Mesenchymal stem cell (MSC) differentiation is known to be influenced by a range of environmental stimuli. MSC-based bone regeneration strategies would benefit from the identification of scaffold material properties which intrinsically promote osteoblast lineage progression. The aim of this work was to contribute to the understanding of elucidating cause-effect relationships between extracellular matrix (ECM) signaling and osteogenic MSC differentiation using poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels as a material platform. First, the effect of several ECM proteins associated with bone morphogenesis or bone fracture healing on MSC osteogenesis was investigated. Second, collagen-mimetic proteins (Scl2) were modified in order to incorporate them in a 3D network, and cell adhesion and activation of cell signaling were evaluated, as well. Finally, the influence of integrin α1 and α2 binding on human MSC (hMSC) osteogenesis was investigated toward the goal of deconvoluting the impact of integrin-based interactions on associated cell behavior. In terms of the osteoinductivity of select ECM components, the results showed that both FG and LN enhanced the osteogenic response of encapsulated MSC cells. In addition, the integrin-based interactions supported by these ECM components indicated that integrin α2 and α6 appeared to play an important role in MSC osteogenesis. Regarding Scl2 protein studies, Scl2-1, Scl2-2, and Scl2-3 were functionalized with photocrosslinking sites to enable incorporation into a 3D hydrogel matrix. characterization studies confirmed that the functionalization of the Scl2 proteins did not disrupt triple helix conformation, integrin binding, or cell adhesion. Also, initial cell studies confirmed specific hMSC adhesion to Scl2 proteins and appropriate activation of different MAP kinase pathways. Finally, Scl2 proteins were conjugated into PEGDA hydrogels and their effect on hMSC osteogenesis was evaluated. The results indicated that both PEG-Scl2-2 and PEG-Scl2-3 were osteoinductive, but in different ways. Therefore, to gain insight into the origins of the observed osteogenic responses, the influence of p38 pathway in osteogenesis of hMSC was investigated in order to establish its potential causative relationship with Scl2 proteins. The results of the p38 inhibition studies suggested p38 pathway may regulate osteogenesis in hMSCs. Further research is needed for investigation of detailed mechanism of osteogenesis regulation.

Myocardial infarction is a prominent medical problem in the world today. Current treatments are limited and do not strive to regenerate the myocardial tissue that is lost post-infarction. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have been shown to improve cardiac function when implanted post-infarction. The effectiveness of stem cell therapy largely depends on the delivery method. Current delivery methods are insufficient due to their low cell engraftment rate and inability to target the endocardium, where most myocardial infarctions occur. Biological microthreads are a promising new local cell delivery method that may improve upon these current limitations. We hypothesize that biological microthreads will increase efficiency of hMSC delivery to the beating rat heart compared to intramyocardial injection. To test our hypothesis we seeded biological microthreads in vitro with 100 ìL of cell suspension (100,000 hMSCs). After one day, an average of 11,806 ± 3,932 hMSCs were counted on the biological microthreads. The biological microthreads were attached to suture needles to allow targeted delivery to the rat heart (in the left ventricular wall). Human mesenchymal stem cells were loaded with quantum dots prior to seeding the biological microthread bundles or delivery to the rat heart via injection. For intramyocardial injection, a cell suspension containing 10,000 hMSCs (35 ìL) was injected into the myocardial wall using a 100 ìL syringe. The delivery efficiency of each method was determined by sectioning the heart into 8 µm thick sections and analyzing three sections every sixty sections (24 µm every 480 µm) for quantum dot loaded hMSCs. These sections were stained with Hoechst dye and quantum dot loaded cells in the heart sections were manually counted. The delivery efficiency of each biological microthread implantation was calculated by dividing the number of counted quantum dot loaded hMSCs in the heart wall by the average number of hMSCs on the biological microthread bundles (normalized to the length that was implanted in the heart wall) after 24 hours. The delivery efficiency of intramyocardial injection was calculated by dividing the number of counted quantum dot loaded hMSCs in the heart wall by 10,000 (the number of cells injected). Biological microthread mediated hMSC delivery had a significantly higher delivery efficiency (66.6 ± 11.1%) compared to intramyocardial injection (11.8 ± 6.25%) after 1 hour (p < 0.05). Biological microthread implantation tracking illustrated that we were able to deliver hMSCs to the myocardium and endocardium of the left ventricular wall for hMSC delivery. This study illustrates that biological microthreads can serve as an efficient means of delivering hMSCs to the infarcted heart. Unlike the currently utilized delivery methods, biological microthreads can target the infarcted layer of the left ventricular wall and maximize hMSC engraftment to that layer.

