In der forensischen Fallarbeit gilt die Analyse von Short Tandem Repeats (STRs) als der Goldstandard zur Identifizierung unbekannter Personen. Aus biologischem Tatortspurenmaterial werden STR-Profile erstellt, die anschließend mit Vergleichsprofilen tatverdächtiger Personen oder mit Profilen in der nationalen DNA-Datenbank abgeglichen werden. Dieser Ansatz identifiziert jedoch nur Personen, die den Ermittlungsbehörden bereits bekannt sind. In Fällen ohne Datenbanktreffer oder fehlenden Augenzeugenberichten, die mögliche Hinweise auf Tatverdächtige liefern können, können unzureichende Ermittlungshinweise die Aufklärung einer Straftat verzögern. Die Limitierung der vergleichenden DNA-Analyse gab der forensischen Forschung in den vergangenen Jahrzehnten den Anstoß, Erkenntnisse aus der humangenetischen Forschung über die molekularen Grundlagen des menschlichen Aussehens für forensische Zwecke zu nutzen. Dies führte zu der Erweiterung der forensischen Genetik um die forensische DNA-Phänotypisierung (FDP), bei der DNA-Marker zum äußeren Erscheinungsbild, dem biologischen Alter und der biogeografischen Herkunft einer unbekannten Person untersucht werden können. Durch dieses Instrument kann die polizeiliche Investigativarbeit im Rahmen der Strafverfolgung unterstützt werden, indem durch Erhebung phänotyprelevanter Informationen der Pool potentiell tatverdächtiger Personen reduziert werden kann. Im Dezember 2019 ist in Deutschland mit einer Änderung der Strafprozessordnung die forensische DNA-Analyse gesetzlich auch zur Feststellung der Augen-, Haar- und Hautfarbe sowie des biologischen Alters einer unbekannten Person zugelassen worden, nicht jedoch um die Bestimmung der biogeografischen Herkunft. In genomweiten Assoziationsstudien verschiedener Populationen wurden in den vergangenen Jahrzehnten Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) identifiziert, die mit der humanen Pigmentierung bestimmter phänotypischer Merkmale assoziiert sind. Auf dieser Grundlage wurden forensische Testsysteme und statistische Vorhersagemodelle entwickelt, die mit einer relativ geringen Anzahl hochinformativer SNP-Marker relativ präzise Vorhersagen über die Pigmentierung von Körpermerkmalen treffen können. Ein bereits forensisch validiertes und anerkanntes Testsystem ist das HIrisPlex-S-System, mit dem eine DNA-basierte, probabilistische Vorhersage der Augen-, Haar- und Hautfarbe durch Untersuchung von 41 SNP-Markern möglich ist. Die Berechnung der Vorhersagewahrscheinlichkeiten erfolgt für drei Augenfarben-, vier Haarfarben- und fünf Hautfarbenkategorien mit Hilfe eines online verfügbaren Webtools (https://hirisplex.erasmusmc.nl) basierend auf einem multinomialen logistischen Regressionsmodell. Für die Interpretation der Ergebnisse stehen Leitfäden zur Verfügung, mit denen anhand der berechneten Wahrscheinlichkeitswerte die wahrscheinlichsten phänotypischen Merkmale abgeleitet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das HIrisPlex-S-System unter Verwendung der SNaPshot-Methode im molekulargenetischen Labor des Instituts für Rechtsmedizin der Universität Leipzig etabliert, um dieses Werkzeug zukünftig für die Anwendung in der Strafverfolgung in Sachsen anbieten zu können. Die Analyse der 41 SNP-Marker erfolgte in zwei Multiplex-Assays: einem 24-Plex-Assay mit den SNP-Markern zur Bestimmung der Augen- und Haarfarbe und einem 17-Plex-Assay mit den SNP-Markern zur Bestimmung der Hautfarbe. Im Zuge der Implementierung des SNaPshot-Workflows (Multiplex-PCR – Single Base Extension – Kapillarelektrophorese) wurden je Assay Primerkonzentrationen der PCR- und SBE-Primer sowie thermozyklische Reaktionsbedingungen und kapillarelektrophoretische Analyseparameter angepasst, um eine optimale Detektion der 41 SNP-Marker zu gewährleisten. In Anlehnung an die Validierungsrichtlinien der SWGDAM wurden die Sensitivität des Testsystems sowie die durchschnittlichen Peakhöhen und das heterozygote Peakhöhenverhältnis der SNPs bestimmt. Es konnten bis zu einer DNA-Inputmenge von 125 pg und teilweise bis zu 63 pg vollständige SNP-Profile erzeugt werden, was die hohe Sensitivität des Testsystems belegt. Durch die Bestimmung der durchschnittlichen Peakhöhen und der heterozygoten Peakhöhenverhältnisse bei unterschiedlichen DNA-Mengen konnten Erkenntnisse über die Detektionseigenschaften der SNP-Marker gewonnen werden, die für die Beurteilung der Quantität und Qualität der analysierten Probe von Bedeutung sind. Die Analyse von Mischspuren zeigte, dass eine Detektion in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis zwar potenziell möglich ist, biallelische Marker wie SNPs jedoch weniger dafür geeignet sind. Mit dieser Arbeit wurde eine überwiegend europäische Studienpopulation von 300 Personen mit dem HIrisPlex-S-System untersucht und die ermittelte, wahrscheinlichste