Résumé : Nous avons d’abord souhaité, dans ce travail de thèse, préciser les mécanismes moléculaires conduisant à l'expression ectopique du récepteur du GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor, GIPR) dans des adénomes somatotropes provenant de patients présentant une acromégalie avec une réponse paradoxale (stimulation) de l’hormone de croissance au glucose par voie orale. Nous avons montré que l’expression ectopique de GIPR se produit par une activation transcriptionnelle hypomorphe du gène GIPR associée à des anomalies de méthylation dans le corps du gène. L’activation de la voie AMP cyclique par le GIP postprandial dans les adénomes exprimant le GIPR peut représenter un mécanisme alternatif de la tumorigenèse somatotrope en l’absence de mutations de l’oncogène GNAS.Nous rapportons d’autre part une analyse cytogénétique approfondie des adénomes somatotropes, qui nous a permis de définir deux groupes d'adénomes, un groupe à faible altération du nombre de copies et un groupe à forte altération du nombre de copies. Deux tumeurs présentaient des réarrangements chromosomiques complexes avec une signature typique de chromothripsis, et une architecture sous-clonale incluant jusqu’à six populations cellulaires différentes, témoignant d’une hétérogénéité intratumorale importante.Dans une collection d'adénomes hypophysaires invasifs comportant la portion intrasellaire et la portion envahissante le sinus caverneux, nous avons montré par RNA-seq des profils d'expression génique divergents, apportant des arguments supplémentaires en faveur de l'hétérogénéité intratumorale dans ces tumeurs bénignes. Les échantillons tumoraux provenant de portions invasives ont montré une surexpression de la voie de transition épithélio-mésenchymateuse et des marqueurs de cellules souches cancéreuses soulignant leur rôle potentiel dans l’acquisition du phénotype invasif des cellules adénomateuses hypophysaires. / AbstractIn this work, we explored the molecular mechanisms of ectopic glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (GIPR) expression in somatotroph adenomas from patients with acromegaly displaying a paradoxical GH increase to oral glucose. We showed that ectopic GIPR expression occurs through hypomorphic transcriptional activation of GIPR gene likely driven by DNA methylation changes. Activation of the cAMP pathway by postprandial GIP may represent an alternative tumorigenic mechanism in GIPR expressing somatotroph adenomas without driver mutations in GNAS oncogene. Cytogenetic profiling defined two groups of adenomas, a low-copy-number alteration (CNA) group and a high-CNA group.Two tumor samples displayed complex chromosomal rearrangements compatible with chromothripsis and showed subclonal architecture with up to six distinct cell population in each tumor, demonstrating an important intratumor heterogeneity.In a collection of invasive pituitary adenomas including the non-invasive intrasellar portions and the portions invading the cavernous sinuses, we showed by RNA-seq different gene expression profiles, providing supplemental evidence for the intratumoral heterogeneity in these benign tumors. Tumor samples from invasive portions showed up-regulation of the epithelial-mesenchymal transition pathway and increased expression of cancer stem-cell markers highlighting their potential role in pituitary tumor cell invasive behavior.

