Os cDNAs dos genes codificadores das hexamerinas HEX 70a, HEX 70c e HEX 110 de Apis mellifera foram sintetizados a partir de RNA total, clonados e suas regiões codificadoras foram totalmente seqüenciadas. As análises in silico dos produtos de tradução mostraram que as respectivas subunidades protéicas contêm os domínios conservados N, M e C, típicos de hemocianinas, e que em HEX 110, mas não nas outras subunidades, o domínio C foi interrompido pela inserção de uma seqüência repetitiva de aminoácidos. Análises de similaridade indicaram que os genes codificadores de hexamerinas derivaram de eventos de duplicação e diversificação a partir de um gene ancestral, resultando em múltiplos parálogos. Nossas análises também evidenciaram que HEX 110 é uma proteína rica em glutamina/ácido glutâmico e que HEX 70a e HEX 70c são compostas por mais de 15% de aminoácidos aromáticos e, portanto, integram a classe das arilforinas. A expressão temporal destes genes, e também do gene codificador de outra hexamerina de A. mellifera, hex 70b, previamente caracterizado, foi analisada qualitativa e quantitativamente durante o desenvolvimento de operárias, rainhas e zangões. Concomitantemente, a abundância dos respectivos polipeptídeos no corpo gorduroso ou hemolinfa foi examinada por SDS-PAGE ou Western Blot. Os quatro genes de hexamerinas se expressam no corpo gorduroso de operárias, rainhas e zangões principalmente durante o estágio larval. A modulação da expressão destes genes mostra semelhanças durante a transição larval-pupal de operárias, rainhas e zangões, com altos níveis de transcritos no último estágio larval e baixos níveis no início da fase pupal. No entanto, a quantidade relativa de transcritos de hex 70a, hex 70b e hex 110 na fase de alimentação do último estágio larval (L5F) é significantemente menor nas rainhas que nas operárias, o que sugere participação das respectivas proteínas no processo de diferenciação de castas. Durante o estágio larval, as quatro diferentes subunidades de hexamerinas são armazenadas na hemolinfa onde, aparentemente, cumprem a função de proteínas de estocagem e, portanto, constituem fonte de aminoácidos para utilização em processos inerentes ao desenvolvimento pupal. No entanto, a expressão de hex 70a se estende até ao estágio adulto de operárias, rainhas e zangões, e neste estágio, as fêmeas e os zangões exibem perfis distintos de expressão. No corpo gorduroso de operárias, mas não no de rainhas e zangões, a expressão de hex 110 também ocorre durante o estágio adulto. A expressão de hex 70a e hex 110 no corpo gorduroso mostrou-se limitada pela disponibilidade de nutrientes: operárias alimentadas com uma dieta protéica apresentaram níveis significantemente maiores de ambos transcritos que aquelas que receberam dieta desprovida de proteínas, assim evidenciando que os processos de transcrição e tradução são nutricionalmente regulados. Além disto, os níveis de transcritos de hex 70a e hex 110 aumentam no corpo gorduroso de abelhas operárias portadoras de ovários ativos, sugerindo que estes genes têm função associada à reprodução. Em A. mellifera, o corpo gorduroso não é o único sítio de expressão dos genes de hexamerinas. Transcritos de hex 70a, hex 70b e hex 110 foram detectados também nas gônadas em desenvolvimento de operárias, rainhas e zangões, sugerindo uma função na diferenciação dos ovários e maturação dos testículos. Nossos resultados indicam que as hexamerinas codificadas por estes genes têm funções alternativas no ciclo de vida de abelhas A. mellifera, além de servir como fonte de aminoácidos para a metamorfose. / The cDNAs encoding the hexamerins HEX 70a, HEX 70c and HEX 110 of Apis mellifera were synthesized from total RNA isolated, cloned and their coding region were completely sequenced. In silico analyses of the translation products showed that the respective protein subunits contain the conserved domains N, M and C, typical of hemocyanins, and that in HEX 110, but not in the other subunits, the C domain is interrupted by a repetitive amino acid sequence. Analyses of similarity suggested that in the honey bee, the four hexamerin genes derived by duplication events and diversification from an ancestral gene, resulting in multiple paralogs. Our analyses also showed that HEX 110 is rich in glutamine/glutamic acid and that HEX 70a and HEX 70c are composed by more than 15% of aromatic amino acids and, therefore, integrate the arylphorin class of hexamerins. The temporal expression of these genes, and also of the gene encoding a previously characterized hexamerin of A. mellifera, hex 70b, was analyzed qualitatively and quantitatively during the development of worker