L’hypoxie tumorale est l’une des principales causes de l’agressivité des glioblastomes (GB). Plusieurs études attestent de l’implication de l’isoforme HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α) dans la progression de ces tumeurs et dans leur résistance à la radiothérapie (RT). Plus récemment, il a été établi que l’isoforme HIF-2α régule la capacité tumorigénique des cellules souches de GB (CSG). Cependant, le rôle de ce facteur dans la croissance des cellules de GB différenciées et leur réponse à la RT est moins documenté. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail a été de renforcer ces connaissances à l’échelle préclinique en utilisant deux approches d’ARN interférence (ARNi) pour moduler l’expression de HIF-2 : cibler directement HIF-2α ou cibler HAF (hypoxia associated factor), un facteur impliqué dans le switch de HIF-1α vers HIF-2α. Les résultats obtenus sur un modèle orthotopique de cellules humaines de GB (U251-MG) différenciées montrent que l’invalidation de HAF conduit à un fort ralentissement de la croissance de ces tumeurs mais indépendamment de HIF-1α ou HIF-2α. L’effet de l’invalidation de HIF-2α serait, quant à lui, dépendant de l’environnement tumoral. En effet, la diminution d’expression de HIF-2α dans les cellules U251 ne modifie pas la croissance tumorale dans un modèle de greffe sous-cutanée, alors que celle-ci favorise la croissance tumorale lorsque les cellules de GB sont implantées en intracérébral. Par comparaison aux tumeurs contrôles, ces tumeurs sont plus invasives et mieux perfusées. In vitro, l’inhibition de l’expression de HIF-2α n’a aucun effet sur la survie des cellules U251 alors qu’elle diminue la mort apoptotique de ces cellules exposées aux rayons X.L’ensemble des données présentées dans cette étude suggère que HAF et HIF-2α pourraient réguler la capacité tumorigénique des cellules de GB différenciées, tout comme observé pour les CSG. En outre, ces résultats soulignent la nécessité de prendre en compte le microenvironnement cellulaire afin de mieux comprendre le comportement de la tumeur dans son environnement hypoxique. / Hypoxia is one of the main causes of glioblastoma (GB) aggressiveness. Various studies attest on the involvement of the HIF-1α isoform (hypoxia inducible factor-1α) in the progression of these tumors and in their resistance to radiation therapy (RT). More recently, it was established that the HIF-2α isoform regulates the tumorigenic capacity of GB stem cells (GSC). However, the role of this factor in the growth of differentiated GB cells and their response to RT is less documented. In this context, the goal of this work was to strengthen this knowledge at the preclinical level by using two RNA interference (RNAi) strategies to modulate the expression of HIF-2: one directly targets HIF-2α, the other one targets HAF (hypoxia associated factor), a factor involved in the switch of HIF-1α to HIF-2α. Our results obtained on an orthotopic model of differentiated human GB (U251-MG) cells showed that the invalidation of HAF leads to a strong slowdown in tumor growth but independently of HIF-1α or HIF-2α. On the other hand, the effect of HIF-2α silencing seems dependent on the tumor environment. Indeed, the extinction ofHIF-2α expression in U251 cells does not modify tumor growth in a subcutaneous model, whereas it promotes tumor growth when GB cells are intracerebrally grafted. Compared to control tumors, these tumors are more invasive and highly perfused. In vitro, the inhibition of HIF-2α expression has no effect on GB cell survival whereas decreasing the X-rays induced apoptotic death.Collectively, these data suggest that HAF and HIF-2α could regulate the tumorigenic capacity of differentiated GB cells, like it does in CSGs. In addition, these results highlight the need to take into account the cellular microenvironment to better understand the behavior of the tumor in its hypoxic environment.