The local release of complexed siRNA from biomaterials enables targeted therapy of specific cells and tissues. This thesis focused on gelatin microparticles cross-linked (cGM) with an anhydride-containing oligomer (oPNMA) as a drug delivery system for siRNA. The siRNA-loaded cGM were aggregated with SaOS-2 cells or human mesenchymal stem cells (hMSC) to microtissues and stimulated with osteogenic supplements. Cell survival and tissue formation in microtissues could be improved by incorporating cGM in spheroid cultures. We observed hydroxyapatite deposition in the particles in dependence of medium and cell type. Osteogenic stimulation with BMP-2 and simultaneous silencing of BMP-2 antagonist chordin accelerated matrix mineralization of the microtissues. Higher cross-linking degree of cGM positively influenced chordin silencing and alkaline phosphatase (ALP) activity as a marker for osteogenic differentiation. These higher cross-linked cGM mineralized in an osteogenic medium within 8–9 days, in presence and absence of cells. The effects of pre-differentiated and chordin-silenced microtissues were investigated by simulation of in vivo conditions in an unstimulated co-culture system of hMSC and human peripheral blood mononuclear cells (hPBMC). Increased ALP activity and osteoprotegerin (OPG) secretion were observed after 14 days compared to co-cultures with siRNA-free controls. These results indicate that the pre-differentiated and silenced microtissues can induce osteogenic differentiation of surrounding unstimulated cells. Using the microtissue approach with siRNA complexed with tyrosine-modified low molecular weight polyethyleneimine (P10Y/P5Y) as transfection reagent was not successful. The results of this thesis indicate that the pre-differentiation of microtissues with BMP-2 in combination with chordin silencing stimulates and enhances osteogenic differentiation of other stem cells. As a combination of biomaterial, RNAi, and autologous cells, microtissues could be a promising approach to regenerating bone defects.:Chapter I: Controlled release of siRNA for bone tissue engineering Chapter II: Microtissues from mesenchymal stem cells and siRNA-loaded cross-linked gelatin microparticles for bone regeneration Chapter III: Mineralizing gelatin microparticles as cell carrier and drug delivery system for siRNA for bone tissue engineering Chapter IV: Tyrosine-modified polyethylenimines for siRNA transfection in microtissues Chapter IV: Final discussion

Les systèmes distribués sont au cœur de nombreuses applications modernes (réseaux sociaux, services web, etc.). Cependant, les développeurs sont confrontés à de nombreux défis dans l’implémentation des systèmes distribués, notamment les comportements erronés à éviter et qui sont causées par la concurrence entre les entités de ce système. La génération automatique de code à partir des exigences des systèmes distribués reste un vieux rêve. Dans cette thèse, nous considérons la génération automatique d'un squelette de code portant sur les interactions entre les différentes entités d'un système distribué. Cela nous permet d'éviter les comportements erronés causés par la concurrence. Ensuite, ce squelette peut être complété par l'ajout et le débogage du code qui décrit les actions locales qui se passent sur chaque entité indépendamment de ses interactions avec les autres entités. / Distributed systems lie at the heart of many modern applications (social networks, web services, etc.). However, developers face many challenges in implementing distributed systems. The major one we focus on is avoiding the erroneous behaviors, that do not appear in the requirements of the distributed system, and that are caused by the concurrency between the entities of this system. The automatic code generation from requirements of distributed systems remains an old dream. In this thesis, we consider the automatic generation of a skeleton of code covering the interactions between the entities of a distributed system. This allows us to avoid the erroneous behaviors caused by the concurrency. Then, in a later step, this skeleton can be completed by adding and debugging the code that describes the local actions happening on each entity independently from its interactions with the other entities. The automatic generation that we consider is from a scenario-based specification that formally describes the interactions within informal requirements of a distributed system. We choose High-level Message Sequence Charts (HMSCs for short) as a scenario-based specification for the many advantages that they present: namely the clear graphical and textual representations, and the formal semantics. The code generation from HMSCs requires an intermediate step, called “Synthesis” which is their transformation into an abstract machine model that describes the local views of the interactions by each entity (A machine representing an entity defines sequences of messages sending and reception). Then, from the abstract machine model, the skeleton’s code generation becomes an easy task. A very intuitive abstract machine model for the synthesis of HMSCs is the Communicating Finite State Machine (CFSMs). However, the synthesis from HMSCs into CFSMs may produce programs with more behaviors than described in the specifications in general. We thus restrict then our specifications to a sub-class of HMSCs named "local HMSC". We show that for any local HMSC, behaviors can be preserved by addition of communication controllers that intercept messages to add stamping information before resending them. We then propose a new technique that we named "localization" to transform an arbitrary HMSC specification into a local HMSC, hence allowing correct synthesis. We show that this transformation can be automated as a constraint optimization problem. The impact of modifications brought to the original specification can be minimized with respect to a cost function. Finally, we have implemented the synthesis and the localization approaches into an existing tool named SOFAT. We have, in addition, implemented to SOFAT the automatic code generation of a Promela code and a JAVA code for REST based web services from HMSCs.

