêcher la libération du cytochrome c et l'activation des activités caspases-9 et -3 sans affecter la voie extrinsèque de l'apoptose. Les héparanes sulfates et les chondroïtines sulfates au contraire de l'héparine, ont montré un effet protecteur de l'apoptose en inhibant les protéines clefs de ce processus de mort cellulaire. Ainsi, les GAGs naturels et l'OTR4120 sont capables s'opposer à l'apoptose, en inhibant l'activité de la cathepsine D libérée dans le cytosol, empêchant ainsi l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose via la mitochondrie. Ces résultats ouvrent de nouveaux horizons notamment dans certaines maladies où le stress oxydatif est impliqué comme c'est le cas de certaines maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson.La cause de la maladie de Parkinson (MP) qui affecte les neurones dopaminergiques demeure encore mystérieuse, bien que différentes preuves soutiennent les hypothèses impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux et une accumulation d'α-synucléine comme étant les événements majeurs dans cette physiopathologie. Récemment, la cathepsine D a été impliquée dans des processus de mort cellulaire et montrée comme étant surexprimée dans des modèles de la MP. De plus, apparait être l'une des principales enzymes responsables de la dégradation de l'α-synucléine. Puisque les glycosaminoglycannes (GAGs) sont capables de réguler l'activité de la cathepsine D dans des cellules en culture dans une condition de stress, nous avons cherché à démontrer si GAGs pouvaient être localisés à un niveau intracellulaire, où ils pourraient interagir avec la cathepsine D et s'ils étaient capables de réguler l'accumulation/dégradation de l'α-synucléine. Ainsi nous avons mis en place un modèle cellulaire de la MP induit par le MPP+. Nous avons observé que l'expression génétique des enzymes de la biosynthèse des GAGs (HS2ST, HS6ST et CHST8) a été modifiée dans les cellules stressées par la neurotoxine et que leurs taux mesurés par leurs sulfates étaient augmentés plus précisément au niveau des HS. Au contraire, l'absence de GAGs sulfatés induit par le chlorate de sodium, un inhibiteur de la PAPs (donneur de sulfates), a permis d'augmenter l'activité de l'activité cathepsine D et également d'inhiber l'accumulation ou d'induire la dégradation de l'α-synucléine. Pour la première fois, il a été montré que les GAGs sont capables d'agir sur l'activité cathepsine D à l'intérieur de la cellule et de réguler l'accumulation/dégradation de l'α-synucléine. / Pas de résumé anglais

Les hémorphines représentent une classe de peptides cryptiques bioactifs issus de la protéolyse de la chaîne ß de l'hémoglobine dont la présence in vivo a souvent été associée à des conditions physiologiques ou pathologiques particulières, comme les cancers. De ce fait, l'hypothèse d'utiliser ces peptides comme marqueur de pathologies avaient déjà été posé. Des études récentes au laboratoire ont montré que leur concentration sérique des hémorphines était diminuée chez les patients diabétiques. Nous avons travaillé sur une cohorte de 120 patients atteints de diabète de type 1 et 2 et nous avons étudié les différentes hypothèses permettant d'expliquer cette diminution : métabolisme des hémorphines, impact de la glycation de l'hémoglobine sur la libération des peptides. De plus, nous avons cherché à connaître le rôle de LVVH7 dans la signalisation insulinique. Les résultats obtenus suggèrent que la diminution de la concentration sérique des hémorphines de type 7 est spécifique du diabète mais que la glycation de l'hémoglobine n'a pas d'impact sur la libération des hémorphines. Parallèlement à cette étude, nous avons caractérisé les hémorphines de type 7 dans le microenvironnement du cancer broncho-pulmonaire. La cathepsine D, enzyme impliquée dans la libération de LVVH7 et VVH7 ainsi que dans le microenvironnement tumoral, a été étudié dans des cultures de lignées de cancers broncho-pulmonaires acidifiée et donc propice à la progression tumorale. Les résultats ont permis de confirmer la présence de la cathepsine D dans le surnageant de cultures des cellules cancéreuses. De plus, nous avons montré la libération d'hémorphines de type 7 dans des milieux de culture acidifiés.

