Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RibeiroJunior_EuripedesdeAlmeida_D.pdf: 1397794 bytes, checksum: 40e2446309eeecd5262d86e0aff53c7c (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A mioglobina é uma hemeproteína que tem a função de transportar e armazenar o oxigênio. Suas estruturas primária e secundária são compostas por 153 aminoácidos e oito a-hélices (nomeadas de A-H), respectivamente. Esta proteína tem sido usada como um bom modelo para estudos de estrutura, função, ligação de heme, estabilidade e enovelamento de proteínas. Em condições ligeiramente ácidas (pH em torno de 4), a apomioglobina se desenovela passando por uma forma intermediária que possui propriedades físicas entre o estado nativo (pH 7) e o estado desenovelado (pH 2). Este intermediário apresenta as hélices A, G e H protegidas como demonstrado por experimentos de troca de deutério. No presente trabalho, foram realizados estudos com mutantes de deleção e de permutações circulares de hélices da mioglobina com a finalidade de aumentar o conhecimento sobre como a estrutura terciária de uma proteína é construída. Três classes de mutantes foram criadas: 1) deleção de hélices: 1.1) um mutante de deleção da hélice H (Mb1-123) e 1.2) um mutante de deleção das hélices G e H (Mb1-99); 2) permutações circulares: 2.1) um mutante de permutação da hélice A da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb-B_GHA) e 2.2) um mutante de permutação das hélices A e B da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb- C_GHAB) e 3) permutação com deleção: um mutante de deleção da hélice G com permutação da hélice H da extremidade C-terminal para N-terminal (Mb-HAB_F). As proteínas mutantes foram purificadas diretamente na forma apo, embora estes mutantes possuam capacidade de se ligar ao grupo heme, com exceção do mutante Mb1-123. Estes mutantes possuem valores mais baixos de elipticidade molar e tendência maior à agregação do que a proteína selvagem. Quando na forma holo, os dois mutantes circularmente permutados são compactos e têm estrutura e função semelhantes à holoMbWT. Este resultado difere do resultado observado para as variantes de deleção (Mb1-99 e Mb-HAB_F) que não apresentaram restabelecimento da estrutura e nem supressão da tendência à agregação. Nossos resultados indicam que, embora a mioglobina possua um núcleo de ligação do grupo heme, as hélices A, B, G e H são necessárias para a correta arquitetura da proteína. Apesar da menor estabilidade dos mutantes de permutação circulares em relação à proteína selvagem, as extremidades N- e Cterminais da mioglobina são necessárias para que a proteína alcance uma estrutura estável e funcional semelhante à selvagem. As permuteínas estruturaram a forma intermediária mesmo em pH ao redor de 7, mostrando novamente que as extremidades N- e C- terminais de mioglobina são necessárias para que elas se estruturem como a selvagem. Acreditamos que um núcleo, que se mostrou insensível ao novelamento em meio ácido, foi formado nestes mutantes. Como estes mutantes diferem quanto à posição da hélice B, eles permitiram inferir sobre a participação da hélice B no intermediário de ApoMbWT. Duas formas de intermediários estão provavelmente presentes na via de enovelamento da mioglobina e suas maiores diferenças parecem estar na quantidade de estrutura formada pela hélice B. Nossos resultados estão de acordo com o modelo seqüencial de enovelamento para mioglobina, no qual a hélice B é incorporada após a formação do domínio AGH / Abstract: Myoglobin functions as a protein for transporting and storing oxygen and is a soluble, globular heme-binding protein, comprising 153 amino acids arranged in eight helical segments (named A to H). This protein has been used as a good model to study structure, function, heme binding, stability, and folding pathway. Under mild acid conditions (pH 4), apomyoglobin unfolds through an intermediate form with physical properties intermediate between the native (neutral pH) and the unfolded (pH 2.0) states. This intermediate has helices A, G and H protected from hydrogen exchange. Here we present studies of deleted and circularly permuted mutations of helical blocks of myoglobin to add to our understanding of how protein topology is built. Three classes of mutants were constructed: 1) helix deletion: 1.1) a mutant deleted of H helix, Mb1-123, and 1.2) a mutant deleted of G and H helices, Mb1-99; 2) circularly permutation: 2.1) Mb-B_GHA where B-helix is N-terminal and A helix is C-terminal, and 2.2) Mb-C_GHAB where C-helix is N-terminal and B helix is Cterminal; 3) permutation/deletion: a deleted circularly permutation where H-helix is N-terminal, the G helix is deleted, and the F helix is C-terminal, Mb-HAB_F. The mutants were purified in the apo form, where although they have the ability to bind heme with an exception to Mb1-123, they have lower ellipticity and a larger tend ency to aggregate than the wild-type. When in the holo form, the two circularly permuted mutants are compact and have native-like function and conformation, different form the myoglobin variants of deletion (i.e. Mb1-99 and Mb- HAB_F), where the heme binding does not seem to be native-like and do not suppresses their tendency to aggregate. Our results indicate that although myoglobin has a core that is able to bind heme, the A, G, H and B helices are needed for the correct structural architecture of the protein. And, since the circularly permutations are less stable than the wild-type, the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. The apopermuteins resembled the intermediate form even at physiological pH, showing again that the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. We believe that a nucleus, mostly independent of acid unfolding, was formed by these mutants and, since these permutants differ in the position of the B helix, they gave insights about the participation of the B helix in the intermediate. Two forms of intermediates are likely to be present in the folding pathway of apomyoglobin and their major difference seems to be in the amount of structure in the B helix. Our results agreed with a model of sequencial folding for apomyoglobin where the B helix is added later in the AGH nucleus / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