Les traitements des cancers des VADS reposent sur la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Malgré ces traitements, la survie globale des patients à 5 ans est de l’ordre de 50%. Les causes d’échec thérapeutique sont dues au profil de résistance des tumeurs. Le ciblage de l’axe EGFR/mTOR/HIF-1 par une combinaison de rapalogues et d’anti-EGFR a montré son efficacité sur certaines tumeurs solides. L’objet de ce travail de thèse a été de caractériser l’impact d’une combinaison de drogues à faibles doses sur des lignées cellulaires des VADS au moyen d’une approche pharmacologique et moléculaires. Nos résultats montrent que la combinaison de la rapamycine (5nM) au cetuximab (2,5μg/ml) diminue la survie clonogénique des cellules et permet une inhibition du facteur de transcription HIF-1α. Cette combinaison de drogue améliore l’efficacité de la radiothérapie. En revanche, l’induction de HIF-2a induite par le traitement provoque la résistance des cellules aux traitements par, et une rechute rapide des tumeurs in vivo. L’inhibition de HIF-2 permet une inhibition de la survie cellulaire d’environ 100% dans un modèle résistant. / Management of HNSCC relies on surgery, radiotherapy, and chemotherapy. Despite these treatments, the 5 years overall survival of patient is lower than 50%. Main causes of therapeutic failure are due to the profile of resistance of tumors. The efficacy of a combination rapalogues and anti-EGFR therapies in targeting the EGFR/mTOR/HIF-1 axis in solid tumors was shown previously. In this PhD work, we have evaluated the impact of a low-dose drug combination on head and neck cancer cells lines with a pharmacological and molecular approach. We show that the combination of rapamycine (5nM) and cetuximab (2,5μg/ml) efficiently inhibits the HIF-1 transcription factor and impairs cell clonogenic survival. The efficacy of radiation therapy is improved by this drug combination. However, cell resistance to the treatment is acquired via the induction of HIF-2 in our resistant model cell line. This induction is associated with more tumor relapse in tumors mice xenograft. The inhibition of HIF-2 achieves a dramatic drop of cell clonogenic survival to < 1%.

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est définie comme une courbure de la colonne vertébrale supérieure à 10 degrés, qui est de cause inconnue et qui affecte de façon prépondérante les adolescents. Des études précédentes sur des modèles murins ont démontré une inactivation partielle du gène Pitx1. Cette inactivation partielle provoque une déformation spinale sévère lors du développement des souris Pitx1+/-, ce qui est grandement similaire au phénotype de la SIA. En se basant sur ces observations, nous postulons que la perte de fonction de Pitx1 pourrait avoir un rôle dans la SIA et pourrait être régulée par des mécanismes moléculaires spécifiques. En effet, des études faites sur l’expression de Pitx1 révèlent une perte de son expression dans les ostéoblastes dérivés de patients SIA au niveau de l’ARNm. Nous émettons l’hypothèse que la perte de Pitx1 dans la SIA pourrait être déclenchée par des facteurs hypoxiques puisqu’il est connu que Pitx1 est réprimé par l’hypoxie et que HIF-2 alpha est surexprimés dans les ostéoblastes des patients SIA même dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons découvert une mutation dans le domaine ODD des HIF-1 alpha chez certains patients SIA (3,1%). Une fonction connue de ce domaine est de stabiliser et d’augmenter l’activité transcriptionnelle de HIF-1 alpha dans des conditions normoxiques. Nous avons confirmé, par la technique EMSA, l’existence d’un élément de réponse fonctionnel à l’hypoxie au niveau du promoteur de Pitx1. Cependant, des co-transfections avec des vecteurs d’expression pour HIF-1 alpha et HIF-2 alpha, en présence de leur sous-unité beta ARNT, ont conduit à une activation du promoteur de Pitx1 dans la lignée cellulaire MG-63 ainsi que dans les ostéoblastes des sujets contrôles. Il est intéressant de constater qu’aucune activité du promoteur de Pitx1 dans les ostéoblastes SIA n’a été observée, même après la co-expression de HIF-2 alpha et ARNT, confirmant le fait que l’expression de Pitx1 est abrogée dans la SIA. Dans l’ensemble, nos résultats démontrent un rôle important de Pitx1 dans la SIA et une possible régulation par des facteurs hypoxiques. / Adolescent Idiopathic Scoliosis is a lateral curvature of the spine greater than 10 degrees, with an unknown cause, affecting primarily adolescents. Previous mouse model studies showed that partial inactivation of Pitx1 gene resulted in the development of severe spinal deformities in Pitx1 +/- mice, which is strikingly similar to the AIS phenotype. Based on this observation, we postulated that loss of Pitx1 function might have a role in AIS and could be regulated through specific molecular mechanisms. Indeed, expression studies revealed a loss of Pitx1 expression in osteoblasts derived from AIS patients, at the mRNA level. We hypothesized that the loss of Pitx1 in AIS could be triggered by hypoxic factors, since Pitx1 is known to be repressed by hypoxia and that HIF-2 alpha was up regulated in AIS osteoblasts even under normoxic conditions. Also, we found a mutation in the ODD domain of HIF-1 alpha in some AIS patients (3.1%), which is known to stabilize and enhance HIF-1 alpha transcriptional activity in normoxic conditions. We confirmed through EMSA the existence of a functional hypoxia response element on Pitx1 promoter. However, co-transfection assays with HIF-1 alpha and HIF-2 alpha expression vectors in the presence of their beta subunit ARNT led to the activation of Pitx1 promoter in human osteoblast cell line MG-63 cells and osteoblasts from control subjects. Interestingly, no Pitx1 promoter activity was observed in AIS osteoblasts, even after the co expression of HIF2 alpha and ARNT, consolidating the fact that Pitx1 expression is abrogated in AIS. Taken together, our findings show an important role for Pitx1 in AIS and hypoxic factors could be one of its regulators.