Während Korrosionsbeständigkeit bisher ein wichtiges Kriterium bei der Materialentwicklung von metallischen Implantaten war, erlangen korrodierbare Metalle wie zumeist Magnesium aber auch Eisen zunehmend Bedeutung in der gegenwärtigen Forschung. Magnesium ist ein osteokonduktives Material und stimuliert die Knochenneubildung. Nachteil ist jedoch die geringe Korrosionsbeständigkeit, sodass Magnesium in der Regel in vivo schneller abgebaut wird, als neuer Knochen gebildet werden kann. Verglichen mit Magnesium ist die Korrosion von elementarem Eisen in vivo langsam und zeigt keine lokale oder systemische Zytotoxizität. Während die meisten Forschungsarbeiten Eisen als degradierbares Implantatmaterial mit dem Ziel der kardiovaskulären Anwendung untersuchen, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit Eisenschäumen, die u.a. zur Heilung überkritisch großer und belasteter Knochendefekte eingesetzt werden sollen. Die Herstellung der Eisenschäume (Fe) erfolgt durch Pulvermetallurgieprozesse an den Fraunhofer-Instituten IKTS und IFAM in Dresden. Polyurethanschäume werden mit einer Carbonyleisensuspension mit 3,8 % Fe3P beschichtet, getrocknet, erhitzt und anschließend der verbleibende Eisenschaum gesintert. Die Bioaktivierung der Eisenschäume mit verschiedenen Calciumphosphatphasen erfolgt durch die InnoTERE GmbH. Hierfür werden die Eisenschäume phosphatiert und mit Brushit (Fe-B) beschichtet. Durch anschließendes Kochen bei 95 – 100 °C in 0,1 M NaOH für 24 h kann eine Hydroxylapatitschicht (Fe-HA) erhalten werden. Eine weitere Methode der Bioaktivierung stellt die Befüllung mit Calciumphosphat-Zementen dar. Dabei handelt es sich um einen von InnoTERE entwickelten Ein-Pasten-Calciumphosphat-Zement (1P PCP) und um einen magnesiumhaltigen Calciumphosphat-Zement (MgCPC). Die Eisenschäume werden mittels physikalisch-chemischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden im Hinblick auf Degradierbarkeit und Biokompatibilität in vitro untersucht und charakterisiert. Wesentliche Ziele der vorliegenden Arbeit sind neben der Charakterisierung des Korrosionsverhaltens, vor allem die Analyse der Reaktionen knochentypischer Zellen auf Beschichtungen sowie Korrosionsprodukte der metallischen Grundstruktur. Für die zellbiologischen Untersuchungen dienen die Osteoblastenzelllinie SaOs-2 sowie humane mesenchymale Stammzellen (hMSC). Es konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit der Beschichtung bzw. Füllung mit verschiedenen Calciumphosphatphasen die Eisenfreisetzung und damit das Korrosionsverhalten von Eisenschäumen variiert werden kann. Die höchsten Korrosionsraten sind bei unmodifizierten Eisenschäumen zu beobachten. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit erfolgt eine verminderte Eisenfreisetzung. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. die Füllung mit Magnesium-Calciumphosphat Zement wird die Freisetzung von Korrosionsprodukten nahezu vollständig unterbunden. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. HA wird neben dem Korrosionsverhalten auch die Bioaktivität der Proben beeinflusst. Während die unmodifizierten Fe in beiden untersuchten Zellkulturmedien sowie Fe-B in McCoys keinen Einfluss auf den Calcium- und Phosphatgehalt haben, ist bei Fe-B in DMEM über den gesamten Untersuchungszeitraum eine konstante Calcium- und Phosphatfreisetzung zu beobachten. Die bioaktiven Fe-HA zeigen den umgekehrten Effekt und entziehen dem Medium Calcium und Phosphat – in DMEM Calcium stärker als in McCoys und in McCoys Phosphat stärker als in DMEM. Für das erfolgreiche