Hintergrund: Bei der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) handelt es sich um ein komplexes Krankheitsbild, das mit steigenden Hospitalisierungsraten an immer zunehmender Bedeutung im Gesundheitssystem gewinnt. Trotz hoher Mortalitätsraten hat sich keine Standardtherapie etabliert und bisher existieren keine erfolgreichen Behandlungsmaßnahmen. Zudem macht die HFpEF die Hälfte aller Herzinsuffizienzfälle aus, was die Zweckmäßigkeit der Erforschung einer effektiven Therapie hervorhebt. Als ein der entscheidenden Faktoren in der Pathophysiologie der Erkrankung wird die endotheliale Störung gestellt. Mit Reduktion der NO-Bioverfügbarkeit im Endothelium führt die endotheliale Störung zur LV -Versteifung mit diastolischer Dysfunktion des Herzens. Das körperliche Training und daraus resultierende Scherkräfte im Blutgefäß triggern eine HDL-vermittelte Stickstoffmonoxid Synthese. Die vasodilatative, eNOS-steigernde Funktion des HDL kann bei Herzinsuffizienten gestört sein. Eine entsprechende Trainingsmodalität könnte sich jedoch als Endothelium-schützend zeigen. Fragestellung: Ziel dieser Dissertation ist die Erforschung, ob die HDL-Funktion von Patienten mit HFpEF durch das Hochintensive Intervalltraining (90-95 % der maximalen HF) oder Moderat-Intensives Kontinuierliches Ausdauertraining (60-70 % der maximalen HF) beeinflussbar ist. Im Fokus der Untersuchungen stehen die HDL-gesteuerte eNOS- Funktion (Funktion der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase), die durch die Phosphorylierung an unterschiedlichen Aminosäureresten im Molekül ausgewertet wird, die PON-1 Aktivität (Paraoxonase-1), die für anti-oxidative Rolle des HDL spricht, sowie die Konzentrationen von TBARS (Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen), die als Indikatoren der gesteigerten Lipidperoxidation dienen. Material und Methoden: Um die Fragen zu klären, wurden die Probanden in drei Gruppen randomisiert: 1) HIIT (Hochintensives Intervalltraining), 2) MCT (Moderat-Intensives Kontinuierliches Ausdauertraining) und 3) CG (Kontrollgruppe). Vor, während und nach den verschiedenen Trainingsinterventionen wurde das HDL durch Ultrazentrifugation aus dem Blutserum der Probanden isoliert. Im Anschluss daran erfolgte die Inkubation der gewonnenen HDL-Isolate mit humanen Aortenendothelzellen. Mittels Western Blot wurde die HDL-induzierte eNOS-Phosphorylierung an der aktivierenden Position Ser1177 (die zur Steigerung der eNOS-Aktivität führt) und an der deaktivierenden Position Thr 495 (die zur Hemmung der eNOS-Aktivität führt) ermittelt. Aktivierende Phosphorylierung der eNOS geht mit einer gesteigerten NO-Produktion einher. Zur Klärung, wie weit modifizierbar die Endothelium-schützende Rolle des HDL ist und welche Korrelationen damit einhergehen, wurde anti-oxidative Funktion des HDL gemessen. Dazu diente die Messung der Aktivität des assoziierten Enzymes - Paraoxonase-1 (PON-1), das die Lipoproteine vor oxidativer Modifikation schützt. Die protektive Eigenschaft des HDL lässt sich unter anderem durch reaktive Sauerstoffspezies modifizieren. Die reduzierte PON-1 Aktivität kann mit gesteigerter Lipidperoxidation mit daraus entstehenden Fettsäure-Radikale einhergehen. Als Indikator wurde in der vorliegenden Studie die Konzentration an Thiobarbitursäure- reaktiver Substanzen (TBARS) gemessen. Ergebnisse/ Beobachtungen: Durch das körperliche Training konnte man einen Anstieg der eNOS-Phosphorylierung an Ser1177 hervorrufen. Nach dem ersten supervidierten Teil des HIIT kam es zu einer signifikanten HDL-induzierten eNOS-Phosphorylierung an Ser 1177. Weder nach HIIT noch nach MCT konnte jedoch ein signifikanter Rückgang der eNOS