Les tumeurs sont généralement constituées de différentes sous-populations de cellules cancéreuses génétiquement hétérogènes, responsables en grande partie de la capacité de la tumeur à évoluer rapidement et à s’adapter aux conditions environnementales. Cette diversité génétique a des conséquences majeures pour le patient, notamment au cours de la progression tumorale et pour l’acquisition d’une résistance aux traitements.Nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur la technologie CRISPR/Cas9 qui consiste à introduire, en plus d’une altération de séquence voulue d’un gène d’intérêt, une série de mutations silencieuses, constituant une sorte d’étiquette génétique qui peut être détectée par PCR quantitative ou séquençage de nouvelle génération. En parallèle, un code-barres constitué exclusivement de mutations silencieuses est utilisé comme contrôle interne pour les effets non spécifiques potentiels qui peuvent être engendrés suite au clivage hors-cible par le système CRISPR/Cas9. Cette approche, que nous avons appelée CRISPR-barcoding, permet de générer et de suivre l’émergence d’un petit groupe de cellules cancéreuses contenant une mutation voulue au sein d’une population de cellules non modifiées, représentant ainsi un nouveau modèle expérimental d’hétérogénéité génétique intratumorale. Grâce à une série de preuves de concept, nous avons montré que CRISPR-barcoding est une nouvelle approche qui permet d’étudier de façon simple et rapide les conséquences fonctionnelles de différents types de modifications génétiques apportées directement au niveau de la séquence génomique.Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé cette nouvelle approche pour l'étude de la résistance du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) à la thérapie ciblée. Les patients de CBNPC dont la tumeur présente une mutation activatrice de l'epidermal growth factor receptor (EGFR) sont généralement traités avec des inhibiteurs de ce récepteur. Malheureusement, malgré une réponse initiale, presque invariablement ces patients rechutent, suite au développement d’une résistance causée, dans la majorité des cas, par l’apparition de mutations secondaires ou tertiaire de l'EGFR. Grâce à un criblage réalisé en utilisant un modèle de CBNPC basé sur la stratégie CRISPR-barcoding, nous avons pu identifier l’inhibiteur multikinase sorafenib pour sa capacité à prévenir la résistance de ces cellules aux inhibiteurs d’EGFR. Ce composé présente un mécanisme d’action original, impliquant une diminution précoce du niveau de phosphorylation de STAT3, suivie par une baisse considérable de l’expression de l’EGFR, aboutissant à une inhibition des voies intracellulaires en aval de ce récepteur, telles que RAS-MAPK et PI3K-AKT-mTOR. Ces données ont été confirmées in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules de CBNPC modifiées par CRISPR-barcoding.En conclusion, l’ensemble de nos résultats montre que le sorafenib peut prévenir l’émergence de cellules de CBNPC résistantes aux inhibiteurs d’EGFR, indiquant que ce composé pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement de ce type de tumeur. / Individual tumors are composed of multiple and genetically distinct subpopulations of transformed cells that can adapt and evolve in a different way based on environmental conditions. This genetic diversity has major consequences for the patient, particularly during tumor progression and for cancer treatment.We devised a new strategy based on CRISPR/Cas9 technology in which a potentially functional modification in the sequence of a gene of interest is coupled with a series of silent point mutations, functioning as a genetic label for cell tracing. In parallel, a second barcode consisting of distinct silent mutations is inserted in the same cell population and used as a control for CRISPR/Cas9 off-target cleavage. This approach, that we named CRISPR barcoding, enables detection of cells containing the mutation of interest within a mass population of unmodified cells using real-time quantitative PCR or deep sequencing. Through a series of proof-of-concept studies, we demonstrated that CRISPR-barcoding is a fast and highly flexible strategy to investigate the functional consequences of a specific genetic modification in a broad range of assays.In the second part of my thesis, we used CRISPR-barcoding to investigate non-small cell lung cancer (NSCLC) resistance to targeted therapy. Some NSCLCs harbor activating mutations of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and are addicted to this signaling pathway. These tumors initially show a good response to EGFR inhibitors (EGFRi), but they almost invariably relapse, due to the acquisition of a resistance, as a result of additional genetic alterations, including secondary and tertiary EGFR mutations. Using a CRISPR-barcoding model, we identified the multikinase inhibitor sorafenib for its ability to prevent EGFRi resistance in NSCLC cells. This compound acts through an original mechanism that involves early reduction of STAT3 phosphorylation and late down-regulation of EGFR, resulting in the inhibition of different downstream pathways activated by this receptor, including, RAS-MAPK and PI3K-AKT-mTOR. These results were confirmed in vivo, using a CRISPR-barcoding xenograft model for NSCLC.Altogether, our data indicate that sorafenib can prevent NSCLC resistance to EGFRi through a novel mechanism, thus providing a new potential therapeutic strategy for the treatment of this type of cancer.