Einwachsen von Implantaten bzw. die Heilung von Knochendefekten sollten Zellen, die am Knochenauf- und -umbau beteiligt sind, durch das Einbringen des Implantats nicht negativ beeinflusst werden. Ein Schlüsselereignis stellt dabei die Adhäsion dar. Die beste Adhäsion ist für die beide getestete Zelltypen auf Fe-B zu beobachten. Für Fe-HA werden die zweitbesten Adhäsionseffizienzen erzielt. Während für die Osteoblasten dabei das Zellkulturmedium keinen Einfluss hat, ist für die Stammzellen im Vergleich zu den SaOs-2 Zellen allerdings nur eine halb so gute Adhäsion zu beobachten. Die mit MgCPC bzw. mit 1P CPC gefüllten Schäume dagegen zeigen eine sehr schlechte Adhäsion sowohl von Osteoblasten als auch von Stammzellen. Für Fe-B+1MgCPC kann jedoch durch eine Erhöhung der Inkubationszeit von 4 h auf 24 h der Anteil an adhärenten Zellen deutlich gesteigert werden. Entsprechend des Korrosionsverhaltens adhärieren auf den unmodifizierten Eisenschäumen die Zellen am schlechtesten. Darüber hinaus können sowohl SaOs-2 als auch hMSCs auf den CPP-beschichteten Fe nicht nur adhärieren, sondern auch proliferieren. Die eine wesentlich höhere Proliferationsrate aufweisenden SaOs-2 zeigen sowohl auf Fe-B als auch auf Fe-HA eine sehr gute Proliferation. Die langsamer proliferierenden Stammzellen dagegen zeigen ein etwas anderes Zellverhalten. Während auf Fe-B ebenfalls eine gute Proliferation zu beobachten ist, nimmt die Zellzahl auf Fe-HA zu Beginn der Inkubation zunächst ab. Mit der Zeit sinken Eisenfreisetzung und Calciumbindung, sodass ab Tag 14 auch hier eine Zunahme der Zellzahl zu beobachten ist. Die Perfusionskultur stellt ein Kultursystem dar, das den in vivo Bedingungen näher ist, als eine statische Kultivierung in Zellkulturwellplatten, sodass die Proliferation von SaOs-2 und hMSCs auf Fe-HA signifikant verbessert werden kann. Während für die unmodifzierten Fe bereits bei den SaOs-2 Zellen weder statisch noch dynamisch eine Zellzahlzunahme zu beobachten ist, kann für Fe-B+MgCPC die Proliferation durch die Perfusion verbessert werden. Für Fe-HA kann durch die Verwendung in vivo naher Zellkulturbedingungen die Proliferation beider Zelltypen entscheidend verbessert werden. Für die Fe-B zeigen die Zellen bereits in der statischen Kultur eine gute Proliferation, die durch die Perfusion nicht wesentlich gesteigert werden kann. Die Untersuchungen zum osteogenen Differenzierungsverhalten zeigen sowohl bei indirekter Inkubation in Fe-B und Fe-HA Extrakten als auch im direkten Materialkontakt auf den CPP-bioaktivierten Fe, dass die untersuchten hMSCs in der Lage sind osteogen zu differenzieren und mineralisieren. Die Genexpressionsergebnisse bestätigen die Beobachtungen der biochemischen Analyse. Im Fall der alkalischen Phosphatase (ALP) wird der Effekt bei den Fe-HA Extrakten sogar noch deutlicher. Sowohl im Basis- als auch im Differenzierungsmedium zeigen die Zellen eine erhöhte ALP-Genaktivität. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit kann auf den Fe-HA eine zeitigere Aktivierung der osteoblastären Differenzierung im Vergleich zur Plastikoberfläche beobachtet werden. Durch die Perfusionskultur ist aufgrund des Zusammenspiels von Stofftransport und Scherkräften eine gesteigerte Differenzierung der hMSCs auf den mit CPP beschichteten Fe zu beobachten – auf Fe-HA stärker als auf Fe-B. Durch die korrosionsbedingte Eisenfreisetzung reagieren die hMSCs mit erhöhter Genexpression des Eisenspeicherproteins Ferritin bei gleichzeitig sinkender Genexpression für den Transferrinrezeptor CD71. Reaktive