Phosphorylierung an der deaktivierenden Position Thr495 festgestellt werden. Bei der Betrachtung der eNOS-Phosphorylierung in der MCT- und Kontrollgruppe fielen keine signifikanten Unterschiede auf. Bei HIIT Probanden ergaben sich signifikant erhöhte Werte von PON-1 Aktivität sowohl im Serum als auch im HDL. In MCT- und Kontrollgruppe konnten hingegen keine signifikante Steigerung der PON-1 Aktivität nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung von erhobenen Daten dieser Arbeit fallen erhöhte Werte von TBARS- Konzentrationen bei allen Probanden auf. Es kam allerdings zu keinen signifikanten Unterschieden nach den Trainingsinterventionen. Schlussfolgerungen: Die vorliegende Studie liefert die Erkenntnisse, dass das Hochintensive Intervalltraining eine signifikant gesteigerte HDL-vermittelte eNOS Phosphorylierung, die ebenfalls mit signifikant erhöhter PON-1 Aktivität einhergeht, bei HFpEF-Erkrankten induziert. Ferner aus den erhobenen Daten lässt sich ableiten, dass die Compliance bei allen Probandengruppe jeweils höher während eines überwachten Trainings als während einer home-basierten Intervention war. Insgesamt kann man daraus spekulieren, dass HIIT eine verbesserte endotheliale Funktion des HDL hervorrufen könnte und eine mögliche effektive Therapiemethode der HFpEF in Zukunft darstellen würde. Eine Nutzung dieser Methode bleibt offen und bedarf weiterer Forschungen.:Inhaltsverzeichnis I Tabellenverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 3 1.1 Die Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion 3 1.1.1 Definition der Herzinsuffizienz, Klinisches Bild, Einteilung nach der Pathophysiologie 3 1.1.2 Epidemiologie der HFpEF 3 1.1.3 Pathomechanismus der HFpEF 4 1.1.4 HFpEF vs. HFrEF 11 1.1.5 Diagnose der HFpEF 12 1.1.6 Behandlungsmöglichkeiten 12 1.2 Körperliches Training 14 1.2.1 Belastungsintoleranz bei HFpEF 14 1.2.2 Hochintensives Intervalltraining (HIIT) und Moderat-Intensives Kontinuierliches Ausdauertraining (MCT) 15 1.3 High density lipoproteins 16 1.3.1 HDL bei Herzinsuffizienz 16 1.3.2 Funktionen und Bedeutung von HDL-Partikeln 17 1.4 Zielsetzung und Fragestellung 19 2 Material 20 2.1 Serum 20 2.2 Zellkulturmaterial 20 2.3 Kulturmedium 20 2.4 Chemikalien und Lösungen 20 2.5 Färbelösungen 20 2.6 Antikörper 20 2.7 Chemilumineszenz 20 2.8 Sonstige Materialien 21 2.9 Geräte 21 2.10 Software 21 3 Methoden 22 3.1 Studiendesign 22 3.2 Trainingsintervention 23 3.3 Isolation des HDL 24 3.3.1 Vorarbeiten 24 3.3.2 HDL Isolation 24 3.3.3 HDL Aufreinigung 25 3.4 Bestimmung der Proteinkonzentration nach der BCA-Methode 25 3.5 Stimulation der Zellen 26 3.6 Western Blot 26 3.7 Gelelektrophorese 27 3.8 Proteintransfer 28 3.9 Immundetektion 29 3.10 Chemilumineszenz 29 3.11 PON-1 Aktivität 30 3.12 TBARS 30 3.13 Statistische Analyse 30 4 Ergebnisse 31 4.1 Charakterisierung der Patienten 31 4.2 Patientendaten 32 4.3 Qualität des isolierten HDL 38 4.4 Die HDL-induzierte eNOS-Phosphorylierung 40 4.5 Aktivität der Paraoxonase 1 (PON-1) 44 4.6 TBARS-Konzentration im Serum 47 5 Diskussion 49 5.1 Hauptaussagen 49 5.1.1 Endotheliale Effekte des Trainings via HDL 50 5.1.2 Trainingsmodalitäten als potentielle Therapie 52 5.1.3 Denkbarer molekularer Mechanismus für die Regulation von endothelialen Funktionen des HDL 55 5.1.4 Quantitative vs. qualitative Auswertung der HDL Funktion 57 5.1.5 Unterschiede bei der Einhaltung der verschiedenen Trainingsprotokollen 59 5.1.6 Ausblick für zukünftige Forschungsarbeiten 61 5.1.7 Studienlimitationen 63 6 Zusammenfassung 65 7 Summary 67 8 Literaturverzeichnis 69 9 Anlage 1 88 10 Anlage 2 89 11 Curriculum vitae 90 12 Danksagung 91 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Reagenzien