Augen-, Haar- und Hautfarbe der Probandinnen und Probanden mit deren tatsächlichen, mittels Fragebogen erhobenen Merkmalen, verglichen. Auf Grundlage der Untersuchungsergebnisse können folgende Fragestellungen beantwortet werden: 1) Welche Genauigkeit besitzt das HIrisPlex-S-System in der Vorhersage der Augen-, Haar- und Hautfarbe? Das HIrisPlex-S-Vorhersagemodell zeigt eine gute Leistung bei der Differenzierung und Klassifizierung kontrastierender Farbkategorien wie blaue und braune Augen (AUC > 0,9), rote und schwarze Haare (AUC > 0,8) sowie sehr helle und dunkle Haut (AUC > 0,8) und eine geringere Leistung bei der Identifikation von Zwischentönen, wie intermediäre Augen (grün, grün-braun etc.), blonde und braune Haare und intermediäre Haut. 2) Stehen die erzielten Ergebnisse im Einklang mit der Literatur? Mit der Anwendung des etablierten HIrisPlex-S-Systems auf die untersuchte, überwiegend mitteleuropäische Studienpopulation konnten Vorhersagegenauigkeiten erzielt werden, die im Einklang mit den in der Literatur publizierten Ergebnissen von Untersuchungen an verschiedenen (europäischen und nicht-europäischen) Populationen stehen, insbesondere hinsichtlich der Vorhersage einer intermediären Augenfarbe oder blonder und brauner Haarfarbe. 3) Welche Bedeutung hat das Testsystem für die forensische Praxis? Das HIrisPlex-S-System kann die Aufklärung von Straftaten unterstützen, indem es den Ermittlungsbehörden Hinweise auf das äußere Erscheinungsbild tatrelevanter Personen geben kann, wenn ein Abgleich mit der DNA-Datenbank zu keinem Ergebnis geführt hat. Da die Analysmethode auch die Untersuchung degradierten Materials erlaubt, kann sie zur auch Identifizierung menschlicher Überreste eingesetzt werden. Die Ergebnisse dieser Studie und die erfolgreiche Teilnahme am Pigmentierungsmodul der GEDNAP-Ringversuche 64 und 65 belegen die zuverlässige Anwendbarkeit des spezifisch angepassten HIrisPlex-S-Systems in der forensischen Routine mit der beschriebenen Vorhersagegenauigkeit.

<div><div>In the forensic science community, there is a vast need for tools to help assist investigations when standard DNA profiling methods are uninformative. Methods such as Forensic DNA Phenotyping (FDP) and proteomics aims to help this problem and provide aid in investigations when other methods have been exhausted. FDP is useful by providing physical appearance information, while proteomics allows for the examination of difficult samples, such as hair, to infer human identity and ancestry. To create a “biological eye witness” or develop informative probability of identity match statistics through proteomically inferred genetic profiles, it is necessary to constantly strive to improve these methods. </div><div><br></div><div>Currently, two developmentally validated FDP prediction assays, ‘HIrisPlex’ and ‘HIrisplex-S’, are used on the capillary electrophoresis to develop a phenotypic prediction for eye, hair, and skin color based on 41 variants. Although highly useful, these assays are limited in their ability when used on the CE due to a 25 variant per assay cap. To overcome these limitations and expand the capacities of FDP, we successfully designed and validated a massive parallel sequencing (MPS) assay for use on both the ThermoFisher Scientific Ion Torrent and Illumina MiSeq systems that incorporates all HIrisPlex-S variants into one sensitive assay. With the migration of this assay to an MPS platform, we were able to create a semi-automated pipeline to extract SNP-specific sequencing data that can then be easily uploaded to the freely accessible online phenotypic prediction tool (found at https://hirisplex.erasmusmc.nl) and a mixture deconvolution tool with built-in read count thresholds. Based on sequencing reads counts, this tool can be used to assist in the separation of difficult two-person mixture samples and outline the confidence in each genotype call.<br></div><div><br></div><div>In addition to FDP, proteomic methods, specifically in hair protein analysis, opens doors and possibilities for forensic investigations when standard DNA profiling methods come up short. Here, we analyzed 233 genetically variant peptides (GVPs) within hair-associated proteins and genes for 66 individuals. We assessed the proteomic methods ability to accurately infer and detect genotypes at each of the 233 SNPs and generated statistics for the probability of identity (PID). Of these markers, 32 passed all quality control and population genetics criteria and displayed an average PID of 3.58 x 10-4. A population genetics assessment was also conducted to identify any SNP that could be used to infer ancestry and/or identity. Providing this information is valuable for the future use of this set of markers for human identification in forensic science settings. </div></div><div><br></div>