bees, queens and drones. Concomitantly, the abundance of the respective polypeptides in the fat body or hemolymph was examined by SDS-PAGE or Western Blot. The four hexamerin genes are expressed in the fat body mainly during larval stage. The modulation of the expression of these genes shows similarities during the larval-pupal transition of worker bees, queens and drones, with high levels of transcripts in the last larval instar and low levels in newly ecdysed pupae. However, the relative quantity of transcripts of hex 70a, hex 70b and hex 110 in the feeding phase of the last larval instar (L5F) is significantly lower in queens than in worker bees, suggesting the participation of the respective proteins in the process of caste differentiation. During the larval stage, the four different hexamerin subunits are stored in the hemolymph where, seemingly, they perform the function of storage proteins and hence, constitute source of amino acids for pupal development. Nevertheless, the expression of hex 70a is extended until the adult stage of worker bees, queens and drones and, in this stage, the female bees and the drones show distinct expression profiles. In the fat body of worker bees, but not in queens and drones, the expression of hex 110 also occurs during the adult stage. The expression of hex 70a and hex 110 in the adult fat body was proven to be limited by the availability of nutrients: worker bees fed with a protein diet showed significantly higher levels of both transcripts than the ones that received a diet which was poor in protein, thus evidencing that the transcription and translation processes are nutritionally-regulated. Additionally, the transcripts level of hex 70a and of hex 110 increase in the fat body of worker bees with active ovaries, suggesting that these genes have function associated with reproduction. In A. mellifera, the fat body is not the only site of expression of hexamerins genes. Transcripts of hex 70a, hex 70b and hex 110 were detected also in developing gonads of worker bees, queens and drones, suggesting that they have a function in ovary differentiation and testis maturation. Our results indicated that the hexamerins encoded by these genes have alternate functions in the life cycle of A. mellifera honey bees, besides serving as a source of amino acids to metamorphosis.

Os cDNAs dos genes codificadores das hexamerinas HEX 70a, HEX 70c e HEX 110 de Apis mellifera foram sintetizados a partir de RNA total, clonados e suas regiões codificadoras foram totalmente seqüenciadas. As análises in silico dos produtos de tradução mostraram que as respectivas subunidades protéicas contêm os domínios conservados N, M e C, típicos de hemocianinas, e que em HEX 110, mas não nas outras subunidades, o domínio C foi interrompido pela inserção de uma seqüência repetitiva de aminoácidos. Análises de similaridade indicaram que os genes codificadores de hexamerinas derivaram de eventos de duplicação e diversificação a partir de um gene ancestral, resultando em múltiplos parálogos. Nossas análises também evidenciaram que HEX 110 é uma proteína rica em glutamina/ácido glutâmico e que HEX 70a e HEX 70c são compostas por mais de 15% de aminoácidos aromáticos e, portanto, integram a classe das arilforinas. A expressão temporal destes genes, e também do gene codificador de outra hexamerina de A. mellifera, hex 70b, previamente caracterizado, foi analisada qualitativa e quantitativamente durante o desenvolvimento de operárias, rainhas e zangões. Concomitantemente, a abundância dos respectivos polipeptídeos no corpo gorduroso ou hemolinfa foi examinada por SDS-PAGE ou Western Blot. Os quatro genes de hexamerinas se expressam no corpo gorduroso de operárias, rainhas e zangões principalmente durante o estágio larval. A modulação da expressão destes genes mostra semelhanças durante a transição larval-pupal de operárias, rainhas e zangões, com altos níveis de transcritos no último estágio larval e baixos níveis no início da fase pupal. No entanto, a quantidade relativa de transcritos de hex 70a, hex 70b e hex 110 na fase de alimentação do último estágio larval (L5F) é significantemente menor nas rainhas que nas operárias, o que sugere participação das respectivas proteínas no processo de diferenciação de castas. Durante o estágio larval, as quatro diferentes subunidades de hexamerinas são armazenadas na hemolinfa onde, aparentemente, cumprem a função de proteínas de estocagem e, portanto, constituem fonte de aminoácidos para utilização em processos inerentes ao desenvolvimento pupal. No entanto, a expressão de hex 70a se estende até ao estágio adulto de operárias, rainhas e zangões, e neste estágio, as