zur Vorbereitung eines 8 % und 12 % SDS-Polyacrylamidgels 27 Tabelle 2: Die verwendeten Antikörper zur Detektion der Proteine 29 Tabelle 3: Patientendaten zu Beginn der Studie -V1 32 Tabelle 4: Patientendaten zu den Zeitpunkten V1, V2, V3 33 Tabelle 5: Medikation 34 Tabelle 6: Lipidprofil 36 Tabelle 7: Ergospirometrie 37 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Pathomechanismus der myokardialen Dysfunktion (übernommen aus Paulus & Tschöpe, 2013) 6 Abbildung 2: Entstehung der myokardialen Dysfunktion durch Veränderungen innerhalb extrazellulärer Matrix und Kardiomyozyten bei Übergewicht und Diabetes mellitus (DM) 7 Abbildung 3: Komorbiditäten bei HFpEF als Trigger für diastolische Dysfunktion 9 Abbildung 4: NO Synthese als Antwort auf Shear Stress 10 Abbildung 5: Schematische Darstellung, wie ein körperliches Training das Krankheitsfortschreiten sowie HDL-induzierte NO-Produktion beeinflusst (übernommen aus Adams et al., 2013) 18 Abbildung 6: Studiendesign 22 Abbildung 7: Trainingsprotokoll, MCT-Moderat-Intensives Kontinuierliches Ausdauertraining, HIIT- Hochintensives Intervalltraining, HRpeak- maximale Herzfrequenz (übernommen aus Suchy et al., 2014) 23 Abbildung 8: Positionieren der Kanülenspitze und Entnahme des HDL 25 Abbildung 9: SDS-Page nach Färbung mit Coomassie-Blau zum Nachweis von HDL mit Größenmarker, BSA-Standard und den HDL-Proben (10 μg, 20 μg und 30 μg des Proteins) 38 Abbildung 10: Die Immundetektion der gebundenen Antikörper Apo-Protein A 1 durch eine Chemilumineszenz-Reaktion mit Größenmarker (M) zum Nachweis von HDL. Apo-AI, das Hauptprotein des HDL, mit einer Molekülgröße von 28 kDa wurde in 1,95 μg, 0,99 μg, 0,5 μg und 0,099 μg des HDL-Isolates identifiziert 39 Abbildung 11: Die eNOS-Phosphorylierung an Ser1177 zu den Zeitpunkten V1, V2, V3 bei der HIIT-(C), MCT-(B) und CG-Gruppe-(A) 40 Abbildung 12: Die eNOS-Phosphorylierung an Thr495 zu den Zeitpunkten V1, V2, V3 bei der HIIT-(F), MCT-(E) und CG-Gruppe(D) 42 Abbildung 13: Aktivität der Paraoxonase-1 im HDL 45 Abbildung 14: Aktivität der Paraoxonase-1 im Serum 46 Abbildung 15: TBARS-Konzentration im Serum [μmol/l] 48 / Background: Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) is a complex disease. Due to its increasing hospitalization rates, HFpEF is gaining importance in the healthcare system. Despite the high mortality rate, there is no successful treatment procedure and no standard therapy has been established. Moreover, HFpEF makes up half of all heart failure cases, which underlines the usefulness of finding the effective therapy. One of the determining factors of HFpEF pathophysiology is endothelial dysfunction. The reduction of NO-bioavailability in endothelium and consequently endothelial dysfunction provides to LV stiffness and diastolic dysfunction of the heart. The exercise training triggers shear stress inside the blood vessels and results in HDL-mediated nitric oxide synthesis. In heart failure patients, the eNOS-increasing and vasodilative function of HDL can be impaired. However, a suitable training modality could work as endothelium-protective. Aims: The present doctoral thesis aims to investigate the influence of high-intensity interval training (peak HR 90-95%) and moderate-intensity continuous training (peak HR 60-70%) on the function of HDL by HFpEF patients. This study focuses on HDL-regulated eNOS function (function of endothelial nitric oxide synthesis), which is evaluated by phosphorylation of different aminoacids residues in the molecule. Furthermore, we determined the activity of PON-1 (paraoxonase-1), which speaks of the antioxidative role of HDL, as well the concentration of TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), which indicate increased lipid peroxidation. Material and methods: To clarify the questions, the probands were randomized to three groups: 1) HIIT (high-intensity interval training, 2) MCT (moderate-intensity continuous training) and 3) CG (control group). Before, during, and after different training interventions the HDL was isolated from the blood serum of probands by ultracentrifugation. Further, the HDL isolates were incubated with human aortic endothelial cells. The HDL-induced eNOS phosphorylation at the activating position Ser1177 (which results in increased activity of eNOS) and deactivating Thr495 (which results in inhibition of eNOS activity) were assessed by western blotting. The activated phosphorylation of eNOS leads to increased NO production. Subsequently, to investigate how modifiable the endothelial-protective role of HDL is and to find the possible correlation, the antioxidative function of HDL was evaluated. The latter was assessed by measuring the activity of the associated enzyme PON-1 (paraoxonase-1), which protects the lipoproteins against oxidative modifications. The protective property of HDL might be among others modified by reactive oxygen species. The reduced activity of PON-1 can be associated with increased lipid peroxidation and therefrom resulting fatty acids radicals. In this study, the amount of fatty acids radicals was indicated by the concentration of TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances). Results and observations: Exercise training can increase phosphorylation at Ser1177. Indeed, the first supervised part of HIIT resulted in a significant increase of HDL-induced eNOS-Phosphorylation at Ser1177. However, neither after HIIT nor after MCT any significant decline of eNOS phosphorylation at deactivated position Thr495 could be demonstrated. Regarding the eNOS phosphorylation after MCT and in CG, no significant changes were observed. Furthermore, significantly increased activity of PON-1 in serum as well as in HDL was observed after HIIT. But, neither in MCT nor in the control group any significant increase in PON-1 activity was observed. The increased concentration of TBARS was detected in all groups. After the interventions, no significant differences concerning the concentration of TBARS were demonstrated in any group. Conclusions: High-intensity interval training by HFpEF patients results in increased HDL- induced eNOS phosphorylation, which is accompanied by significantly increased activity of PON-1. Therefore, we can speculate that HIIT could enhance the endothelial function of HDL and would be in the future one of the possible effective treatment methods for HFpEF. Furthermore, this study derives that compliance in all groups was higher during the supervised training than during home-based intervention. Eventually, the usefulness of HIIT in clinical settings requires further investigation.:Inhaltsverzeichnis I Tabellenverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 3 1.1 Die Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion 3 1.1.1 Definition der Herzinsuffizienz, Klinisches Bild, Einteilung nach der Pathophysiologie 3 1.1.2 Epidemiologie der HFpEF 3 1.1.3 Pathomechanismus der HFpEF 4 1.1.4 HFpEF vs. HFrEF 11 1.1.5 Diagnose der HFpEF 12 1.1.6 Behandlungsmöglichkeiten 12 1.2 Körperliches Training 14 1.2.1 Belastungsintoleranz bei HFpEF 14 1.2.2 Hochintensives Intervalltraining (HIIT) und Moderat-Intensives Kontinuierliches Ausdauertraining (MCT) 15 1.3 High density lipoproteins 16 1.3.1 HDL bei Herzinsuffizienz 16 1.3.2 Funktionen und Bedeutung von HDL-Partikeln 17 1.4 Zielsetzung und Fragestellung 19 2 Material 