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est définie comme une courbure de la colonne vertébrale supérieure à 10 degrés, qui est de cause inconnue et qui affecte de façon prépondérante les adolescents. Des études précédentes sur des modèles murins ont démontré une inactivation partielle du gène Pitx1. Cette inactivation partielle provoque une déformation spinale sévère lors du développement des souris Pitx1+/-, ce qui est grandement similaire au phénotype de la SIA. En se basant sur ces observations, nous postulons que la perte de fonction de Pitx1 pourrait avoir un rôle dans la SIA et pourrait être régulée par des mécanismes moléculaires spécifiques. En effet, des études faites sur l’expression de Pitx1 révèlent une perte de son expression dans les ostéoblastes dérivés de patients SIA au niveau de l’ARNm. Nous émettons l’hypothèse que la perte de Pitx1 dans la SIA pourrait être déclenchée par des facteurs hypoxiques puisqu’il est connu que Pitx1 est réprimé par l’hypoxie et que HIF-2 alpha est surexprimés dans les ostéoblastes des patients SIA même dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons découvert une mutation dans le domaine ODD des HIF-1 alpha chez certains patients SIA (3,1%). Une fonction connue de ce domaine est de stabiliser et d’augmenter l’activité transcriptionnelle de HIF-1 alpha dans des conditions normoxiques. Nous avons confirmé, par la technique EMSA, l’existence d’un élément de réponse fonctionnel à l’hypoxie au niveau du promoteur de Pitx1. Cependant, des co-transfections avec des vecteurs d’expression pour HIF-1 alpha et HIF-2 alpha, en présence de leur sous-unité beta ARNT, ont conduit à une activation du promoteur de Pitx1 dans la lignée cellulaire MG-63 ainsi que dans les ostéoblastes des sujets contrôles. Il est intéressant de constater qu’aucune activité du promoteur de Pitx1 dans les ostéoblastes SIA n’a été observée, même après la co-expression de HIF-2 alpha et ARNT, confirmant le fait que l’expression de Pitx1 est abrogée dans la SIA. Dans l’ensemble, nos résultats démontrent un rôle important de Pitx1 dans la SIA et une possible régulation par des facteurs hypoxiques. / Adolescent Idiopathic Scoliosis is a lateral curvature of the spine greater than 10 degrees, with an unknown cause, affecting primarily adolescents. Previous mouse model studies showed that partial inactivation of Pitx1 gene resulted in the development of severe spinal deformities in Pitx1 +/- mice, which is strikingly similar to the AIS phenotype. Based on this observation, we postulated that loss of Pitx1 function might have a role in AIS and could be regulated through specific molecular mechanisms. Indeed, expression studies revealed a loss of Pitx1 expression in osteoblasts derived from AIS patients, at the mRNA level. We hypothesized that the loss of Pitx1 in AIS could be triggered by hypoxic factors, since Pitx1 is known to be repressed by hypoxia and that HIF-2 alpha was up regulated in AIS osteoblasts even under normoxic conditions. Also, we found a mutation in the ODD domain of HIF-1 alpha in some AIS patients (3.1%), which is known to stabilize and enhance HIF-1 alpha transcriptional activity in normoxic conditions. We confirmed through EMSA the existence of a functional hypoxia response element on Pitx1 promoter. However, co-transfection assays with HIF-1 alpha and HIF-2 alpha expression vectors in the presence of their beta subunit ARNT led to the activation of Pitx1 promoter in human osteoblast cell line MG-63 cells and osteoblasts from control subjects. Interestingly, no Pitx1 promoter activity was observed in AIS osteoblasts, even after the co expression of HIF2 alpha and ARNT, consolidating the fact that Pitx1 expression is abrogated in AIS. Taken together, our findings show an important role for Pitx1 in AIS and hypoxic factors could be one of its regulators.