La cathepsine D est une aspartyl protéase lysosomale surexprimée et hypersécrétée par les cellules épithéliales cancéreuses mammaires. C'est un marqueur de mauvais pronostic du cancer du sein. Elle stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance invasive des fibroblastes et la formation des métastases. Les travaux de l'équipe ont montré qu'elle peut agir indépendamment de son activité catalytique par interaction protéique. Le répresseur transcriptionnel Tricho-Rhino-Phalangeal Syndrome type 1, TRPS1, a été identifié comme un partenaire potentiel de la cathepsine D. Différentes études indiquent que des cystéines cathepsines peuvent être localisées au noyau et être protéolytiquement actives. Par exemple, la cystéine cathepsine L agit par protéolyse limitée sur le facteur de transcription CDP/Cux et sur l'histone H3 lorsqu'elle est localisée au noyau.Dans cette thèse nous avons étudié le rôle de la cathepsine D nucléaire dans des cellules cancéreuses mammaires. Nos résultats indiquent que la cathepsine D, comme TRPS1, est localisée au noyau et est associée à la chromatine dans les cellules positives aux récepteurs aux œstrogènes. De plus elle interagit de manière directe et endogène avec TRPS1 et participe à la régulation transcriptionnelle de PTHrP (parathyroïd hormone-related protein) un gène cible de TRPS1. Finalement nous avons identifié de nouveaux gènes co-régulés par TRPS1 et la cathepsine D dans le cancer du sein montrant que leur action n'est pas limitée à PTHrP. L'ensemble de ces résultats suggère que la cathepsine D est la première cathepsine identifiée comme un co-facteur transcriptionnel et que son rôle dans le cancer pourrait impliquer, en plus de ses activités extracellulaires, ses activités nucléaires. / Cathepsin D is a lysosomal aspartyl protease which is overexpressed and hyper-secreted by epithelial breast cancer cells. This is a poor prognosis factor in breast cancer. It stimulates cancer cell proliferation and metastasis formation. Team works have shown it can acts in an independent manner of its catalytic activity by protein interactions. The transcriptional repressor trichorhinophalangeal syndrome type 1 protein, TRPS1, has been identified as a new potential partner of Cathepsin D. Several studies indicate that cystein cathepsins can be localized in nucleus and are proteolytically actives. For example, the cystein Cathepsin L acts by limited proteolysis of the CDP/Cux transcription factor and histone H3 when located to the nucleus.During this thesis, we studied the role of nuclear Cathepsin D in breast cancer cells. Our results indicate that Cathepsin D, as TRPS1, is localized in nucleus and is associated with chromatin in estrogen-receptor positive breast cancer cells. Furthermore it interacts in a direct and endogenous manner with TRPS1 and participates to the transcriptional repression of PTHrP, parathyroïd hormone-related protein, a TRPS1 target gene. Finally, we identified new co-regulated genes by TRPS1 and Cathepsin D in breast cancer showing their action is not limited to PTHrP.Together, our results suggest that Cathepsin D is the first cathepsin identified as a transcriptional co-repressor and that its role in cancer may involve, in addition to its extracellular activities, its nuclear activities.

Das Glioblastoma multiforme gehört zu den ZNS-Tumoren neuroepithelialen Ursprungs. Es zeichnet sich durch ein multiformes Zellbild, einen geringen Differenzierungsgrad und eine schnelle Krankheitsprogression aus. Trotz mikrochirurgischer Entfernung und anschließender Radiochemotherapie entwickeln die Patienten im Durchschnitt nach 7 Monaten einen Rezidivtumor und haben eine mittlere Überlebenszeit von 14,6 Monaten. Die Rezidivneigung stellt somit ein großes Problem in der Behandlung von Glioblastompatienten dar. In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass die Rezidivtumore eine andere Zellzusammensetzung und auch ein aggressiveres Wachstumsverhalten als deren Primärformen aufweisen. Ziel dieser Arbeit war es, zu prüfen ob mittels 2D-Gelelektrophorese und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie Unterschiede im Proteinexpressionsmuster zwischen Gewebeproben vom Primärtumor eines Glioblastoms WHO Grad IV und dem korrespondierendem Rezidivtumor eines Patienten detektierbar sind. Hierbei wurden 43 Proteine als differentiell exprimiert erkannt, von denen mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie sechs genauer charakterisiert wurden. Vier der sechs Proteine waren im Rezidivtumor erhöht: EnoylCoA-Hydratase, ATP-Synthase Untereinheit d, Tropomyosin alpha-3-Kette Isoform 2 und Cathepsin D. Die anderen zwei waren im Rezidivtumor niedriger ausgeprägt: Nukleosid-Diphosphatkinase A und L-3-Phosphoserin-Phosphatase. Eine weitere Untersuchung mittels Western-Blot-Analyse bestätigte, dass Cathepsin D (als eines der sechs charakterisierten Proteine) tatsächlich auch in den Rezidivtumoren dreier weiterer Patienten stärker exprimiert war als in den korrespondierenden primären Glioblastomen.