Sauerstoffspezies und der damit verbundene oxidative Stress bewirken eine erhöhte Genexpression von Enzymen der oxidativen Stressabwehr. Es handelt sich dabei um die im Zytoplasma vorkommende Superoxiddismutase SOD1 und die in den Mitochondrien lokalisierte SOD2 als primäre Enzyme und um die Glutathion-Reduktase als sekundäres Enzym. Die Genregulierung von Katalase, Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Synthetase wird ebenfalls teilweise durch die Anwesenheit von Fe beeinflusst. Fazit Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Eisenschäume korrodieren in Abhängigkeit ihrer CPP-Modifizierung mit unterschiedlicher Intensität sowie Geschwindigkeit und beeinflussen so das Zellverhalten von hMSC und Osteoblasten. Die Eisenfreisetzung, die für die unmodifizierten Schäume am höchsten ist, wirkt sich negativ auf Adhäsion und Proliferation aus. Sowohl statisch als auch dynamisch ist eine Abnahme der Zellzahl zu beobachten. Ohne Modifikation sind die Eisenschäume daher für eine Anwendung als Knochenersatzmaterial in vivo eher ungeeignet. Im Gegensatz dazu stellen die mit Brushit und mit Hydroxylapatit beschichteten Fe-Schäume interessante Knochenersatzmaterialien dar. Es konnte gezeigt werden, dass sie aufgrund ihrer Calciumbindungs- bzw. -freisetzungskapazität die am Knochenaufbau beteiligten Zellen und deren Differenzierungsverhalten in Richtung Osteoblasten positiv beeinflussen können. Die mit mit MgCPC und mit Einpastenzement gefüllten Eisenschäume konnten nur ansatzweise untersucht werden. Eine endgültige Einschätzung zur Eignung für eine in vivo Anwendung ist daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Dennoch sind sie vor allem im lasttragenden Bereich aufgrund guter mechanischer Eigenschaften innovative Knochenersatzmaterialien.

Während Korrosionsbeständigkeit bisher ein wichtiges Kriterium bei der Materialentwicklung von metallischen Implantaten war, erlangen korrodierbare Metalle wie zumeist Magnesium aber auch Eisen zunehmend Bedeutung in der gegenwärtigen Forschung. Magnesium ist ein osteokonduktives Material und stimuliert die Knochenneubildung. Nachteil ist jedoch die geringe Korrosionsbeständigkeit, sodass Magnesium in der Regel in vivo schneller abgebaut wird, als neuer Knochen gebildet werden kann. Verglichen mit Magnesium ist die Korrosion von elementarem Eisen in vivo langsam und zeigt keine lokale oder systemische Zytotoxizität. Während die meisten Forschungsarbeiten Eisen als degradierbares Implantatmaterial mit dem Ziel der kardiovaskulären Anwendung untersuchen, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit Eisenschäumen, die u.a. zur Heilung überkritisch großer und belasteter Knochendefekte eingesetzt werden sollen. Die Herstellung der Eisenschäume (Fe) erfolgt durch Pulvermetallurgieprozesse an den Fraunhofer-Instituten IKTS und IFAM in Dresden. Polyurethanschäume werden mit einer Carbonyleisensuspension mit 3,8 % Fe3P beschichtet, getrocknet, erhitzt und anschließend der verbleibende Eisenschaum gesintert. Die Bioaktivierung der Eisenschäume mit verschiedenen Calciumphosphatphasen erfolgt durch die InnoTERE GmbH. Hierfür werden die Eisenschäume phosphatiert und mit Brushit (Fe-B) beschichtet. Durch anschließendes Kochen bei 95 – 100 °C in 0,1 M NaOH für 24 h kann eine Hydroxylapatitschicht (Fe-HA) erhalten werden. Eine weitere Methode der Bioaktivierung stellt die Befüllung mit Calciumphosphat-Zementen dar. Dabei handelt es sich um einen von InnoTERE entwickelten Ein-Pasten-Calciumphosphat-Zement (1P PCP) und um einen magnesiumhaltigen Calciumphosphat-Zement (MgCPC). Die Eisenschäume werden mittels physikalisch-chemischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden im Hinblick auf Degradierbarkeit und Biokompatibilität in vitro untersucht und charakterisiert. Wesentliche Ziele der vorliegenden Arbeit sind neben der Charakterisierung des Korrosionsverhaltens, vor allem die Analyse der Reaktionen knochentypischer Zellen auf Beschichtungen sowie Korrosionsprodukte der metallischen Grundstruktur. Für die zellbiologischen Untersuchungen dienen die Osteoblastenzelllinie SaOs-2 sowie humane mesenchymale Stammzellen (hMSC). Es konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit der Beschichtung bzw. Füllung mit verschiedenen Calciumphosphatphasen die Eisenfreisetzung und damit das Korrosionsverhalten von Eisenschäumen variiert werden kann. Die höchsten Korrosionsraten sind bei unmodifizierten Eisenschäumen zu beobachten. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit erfolgt eine verminderte Eisenfreisetzung. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. die Füllung mit Magnesium-Calciumphosphat Zement wird die Freisetzung von Korrosionsprodukten nahezu vollständig unterbunden. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. HA wird neben dem Korrosionsverhalten auch die Bioaktivität der Proben beeinflusst. Während die unmodifizierten Fe in beiden untersuchten Zellkulturmedien sowie Fe-B in McCoys keinen Einfluss auf den Calcium- und Phosphatgehalt haben, ist bei Fe-B in DMEM über den gesamten Untersuchungszeitraum eine konstante Calcium- und Phosphatfreisetzung zu beobachten. Die bioaktiven Fe-HA zeigen den umgekehrten Effekt und entziehen dem Medium Calcium und Phosphat – in DMEM Calcium stärker als in McCoys und in McCoys Phosphat stärker als in DMEM. Für das erfolgreiche Einwachsen von Implantaten bzw. die Heilung von Knochendefekten sollten Zellen, die am Knochenauf- und -umbau beteiligt sind, durch das Einbringen des Implantats nicht negativ beeinflusst werden. Ein Schlüsselereignis stellt dabei die Adhäsion dar. Die beste Adhäsion ist für die beide getestete Zelltypen auf Fe-B zu beobachten. Für Fe-HA werden die zweitbesten Adhäsionseffizienzen erzielt. Während für die Osteoblasten dabei das Zellkulturmedium keinen Einfluss hat, ist für die Stammzellen im Vergleich zu den SaOs-2 Zellen allerdings nur eine halb so gute Adhäsion zu beobachten. Die mit MgCPC bzw. mit 1P CPC gefüllten Schäume dagegen zeigen eine sehr schlechte Adhäsion sowohl von Osteoblasten als auch von Stammzellen. Für Fe-B+1MgCPC kann jedoch durch eine Erhöhung der Inkubationszeit von 4 h auf 24 h der Anteil an adhärenten Zellen deutlich gesteigert werden. Entsprechend des Korrosionsverhaltens adhärieren auf den unmodifizierten Eisenschäumen die Zellen am schlechtesten. Darüber hinaus können sowohl SaOs-2 als auch hMSCs auf den CPP-beschichteten Fe nicht nur adhärieren, sondern auch proliferieren. Die eine wesentlich höhere Proliferationsrate aufweisenden SaOs-2 zeigen sowohl auf Fe-B als auch auf Fe-HA eine sehr gute Proliferation. Die langsamer proliferierenden Stammzellen dagegen zeigen ein etwas anderes Zellverhalten. Während auf Fe-B ebenfalls eine gute Proliferation zu beobachten ist, nimmt die Zellzahl auf Fe-HA zu Beginn der Inkubation zunächst ab. Mit der Zeit sinken Eisenfreisetzung und Calciumbindung, sodass ab Tag 14 auch hier eine Zunahme der Zellzahl zu beobachten ist. Die Perfusionskultur stellt ein Kultursystem dar, das den in vivo Bedingungen näher ist, als eine statische Kultivierung in Zellkulturwellplatten, sodass die Proliferation