No presente trabalho, realizado com hemoproteínas na forma de pó, o efeito da hidratação foi observado através de espectroscopia fotoacústica. Amostras de carboxi-hemoglobina e carboxi-mioglobina mantidas em diferentes ambientes de umidade relativa (UR), mostraram variações em seus espectros na região da banda de Soret. Para amostras mantidas em baixa hidratação característico do derivado carboxi, em alta hidratação (acima de aproximadamente 90% UR) o espectro era característico do derivado carboxi e na região intermediária o espectro era de uma mistura dos dois derivados. Essa mudança de ligante observada em alta hidratação pode ser explicada supondo que a proteína tem flexibilidade e atinge um estado conformacional que possibilita a entrada e saída do ligante. Em baixa hidratação a estrutura da proteína é rígida e tal que o acesso ao grupo heme está fechado, impossibilitando a troca do ligante. Essa explicação é coerente com vários resultados experimentais que indicam a existência de duas estruturas para essas hemoproteínas em solução / At the present work accomplished with powder of hemoproteins, the hydration effect was observed through photoacoustic spectroscopy. Samples of caroxyhemoglobin and carboxymyglobin kept at different relative humidity (RH) environments, showed variations in their spectra in the Soret bad region. For the samples which were kept at low hydration (Bellow about 33% RH) the spectrum was characteristic of carboxy derivative, whereas at high hydration (above about 93% RH) the spectrum was characteristic of oxy derivative, and in the the intermediate region the spectrum was a mixture of both derivatives. This ligand change observed at high hydration, may be explained assuming that the protein has flexibility, and reach a conformational state which enables the ligand to GO in and out. At low hydrations the protein structure is rigid and such that the access to the heme group is closed becoming impossible the ligand change. This explanation agrees with several experimental results that point to the existence of two structures to these hemoproteins in solution

No presente trabalho, realizado com hemoproteínas na forma de pó, o efeito da hidratação foi observado através de espectroscopia fotoacústica. Amostras de carboxi-hemoglobina e carboxi-mioglobina mantidas em diferentes ambientes de umidade relativa (UR), mostraram variações em seus espectros na região da banda de Soret. Para amostras mantidas em baixa hidratação característico do derivado carboxi, em alta hidratação (acima de aproximadamente 90% UR) o espectro era característico do derivado carboxi e na região intermediária o espectro era de uma mistura dos dois derivados. Essa mudança de ligante observada em alta hidratação pode ser explicada supondo que a proteína tem flexibilidade e atinge um estado conformacional que possibilita a entrada e saída do ligante. Em baixa hidratação a estrutura da proteína é rígida e tal que o acesso ao grupo heme está fechado, impossibilitando a troca do ligante. Essa explicação é coerente com vários resultados experimentais que indicam a existência de duas estruturas para essas hemoproteínas em solução / At the present work accomplished with powder of hemoproteins, the hydration effect was observed through photoacoustic spectroscopy. Samples of caroxyhemoglobin and carboxymyglobin kept at different relative humidity (RH) environments, showed variations in their spectra in the Soret bad region. For the samples which were kept at low hydration (Bellow about 33% RH) the spectrum was characteristic of carboxy derivative, whereas at high hydration (above about 93% RH) the spectrum was characteristic of oxy derivative, and in the the intermediate region the spectrum was a mixture of both derivatives. This ligand change observed at high hydration, may be explained assuming that the protein has flexibility, and reach a conformational state which enables the ligand to GO in and out. At low hydrations the protein structure is rigid and such that the access to the heme group is closed becoming impossible the ligand change. This explanation agrees with several experimental results that point to the existence of two structures to these hemoproteins in solution