fêmeas e os zangões exibem perfis distintos de expressão. No corpo gorduroso de operárias, mas não no de rainhas e zangões, a expressão de hex 110 também ocorre durante o estágio adulto. A expressão de hex 70a e hex 110 no corpo gorduroso mostrou-se limitada pela disponibilidade de nutrientes: operárias alimentadas com uma dieta protéica apresentaram níveis significantemente maiores de ambos transcritos que aquelas que receberam dieta desprovida de proteínas, assim evidenciando que os processos de transcrição e tradução são nutricionalmente regulados. Além disto, os níveis de transcritos de hex 70a e hex 110 aumentam no corpo gorduroso de abelhas operárias portadoras de ovários ativos, sugerindo que estes genes têm função associada à reprodução. Em A. mellifera, o corpo gorduroso não é o único sítio de expressão dos genes de hexamerinas. Transcritos de hex 70a, hex 70b e hex 110 foram detectados também nas gônadas em desenvolvimento de operárias, rainhas e zangões, sugerindo uma função na diferenciação dos ovários e maturação dos testículos. Nossos resultados indicam que as hexamerinas codificadas por estes genes têm funções alternativas no ciclo de vida de abelhas A. mellifera, além de servir como fonte de aminoácidos para a metamorfose. / The cDNAs encoding the hexamerins HEX 70a, HEX 70c and HEX 110 of Apis mellifera were synthesized from total RNA isolated, cloned and their coding region were completely sequenced. In silico analyses of the translation products showed that the respective protein subunits contain the conserved domains N, M and C, typical of hemocyanins, and that in HEX 110, but not in the other subunits, the C domain is interrupted by a repetitive amino acid sequence. Analyses of similarity suggested that in the honey bee, the four hexamerin genes derived by duplication events and diversification from an ancestral gene, resulting in multiple paralogs. Our analyses also showed that HEX 110 is rich in glutamine/glutamic acid and that HEX 70a and HEX 70c are composed by more than 15% of aromatic amino acids and, therefore, integrate the arylphorin class of hexamerins. The temporal expression of these genes, and also of the gene encoding a previously characterized hexamerin of A. mellifera, hex 70b, was analyzed qualitatively and quantitatively during the development of worker bees, queens and drones. Concomitantly, the abundance of the respective polypeptides in the fat body or hemolymph was examined by SDS-PAGE or Western Blot. The four hexamerin genes are expressed in the fat body mainly during larval stage. The modulation of the expression of these genes shows similarities during the larval-pupal transition of worker bees, queens and drones, with high levels of transcripts in the last larval instar and low levels in newly ecdysed pupae. However, the relative quantity of transcripts of hex 70a, hex 70b and hex 110 in the feeding phase of the last larval instar (L5F) is significantly lower in queens than in worker bees, suggesting the participation of the respective proteins in the process of caste differentiation. During the larval stage, the four different hexamerin subunits are stored in the hemolymph where, seemingly, they perform the function of storage proteins and hence, constitute source of amino acids for pupal development. Nevertheless, the expression of hex 70a is extended until the adult stage of worker bees, queens and drones and, in this stage, the female bees and the drones show distinct expression profiles. In the fat body of worker bees, but not in queens and drones, the expression of hex 110 also occurs during the adult stage. The expression of hex 70a and hex 110 in the adult fat body was proven to be limited by the availability of nutrients: worker bees fed with a protein diet showed significantly higher levels of both transcripts than the ones that received a diet which was poor in protein, thus evidencing that the transcription and translation processes are nutritionally-regulated. Additionally, the transcripts level of hex 70a and of hex 110 increase in the fat body of worker bees with active ovaries, suggesting that these genes have function associated with reproduction. In A. mellifera, the fat body is not the only site of expression of hexamerins genes. Transcripts of hex 70a, hex 70b and hex 110 were detected also in developing gonads of worker bees, queens and drones, suggesting that they have a function in ovary differentiation and testis maturation. Our results indicated that the hexamerins encoded by these genes have alternate functions in the life cycle of A. mellifera honey bees, besides serving as a source of amino acids to metamorphosis.