20 2.1 Serum 20 2.2 Zellkulturmaterial 20 2.3 Kulturmedium 20 2.4 Chemikalien und Lösungen 20 2.5 Färbelösungen 20 2.6 Antikörper 20 2.7 Chemilumineszenz 20 2.8 Sonstige Materialien 21 2.9 Geräte 21 2.10 Software 21 3 Methoden 22 3.1 Studiendesign 22 3.2 Trainingsintervention 23 3.3 Isolation des HDL 24 3.3.1 Vorarbeiten 24 3.3.2 HDL Isolation 24 3.3.3 HDL Aufreinigung 25 3.4 Bestimmung der Proteinkonzentration nach der BCA-Methode 25 3.5 Stimulation der Zellen 26 3.6 Western Blot 26 3.7 Gelelektrophorese 27 3.8 Proteintransfer 28 3.9 Immundetektion 29 3.10 Chemilumineszenz 29 3.11 PON-1 Aktivität 30 3.12 TBARS 30 3.13 Statistische Analyse 30 4 Ergebnisse 31 4.1 Charakterisierung der Patienten 31 4.2 Patientendaten 32 4.3 Qualität des isolierten HDL 38 4.4 Die HDL-induzierte eNOS-Phosphorylierung 40 4.5 Aktivität der Paraoxonase 1 (PON-1) 44 4.6 TBARS-Konzentration im Serum 47 5 Diskussion 49 5.1 Hauptaussagen 49 5.1.1 Endotheliale Effekte des Trainings via HDL 50 5.1.2 Trainingsmodalitäten als potentielle Therapie 52 5.1.3 Denkbarer molekularer Mechanismus für die Regulation von endothelialen Funktionen des HDL 55 5.1.4 Quantitative vs. qualitative Auswertung der HDL Funktion 57 5.1.5 Unterschiede bei der Einhaltung der verschiedenen Trainingsprotokollen 59 5.1.6 Ausblick für zukünftige Forschungsarbeiten 61 5.1.7 Studienlimitationen 63 6 Zusammenfassung 65 7 Summary 67 8 Literaturverzeichnis 69 9 Anlage 1 88 10 Anlage 2 89 11 Curriculum vitae 90 12 Danksagung 91 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Reagenzien zur Vorbereitung eines 8 % und 12 % SDS-Polyacrylamidgels 27 Tabelle 2: Die verwendeten Antikörper zur Detektion der Proteine 29 Tabelle 3: Patientendaten zu Beginn der Studie -V1 32 Tabelle 4: Patientendaten zu den Zeitpunkten V1, V2, V3 33 Tabelle 5: Medikation 34 Tabelle 6: Lipidprofil 36 Tabelle 7: Ergospirometrie 37 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Pathomechanismus der myokardialen Dysfunktion (übernommen aus Paulus & Tschöpe, 2013) 6 Abbildung 2: Entstehung der myokardialen Dysfunktion durch Veränderungen innerhalb extrazellulärer Matrix und Kardiomyozyten bei Übergewicht und Diabetes mellitus (DM) 7 Abbildung 3: Komorbiditäten bei HFpEF als Trigger für diastolische Dysfunktion 9 Abbildung 4: NO Synthese als Antwort auf Shear Stress 10 Abbildung 5: Schematische Darstellung, wie ein körperliches Training das Krankheitsfortschreiten sowie HDL-induzierte NO-Produktion beeinflusst (übernommen aus Adams et al., 2013) 18 Abbildung 6: Studiendesign 22 Abbildung 7: Trainingsprotokoll, MCT-Moderat-Intensives Kontinuierliches Ausdauertraining, HIIT- Hochintensives Intervalltraining, HRpeak- maximale Herzfrequenz (übernommen aus Suchy et al., 2014) 23 Abbildung 8: Positionieren der Kanülenspitze und Entnahme des HDL 25 Abbildung 9: SDS-Page nach Färbung mit Coomassie-Blau zum Nachweis von HDL mit Größenmarker, BSA-Standard und den HDL-Proben (10 μg, 20 μg und 30 μg des Proteins) 38 Abbildung 10: Die Immundetektion der gebundenen Antikörper Apo-Protein A 1 durch eine Chemilumineszenz-Reaktion mit Größenmarker (M) zum Nachweis von HDL. Apo-AI, das Hauptprotein des HDL, mit einer Molekülgröße von 28 kDa wurde in 1,95 μg, 0,99 μg, 0,5 μg und 0,099 μg des HDL-Isolates identifiziert 39 Abbildung 11: Die eNOS-Phosphorylierung an Ser1177 zu den Zeitpunkten V1, V2, V3 bei der HIIT-(C), MCT-(B) und CG-Gruppe-(A) 40 Abbildung 12: Die eNOS-Phosphorylierung an Thr495 zu den Zeitpunkten V1, V2, V3 bei der HIIT-(F), MCT-(E) und CG-Gruppe(D) 42 Abbildung 13: Aktivität der Paraoxonase-1 im HDL 45 Abbildung 14: Aktivität der Paraoxonase-1 im Serum 46 Abbildung 15: TBARS-Konzentration im Serum [μmol/l] 48