Neste trabalho são apresentados estudos em três diferentes sistemas utilizando-se as técnicas de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) e absorção eletrônica. No primeiro estudou-se a formação dos possíveis complexos entre o aminoácido aliina, extraído do alho, e o íon cobre (II). Os dados de RPE e absorção eletronica no visível (400-1100 nm) foram utilizados para caracterizar os diferentes complexos obtidos. No segundo utilizou-se o monocristal do complexo dicloro bis (benzil difenil fosfinóxido) Cobre (II) e efetuaram-se medidas de RPE variando-se a direção de aplicação do campo magnético no monocristal. Os auto-valores encontrados para as componentes do tensor g&#175 foram: g1= 2,0891; g2= 2,4554 e g3= 2,0767. Com base nos dados de RPE e cristalográficos e usando a teoria de campo cristalino foi proposto dxy como estado fundamental para o íon cobre (II) neste complexo. Fez-se também um estudo preliminar observando-se as variações no centro ativo de hemoproteínas moduladas pelo grau de hidratação. Metahemoglobina bovina e metamioglobina eqüina liofilizadas foram usadas e o sinal de RPE do íon ferro (III) monitorado. Dos espectros de RPE das duas proteínas são observadas pelo menos duas simetrias para o íon ferro (III), uma axial caracterizada por um valor de g próximo de 6 e outra caracterizada por g= 4,3 correspondendo a simetria rômbica. A intensidade dos sinais mostrou-se muito sensíveis ao grau de hidratação. Metahemoglobina e metamioglobina apresentaram comportamentos distintos dos sinais de RPE e sugeriu-se serem eles devido as diferenças estruturais entre as duas proteínas / In this work studies in three different systems using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and eletronic absorption techniques are presented. The formation of possible complexes between the amino acid aliin, extracted of garlic, and the copper (II) íon was studied in the first work. EPR and visible eletronic absorption (400-1100 nm) data were utilized to characterize the different complexes obtained. In the second work a crystal of the complex dichloro bis (benzyl diphenyl phosphinoxide) copper (II) was used and the EPR measures were made for different directions of application of the magnetic field in the crystal. The eigenvalues obtained for the g&#175 tensor components were: g1= 2,0891; g2= 2,4554 and g3= 2,0767. Using EPR and crystallographic data and crystal field theory dxy was proposed as the ground state of the copper (II) íon in this complex. A preliminary study was also made observing changes at the active Center of the hemeproteins modulated by the hydration degree. Lyophilized bovine methemoglobin ande quine metmyoglobin were used and the EPR signal of the iron (III) íon monitored. Or both proteins the EPR spectra corresponding to at least two iron symmetries were observed, one axial characterized by a g value near 6.0 and another characterized by g= 4,3 corresponding to rhombic symmetry. The intensity of these signals were very sensitive to the hydration degree. Metmyoglobin and methemoglobin showed distint behaviors of the EPR signals and it was suggested that they were due to structural differences between the two proteins

Neste trabalho são apresentados estudos em três diferentes sistemas utilizando-se as técnicas de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) e absorção eletrônica. No primeiro estudou-se a formação dos possíveis complexos entre o aminoácido aliina, extraído do alho, e o íon cobre (II). Os dados de RPE e absorção eletronica no visível (400-1100 nm) foram utilizados para caracterizar os diferentes complexos obtidos. No segundo utilizou-se o monocristal do complexo dicloro bis (benzil difenil fosfinóxido) Cobre (II) e efetuaram-se medidas de RPE variando-se a direção de aplicação do campo magnético no monocristal. Os auto-valores encontrados para as componentes do tensor g&#175 foram: g1= 2,0891; g2= 2,4554 e g3= 2,0767. Com base nos dados de RPE e cristalográficos e usando a teoria de campo cristalino foi proposto dxy como estado fundamental para o íon cobre (II) neste complexo. Fez-se também um estudo preliminar observando-se as variações no centro ativo de hemoproteínas moduladas pelo grau de hidratação. Metahemoglobina bovina e metamioglobina eqüina liofilizadas foram usadas e o sinal de RPE do íon ferro (III) monitorado. Dos espectros de RPE das duas proteínas são observadas pelo menos duas simetrias para o íon ferro (III), uma axial caracterizada por um valor de g próximo de 6 e outra caracterizada por g= 4,3 correspondendo a simetria rômbica. A intensidade dos sinais mostrou-se muito sensíveis ao grau de hidratação. Metahemoglobina e metamioglobina apresentaram comportamentos distintos dos sinais de RPE e sugeriu-se serem eles devido as diferenças estruturais entre as duas proteínas / In this work studies in three different systems using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and eletronic absorption techniques are presented. The formation of possible complexes between the amino acid aliin, extracted of garlic, and the copper (II) íon was studied in the first work. EPR and visible eletronic absorption (400-1100 nm) data were utilized to characterize the different complexes obtained. In the second work a crystal of the complex dichloro bis (benzyl diphenyl phosphinoxide) copper (II) was used and the EPR measures were made for different directions of application of the magnetic field in the crystal. The eigenvalues obtained for the g&#175 tensor components were: g1= 2,0891; g2= 2,4554 and g3= 2,0767. Using EPR and crystallographic data and crystal field theory dxy was proposed as the ground state of the copper (II) íon in this complex. A preliminary study was also made observing changes at the active Center of the hemeproteins modulated by the hydration degree. Lyophilized bovine methemoglobin ande quine metmyoglobin were used and the EPR signal of the iron (III) íon monitored. Or both proteins the EPR spectra corresponding to at least two iron symmetries were observed, one axial characterized by a g value near 6.0 and another characterized by g= 4,3 corresponding to rhombic symmetry. The intensity of these signals were very sensitive to the hydration degree. Metmyoglobin and methemoglobin showed distint behaviors of the EPR signals and it was suggested that they were due to structural differences between the two proteins