Lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid with a plethora of biological functions, including roles in cell survival, proliferation, and migration. Although high-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC ESI-MS/MS) technology has been used to measure the levels of LPA in human blood, serum and plasma, current methods cannot readily detect the minute levels of LPA from cell culture. In this study, a novel HPLC ESI-MS/MS method with enhanced sensitivity was developed which allows accurate measurements of LPA levels with a limit of quantitation at approximately 10 femtomoles. The method was validated by quantitation of LPA levels in the media of previously characterized cell lines ectopically expressing autotaxin. Autotaxin overexpression induced an increase in several subspecies of LPA while others remained unchanged. Lastly, this HPLC ESI-MS/MS method was validated via biological assays previously utilized to assay LPA production. Hence, this new HPLC ESI-MS/MS will allow researchers to measure in vitro LPA levels and also distinguish between specific LPA subspecies for the delineation of individual biological mechanisms.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les phytochélatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure générale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, où n = 2 à 11. Leur synthèse est induite par un grand nombre de végétaux en réponse à une élévation de la concentration du milieu en métaux, en particulier le cadmium (ci-après, Cd). Le but de cette étude a été de développer un outil pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une méthode analytique a été réalisée afin de déterminer les phytochélatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste à utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". L’ionisation des molécules est celle faite par électronébulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). L’objectif principal de ce mémoire est la validation de cette méthode : la détermination des courbes de calibration et des limites de détection et l'identification d'interférences potentielles. L’utilisation de dithiothreitol (DTT) à une concentration de 25 mM a été nécessaire à la conservation de la forme réduite des phytochélatines. En effet, suite à la validation de la méthode d’analyse des phytochélatines il a été démontré qu’elle représente un potentiel d’application. Ceci dans la mesure où l’induction des phytochélatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a été possible à deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, après plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, l’étude de la stabilité des phytochélatines a été réalisée et toutes les températures examinées ont démontré une diminution des phytochélatines analysées par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dégradation des phytochélatines soit physique ou chimique plutôt que bactérienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution d’extraction serait nécessaire à la mise au point de la dite méthode analytique afin de quantifier les phytochélatines dans l’algue C. reinhardtii. / Phytochelatins (PC) are polypeptides having the general structure, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, where n = 2 to 11. Many plants respond to an elevated concentration of metals in environment, particularly Cd, by synthesizing PC. The purpose of this study was to develop a tool to assess the bioavailability of the Cd in fresh water by determining phytochelatins in algae, C. reinhardtii, by online HPLC-ESI-MS/MS. The gold of this work was the validation of the analytical method i.e. the determination of the calibration curves and the limits of detection. The addition of dithiothreitol (DTT), 25 mM, was found to be necessary to maintain the PC in their reduced form for analysis. It was shown that the liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) technique has excellent potential for PC analysis, however, it will still requires some more work with respect to sample purification. Furthermore, the stability of the PC was evaluated for different sample storage temperatures. At all temperatures studied, some degradation of PC was observed possibly due to physical rather than chemical or bacterial reasons. Finally, the induction of phytochelatins (PC2, PC3 and PC4) was observed in C. reinhardtii for two Cd concentrations (10-7 M and 10-6 M) and for several induction times (1, 2, 4, and 6 h).

Les phytochélatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure générale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, où n = 2 à 11. Leur synthèse est induite par un grand nombre de végétaux en réponse à une élévation de la concentration du milieu en métaux, en particulier le cadmium (ci-après, Cd). Le but de cette étude a été de développer un outil pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une méthode analytique a été réalisée afin de déterminer les phytochélatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste à utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". L’ionisation des molécules est celle faite par électronébulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). L’objectif principal de ce mémoire est la validation de cette méthode : la détermination des courbes de calibration et des limites de détection et l'identification d'interférences potentielles. L’utilisation de dithiothreitol (DTT) à une concentration de 25 mM a été nécessaire à la conservation de la forme réduite des phytochélatines. En effet, suite à la validation de la méthode d’analyse des phytochélatines il a été démontré qu’elle représente un potentiel d’application. Ceci dans la mesure où l’induction des phytochélatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a été possible à deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, après plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, l’étude de la stabilité des phytochélatines a été réalisée et toutes les températures examinées ont démontré une diminution des phytochélatines analysées par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dégradation des phytochélatines soit physique ou chimique plutôt que bactérienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution d’extraction serait nécessaire à la mise au point de la dite méthode analytique afin de quantifier les phytochélatines dans l’algue C. reinhardtii. / Phytochelatins (PC) are polypeptides having the general structure, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, where n = 2 to 11. Many plants respond to an elevated concentration of metals in environment, particularly Cd, by synthesizing PC. The purpose of this study was to develop a tool to assess the bioavailability of the Cd in fresh water by determining phytochelatins in algae, C. reinhardtii, by online HPLC-ESI-MS/MS. The gold of this work was the validation of the analytical method i.e. the determination of the calibration curves and the limits of detection. The addition of dithiothreitol (DTT), 25 mM, was found to be necessary to maintain the PC in their reduced form for analysis. It was shown that the liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) technique has excellent potential for PC analysis, however, it will still requires some more work with respect to sample purification. Furthermore, the stability of the PC was evaluated for different sample storage temperatures. At all temperatures studied, some degradation of PC was observed possibly due to physical rather than chemical or bacterial reasons. Finally, the induction of phytochelatins (PC2, PC3 and PC4) was observed in C. reinhardtii for two Cd concentrations (10-7 M and 10-6 M) and for several induction times (1, 2, 4, and 6 h).