von SaOs-2 und hMSCs auf Fe-HA signifikant verbessert werden kann. Während für die unmodifzierten Fe bereits bei den SaOs-2 Zellen weder statisch noch dynamisch eine Zellzahlzunahme zu beobachten ist, kann für Fe-B+MgCPC die Proliferation durch die Perfusion verbessert werden. Für Fe-HA kann durch die Verwendung in vivo naher Zellkulturbedingungen die Proliferation beider Zelltypen entscheidend verbessert werden. Für die Fe-B zeigen die Zellen bereits in der statischen Kultur eine gute Proliferation, die durch die Perfusion nicht wesentlich gesteigert werden kann. Die Untersuchungen zum osteogenen Differenzierungsverhalten zeigen sowohl bei indirekter Inkubation in Fe-B und Fe-HA Extrakten als auch im direkten Materialkontakt auf den CPP-bioaktivierten Fe, dass die untersuchten hMSCs in der Lage sind osteogen zu differenzieren und mineralisieren. Die Genexpressionsergebnisse bestätigen die Beobachtungen der biochemischen Analyse. Im Fall der alkalischen Phosphatase (ALP) wird der Effekt bei den Fe-HA Extrakten sogar noch deutlicher. Sowohl im Basis- als auch im Differenzierungsmedium zeigen die Zellen eine erhöhte ALP-Genaktivität. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit kann auf den Fe-HA eine zeitigere Aktivierung der osteoblastären Differenzierung im Vergleich zur Plastikoberfläche beobachtet werden. Durch die Perfusionskultur ist aufgrund des Zusammenspiels von Stofftransport und Scherkräften eine gesteigerte Differenzierung der hMSCs auf den mit CPP beschichteten Fe zu beobachten – auf Fe-HA stärker als auf Fe-B. Durch die korrosionsbedingte Eisenfreisetzung reagieren die hMSCs mit erhöhter Genexpression des Eisenspeicherproteins Ferritin bei gleichzeitig sinkender Genexpression für den Transferrinrezeptor CD71. Reaktive Sauerstoffspezies und der damit verbundene oxidative Stress bewirken eine erhöhte Genexpression von Enzymen der oxidativen Stressabwehr. Es handelt sich dabei um die im Zytoplasma vorkommende Superoxiddismutase SOD1 und die in den Mitochondrien lokalisierte SOD2 als primäre Enzyme und um die Glutathion-Reduktase als sekundäres Enzym. Die Genregulierung von Katalase, Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Synthetase wird ebenfalls teilweise durch die Anwesenheit von Fe beeinflusst. Fazit Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Eisenschäume korrodieren in Abhängigkeit ihrer CPP-Modifizierung mit unterschiedlicher Intensität sowie Geschwindigkeit und beeinflussen so das Zellverhalten von hMSC und Osteoblasten. Die Eisenfreisetzung, die für die unmodifizierten Schäume am höchsten ist, wirkt sich negativ auf Adhäsion und Proliferation aus. Sowohl statisch als auch dynamisch ist eine Abnahme der Zellzahl zu beobachten. Ohne Modifikation sind die Eisenschäume daher für eine Anwendung als Knochenersatzmaterial in vivo eher ungeeignet. Im Gegensatz dazu stellen die mit Brushit und mit Hydroxylapatit beschichteten Fe-Schäume interessante Knochenersatzmaterialien dar. Es konnte gezeigt werden, dass sie aufgrund ihrer Calciumbindungs- bzw. -freisetzungskapazität die am Knochenaufbau beteiligten Zellen und deren Differenzierungsverhalten in Richtung Osteoblasten positiv beeinflussen können. Die mit mit MgCPC und mit Einpastenzement gefüllten Eisenschäume konnten nur ansatzweise untersucht werden. Eine endgültige Einschätzung zur Eignung für eine in vivo Anwendung ist daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Dennoch sind sie vor allem im lasttragenden Bereich aufgrund guter mechanischer Eigenschaften innovative Knochenersatzmaterialien.

