Orientador: Maria Inês M. C. Pardini / Banca: Giovanni Faria Silva / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello / Resumo: A identificação dos diferentes genótipos e subtipos do VHC tem sido útil para o entendimento da evolução da doença e da epidemiologia do vírus em relação a fatores de risco. Atualmente, os métodos de genotipagem assim como a região do genoma viral a ser utilizada constituem temas de discussão. O presente trabalho teve por objetivo comparar a metodologia de hibridização reversa (kit comercial INNO-LiPAÒ v1.0) ao seqüenciamento direto das regiões 5'UTR, NS5B e core do genoma do VHC. Foram utilizadas 92 amostras de plasma de pacientes do Ambulatório de Hepatites da Disciplina de Gastroenterologia Clínica da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP). Dentre as 92 amostras constituintes deste trabalho, 64 foram selecionadas aleatoriamente e 28 foram escolhidas segundo a genotipagem prévia realizada com o kit INNO-LiPAÒ v.1.0. Dentre estas 28 amostras escolhidas, 10 foram genotipadas como 1a/1b, 2 como 2, 2 como 5, 7 apenas como 1 e 7 foram inconclusivas para a genotipagem com o kit comercial. A genotipagem por seqüenciamento direto foi efetuada seguindo as etapas de: extração do RNA viral, transcrição reversa, amplificação das regiões 5'UTR, NS5B e 5'UTR-core por Nested-PCR, reação de marcação fluorescente e eletroforese em aparelho automático ABI 377 (Applied Biosystems). Todas as amostras puderam ser amplificadas para a região 5'UTR e 62 para NS5B. Para as 30 amostras que não puderam ser amplificadas para NS5B foi realizada a amplificação da região 5'UTR-core que se mostrou eficiente na amplificação de 28 (93%) das amostras. A análise de seqüência permitiu uma maior precisão na classificação viral. O seqüenciamento direto foi eficaz na solução de 100% dos resultados inconclusivos pela metodologia de hibridização reversa. Assim como já reportado na literatura o kit comercial INNO-LiPAÒ v.1.0 produziu resultados errôneos com... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The HCV genotypes and subtypes identification has been useful to understand the disease evolution and viral epidemiological regarding risk factors. Recently, the genotyping methods and viral genomic region used in viral typing have been very discussed in scientific community. The goal of this study was to compare the reverse hybridization methodology and sequencing of the HCV genomic regions 5'UTR, NS5B and core. Ninety-two plasma sample with viral RNA detected from patients assisted in the Department of Internal Medicine - Gastroenterology Division, Botucatu Medical School, University of São Paulo State - UNESP were used in this study. From these 92 samples, 64 were randomly selected and 28 choose according genotyping result by reverse hybridization. The genotyping by reverse hybridization were performed with INNO-LiPAÒ v.1.0, according manufacturer's instructions. To genotyping by sequencing viral RNA isolated from plasma samples was used as a source for RT-PCR amplification and automatic sequencing in ABI 377 sequencer (Applied Biosystems). All samples were amplified to 5'UTR genomic region and 62 to NS5B. From 30 samples that showed insucess in NS5B amplification, 28 (93%) were amplified to 5'UTR-core region with efficiency. The genotyping by sequencing allowed more precision in viral classification. The sequencing showed efficient in the resolution of the 100% of cases inconclusive by reverse hybridization. The genotyping by INNOLiPA Ò v.1.0 showed wrong results in relation of viral subtyping, corroborating previous results of the scientific literature. The sequencing also demonstrated at least a change of viral genotype when compared with INNO-LiPAÒ v.1.0, result that could influence the therapeutic decision, turning questionable the INNO-LiPAÒ v.1.0 efficiency to determine the viral genotypes, too. / Mestre

Orientador: Giovanni Faria Silva / Banca: Cássio Vieira de Oliveira / Banca: Neiva Sellan Lopes Gonçales / Resumo: A Organização Mundial de Saúde (OMS) define como idoso todo indivíduo com mais de 60 anos de idade. Atualmente no Brasil os idosos são aproximadamente 15 milhões de pessoas e apesar de viverem mais, apresentam maiores condições crônicas devido ao declínio da maioria das funções orgânicas, inclusive do sistema imunológico, aumentando a susceptibilidade e a maior incidência de doenças infecciosas. As hepatites virais tem distribuição mundial e são doenças infecciosas que apresentam características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais distintas. Há uma estimativa de que 350 milhões de pessoas sejam portadores crônicos do vírus da hepatite B (VHB) ao redor do mundo e, embora menos prevalente que a hepatite B, o vírus da hepatite C (VHC) é a causa mais comum de hepatite crônica com cerca de 180 milhões de indivíduos infectados. Embora os conhecimentos a respeito da patogênese, curso e tratamento das hepatites virais crônicas tenham avançado nos últimos anos, há ainda pouco conhecimento sobre seu curso e tratamento na população idosa, especialmente no Brasil, justificando a relevância deste estudo, cujo objetivo geral é avaliar a prevalência de hepatites virais crônicas B e C na população idosa residente no município de Botucatu-SP. Foi realizado com 1029 idosos cadastrados na UNIMED, nas Unidades Básicas de Saúde, Unidades de Saúde da Família, participantes de Centros de Convivência de Terceira Idade e residentes em instituições de longa permanência. Os voluntários, após assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), foram submetidas a testes sorológicos para detecção do Anti-HBs, AgHbs e Anti HBc IgG, onde foram coletados 5ml de sangue através de punção venosa com seringa e agulha descartáveis. Para detecção do anti-VHC foram realizados testes sorológicos digitais (HCV Rapid Test Bioeasy®). A mediana de idade encontrada foi de 71 anos (65:78). A prevalência de ... / Abstract: The World Health Organization (WHO) defines as elderly any person aged over 60 years old. Currently in Brazil the elderly are approximately 15 million people and although they live longer have more chronic conditions due to decline in most physiological functions, including immune system, increasing susceptibility and a higher incidence of infectious diseases. Viral hepatitis has a worldwide distribution and are infectious diseases that present epidemiological, clinical and laboratory differences. It is estimated that 350 million people are chronic carriers of hepatitis B virus (HBV) worldwide and, although less prevalent than hepatitis B, hepatitis C virus (HCV) is the most common cause of chronic hepatitis with about 180 million infected individuals. While the knowledge about the pathogenesis, course and treatment of chronic viral hepatitis have advanced in recent years, there is still little knowledge about their course and treatment in the elderly population, especially in Brazil, justifying the relevance of this study, whose general objective is to evaluate the prevalence of chronic viral hepatitis B and C in the elderly population living in Botucatu-SP. Was held with 1029 elderly enrolled in Basic Health Units, the Family Health Units, participants of Social Centers for Seniors and residents of long-term institutions. The volunteers, after having signed an informed consent (IC), were submitted for serological tests for the detection of anti-HBs, HBsAg and Anti HBc IgG, where 5 ml of blood were collected by venipuncture with syringe and disposable needle. For detection of anti-HCV digital serological tests were done (HCV Rapid Test Bioeasy®). Mean age was 72.01 years (± 8.19 years). The prevalence of HBsAg positive with elderly was 0,58% and of these, all showed results for HBeAg negative characterizing inactive chronic disease. For the Anti-HCV, prevalence was 1,94%, data in agreement with ... / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Nelson José Freitas da Silveira / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Osmar Gaspar / Resumo: A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / Abstract: The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus / Doutor