Les hémorphines représentent une classe de peptides cryptiques bioactifs issus de la protéolyse de la chaîne ß de l’hémoglobine dont la présence in vivo a souvent été associée à des conditions physiologiques ou pathologiques particulières, comme les cancers. De ce fait, l’hypothèse d’utiliser ces peptides comme marqueur de pathologies avaient déjà été posé. Des études récentes au laboratoire ont montré que leur concentration sérique des hémorphines était diminuée chez les patients diabétiques. Nous avons travaillé sur une cohorte de 120 patients atteints de diabète de type 1 et 2 et nous avons étudié les différentes hypothèses permettant d’expliquer cette diminution : métabolisme des hémorphines, impact de la glycation de l’hémoglobine sur la libération des peptides. De plus, nous avons cherché à connaître le rôle de LVVH7 dans la signalisation insulinique. Les résultats obtenus suggèrent que la diminution de la concentration sérique des hémorphines de type 7 est spécifique du diabète mais que la glycation de l’hémoglobine n’a pas d’impact sur la libération des hémorphines. Parallèlement à cette étude, nous avons caractérisé les hémorphines de type 7 dans le microenvironnement du cancer broncho-pulmonaire. La cathepsine D, enzyme impliquée dans la libération de LVVH7 et VVH7 ainsi que dans le microenvironnement tumoral, a été étudié dans des cultures de lignées de cancers broncho-pulmonaires acidifiée et donc propice à la progression tumorale. Les résultats ont permis de confirmer la présence de la cathepsine D dans le surnageant de cultures des cellules cancéreuses. De plus, nous avons montré la libération d’hémorphines de type 7 dans des milieux de culture acidifiés. / Hemorphins are cryptic bioactive peptides derived from ß chain of haemoglobin proteolysis. Their biological presence has often been associated with physiological or pathological conditions, like cancers. Thus, it was already suggested that hemorphins could be used as marker of pathology. Previous studies achieved in our laboratory demonstrated that hemorphin-7 was decreased in serum of diabetic patients. We worked on a population of 120 patients with type 1 and type 2 diabetes and we studied different hypothesis: hemorphins metabolism, impact of glycated haemoglobin. Moreover, we researched the role of LVVH7 in insulin signalisation. The results suggested that hemorphin-7 concentrations in serum of diabetic patients are specific of this pathology but glycation of haemoglobin have no impact on liberation of hemorphins. In parallel, we characterized hemorphin-7 in tumor progression of lung cancers. Cathepsin D, previously demonstrated as a key enzyme in hemorphins generation and also in tumor progression, has been studied in vitro in lung cancers, cultured in acidified conditions, favourable to metastasis. In addition, we also identified hemorphin-7 liberation in acidified media culture.

Das Glioblastoma multiforme gehört zu den ZNS-Tumoren neuroepithelialen Ursprungs. Es zeichnet sich durch ein multiformes Zellbild, einen geringen Differenzierungsgrad und eine schnelle Krankheitsprogression aus. Trotz mikrochirurgischer Entfernung und anschließender Radiochemotherapie entwickeln die Patienten im Durchschnitt nach 7 Monaten einen Rezidivtumor und haben eine mittlere Überlebenszeit von 14,6 Monaten. Die Rezidivneigung stellt somit ein großes Problem in der Behandlung von Glioblastompatienten dar. In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass die Rezidivtumore eine andere Zellzusammensetzung und auch ein aggressiveres Wachstumsverhalten als deren Primärformen aufweisen. Ziel dieser Arbeit war es, zu prüfen ob mittels 2D-Gelelektrophorese und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie Unterschiede im Proteinexpressionsmuster zwischen Gewebeproben vom Primärtumor eines Glioblastoms WHO Grad IV und dem korrespondierendem Rezidivtumor eines Patienten detektierbar sind. Hierbei wurden 43 Proteine als differentiell exprimiert erkannt, von denen mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie sechs genauer charakterisiert wurden. Vier der sechs Proteine waren im Rezidivtumor erhöht: EnoylCoA-Hydratase, ATP-Synthase Untereinheit d, Tropomyosin alpha-3-Kette Isoform 2 und Cathepsin D. Die anderen zwei waren im Rezidivtumor niedriger ausgeprägt: Nukleosid-Diphosphatkinase A und L-3-Phosphoserin-Phosphatase. Eine weitere Untersuchung mittels Western-Blot-Analyse bestätigte, dass Cathepsin D (als eines der sechs charakterisierten Proteine) tatsächlich auch in den Rezidivtumoren dreier weiterer Patienten stärker exprimiert war als in den korrespondierenden primären Glioblastomen.