Bone formation and remodeling require continuous generation of osteoprogenitors from bone marrow stromal cells (MSC), which are regulated by local growth factors and hormones with putative roles in mesenchymal proliferation and differentiation. Hepatocyte growth factor (HGF) and its receptor c-Met are widely expressed in MSC and are thought to play a key role in the interactions between cells. 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25OHD) is the most active metabolite of vitamin D. 1,25OHD binds to its nuclear/membrane vitamin D receptor (VDR) and generates appropriate biological responses. The purpose of this study was to investigate the regulation of proliferation and differentiation by HGF in human bone marrow-derived stromal cells (hMSC). We examined the impact of HGF on hMSC cell-cycle regulation and the combination effects of HGF and 1,25OHD on hMSC osteogenic differentiation to enhance our knowledge of hMSC regulation. hMSC isolated from bone marrow were plated and grown in DMEM supplemented with 3% FBS incubated at 37C with 5% CO2 in air. HGF treatment of hMSCs reduced the rate of cell proliferation and this result was not due to apoptosis or cell senescence. Real-time RT-PCR and Western blot analysis showed increased gene and protein expression of the cell-cycle inhibitors p53, p21, and p27 after HGF treatment. These results appear to be specific because HGF did not significantly alter the gene expression level of other cell-cycle mediators such as RB, cyclin D1, CDK2, CDK4, or CDK6. Transfection of siRNA specific for cMet, the HGF receptor, eliminated the HGF anti-proliferation effect. cMet siRNA also eliminated the increase in p53, p21, and p27, further supporting a role for these cell-cycle inhibitors in HGF¡¯s regulation of hMSC. These results suggest that treatment of hMSC with HGF slows cell proliferation by increasing the expression of p53, p21, and p27. The reduced rate of cell proliferation did not appear to be due to cell differentiation, because treatment of hMSC with HGF alone did not induce cell differentiation. However, HGF in combination with a known osteogenic differentiation activator, 1,25OHD, significantly increased cell maturation/differentiation compared to 1,25D alone, as indicated by an increase in osteocalcin mRNA (a marker for osteogenic differentiation). Whereas HGF had no effect on 1,25OHD synthesis per se, HGF did induce 1,26OHD receptor (VDR) gene expression. HGF up-regulated the expression of the p63 gene, a member of the p53 family. Knocking down the p63 gene reduced the HGF effect on VDR expression and eliminated the HGF-induced up-regulation of the osteogenic differentiation markers osteopontin (OPN) and bone sialoprotein (BSP). Moreover, the ChIP assay shows that p63 was able to bind to the VDR promoter, possibly explaining the mechanism of p63-mediated VDR up-regulation. These results indicate that HGF can also induce hMSC osteogenic differentiation when combined with 1,25OHD by up-regulating 1,25OHD receptor VDR expression.

Distributed systems lie at the heart of many modern applications (social networks, web services, etc.). However, developers face many challenges in implementing distributed systems. The major one we focus on is avoiding the erroneous behaviors, that do not appear in the requirements of the distributed system, and that are caused by the concurrency between the entities of this system. The automatic code generation from requirements of distributed systems remains an old dream. In this thesis, we consider the automatic generation of a skeleton of code covering the interactions between the entities of a distributed system. This allows us to avoid the erroneous behaviors caused by the concurrency. Then, in a later step, this skeleton can be completed by adding and debugging the code that describes the local actions happening on each entity independently from its interactions with the other entities. The automatic generation that we consider is from a scenario-based specification that formally describes the interactions within informal requirements of a distributed system. We choose High-level Message Sequence Charts (HMSCs for short) as a scenario-based specification for the many advantages that they present: namely the clear graphical and textual representations, and the formal semantics. The code generation from HMSCs requires an intermediate step, called "Synthesis" which is their transformation into an abstract machine model that describes the local views of the interactions by each entity (A machine representing an entity defines sequences of messages sending and reception). Then, from the abstract machine model, the skeleton's code generation becomes an easy task. A very intuitive abstract machine model for the synthesis of HMSCs is the Communicating Finite State Machine (CFSMs). However, the synthesis from HMSCs into CFSMs may produce programs with more behaviors than described in the specifications in general. We thus restrict then our specifications to a sub-class of HMSCs named "local HMSC". We show that for any local HMSC, behaviors can be preserved by addition of communication controllers that intercept messages to add stamping information before resending them. We then propose a new technique that we named "localization" to transform an arbitrary HMSC specification into a local HMSC, hence allowing correct synthesis. We show that this transformation can be automated as a constraint optimization problem. The impact of modifications brought to the original specification can be minimized with respect to a cost function. Finally, we have implemented the synthesis and the localization approaches into an existing tool named SOFAT. We have, in addition, implemented to SOFAT the automatic code generation of a Promela code and a JAVA code for REST based web services from HMSCs.

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