Introdução: Hexamerinas são proteínas de estocagem sintetizadas pelo corpo gorduroso de larvas de insetos e secretadas na hemolinfa, onde se acumulam. A função canônica das hexamerinas consiste em servir de reserva de aminoácidos e energia para a reconstrução de tecidos e órgãos durante a metamorfose. Este trabalho teve como objetivo a busca por evidências de funções alternativas das hexamerinas durante o ciclo de vida de abelhas A. mellifera. Resultados: Os perfis temporais de expressão das quatro hexamerinas (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c e HEX 110), verificados por meio de SDS-PAGE e western blot, corroboram sua função canônica na metamorfose. Consistente com esta função, as quatro hexamerinas foram localizadas no citoplasma das células do corpo gorduroso utilizando-se anticorpos específicos e microscopia confocal. No entanto, funções adicionais puderam ser inferidas com base nos seguintes resultados: (1) Foci das quatro hexamerinas foram localizados nos núcleos de algumas células do corpo gorduroso em metamorfose, levando à hipótese de que têm função anti-apoptótica durante este período crítico do desenvolvimento; (2) Além disso, HEX 70a e HEX 110 foram localizadas no citoplasma e núcleo de células ovarianas e testiculares, indicando função no desenvolvimento e maturação das gônadas; (3) A co-localização de um análogo de timidina (EdU) e HEX 70a nos núcleos das células dos ovaríolos, sugeriu fortemente uma função na proliferação celular. O knockdown de HEX 70a in vivo por meio de injeção de anticorpo específico prejudicou o crescimento dos ovaríolos de rainhas, reforçando a hipótese de função na proliferação celular, (4) interferiu na esclerotização da cutícula de operárias, indicando função na formação do exoesqueleto e (5) provocou a antecipação da ecdise adulta, provavelmente em resposta à ausência (ou diminuição) dos aminoácidos derivados das hexamerinas. Foram investigados também aspectos da regulação dos genes de hexamerinas. A manipulação experimental da dieta alimentar e dos títulos do hormônio juvenil (HJ) interferiram claramente na expressão dos genes de hexamerinas. A potencial ação reguladora do HJ foi reforçada pelos resultados de análises por bioinformática da região 5 UTR de cada gene de hexamerina (Martins et al., 2010) que revelaram potencial motivo de ligação à proteína Ultraspiracle (Usp), um membro do complexo receptor do HJ no DNA. Procedimentos para expressar as hexamerinas in vitro em sistema de bactérias e purificá-las estão em progresso visando a caracterização da estrutura e de interações entre as subunidades. Conclusão: Estes resultados ressaltam que as hexamerinas têm outras funções no ciclo de vida de A. mellifera, além da função já bem estabelecida de reserva de aminoácidos para a metamorfose. / Background: Insect hexamerins are storage proteins synthesized by the larval fat body and secreted into the hemolymph, where they accumulate. The canonical function of hexamerins is to provide amino acids and energy for the reconstruction of tissues and organs during pupal-to-adult development. The aim of the current study was to search for evidence of alternative roles for the hexamerins in the life cycle of the honey bee, A. mellifera. Results: The canonical role of insect hexamerins received support from our data on the temporal expression profiles of the four honey bee hexamerin subunits (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c and HEX 110), as verified by SDS-PAGE and western blot using hemolymph and fat body samples. Consistent with the canonical function, the four hexamerins were localized in the cytoplasm of fat body cells, during metamorphosis, by using specific antibodies and confocal laser-scanning microscopy. However, additional functions could be inferred by the following findings: (1) The four hexamerins were also localized in the nuclei of some fat body cells, thus tentatively suggesting an anti-apoptotic role during metamorphosis; (2) Furthermore, HEX 70a and HEX 110 were localized in the cytoplasm and nucleus of ovarian and testicular cells, pointing to a role in gonad development and maturation. Co-labeling of the thymidine analog EdU and HEX 70a in the ovariole cell nuclei, strongly suggested a role in cell proliferation; HEX 70a depletion via injection of the specific antibody in queen pupae impaired ovariole growth, thus strengthening our hypothesis on a role in cell proliferation, (3) HEX 70a depletion also impaired cuticle sclerotization, indicating a function in exoskeleton formation, and (4) led to a precocious adult ecdysis, perhaps in response to the lack (or decrease) in hexamerin-derived amino acids. We also investigated aspects of the regulation of hexamerin genes. The experimental manipulation of diet consumption and juvenile hormone (JH) titer clearly interfered in the expression of hexamerin genes. Regulation by JH was also supported by a previous bioinformatics analysis of the 5 UTR region of each hexamerin gene (Martins et al., 2010), which revealed a potential binding site for Ultraspiracle (Usp), a member of the JH receptor complex in the DNA. Experiments are in progress for in vitro expression and purification of the four hexamerins aiming to further characterize their structures and interactions. Conclusion: Taken together, these results imply in novel roles for hexamerins in the life cycle of A. mellifera in addition to their well-established role as amino acids sources for metamorphosis.

Em insetos, as enzimas glutationa S-transferases (GSTs) são conhecidas pela capacidade de degradar inseticidas, pesticidas e outros compostos químicos, naturais ou não naturais, estranhos ao organismo, podendo também promover o transporte intracelular de hormônios, metabólitos, e atuar na proteção celular contra o estresse oxidativo. Além disto, a função de uma GST tem sido associada ao processo de sequestro, pelo corpo gorduroso, de um tipo de proteína (hexamerinas) estocada na hemolinfa larval para ser utilizada como fonte de aminoácidos durante a metamorfose. Os objetivos deste trabalho consistiram em caracterizar a estrutura, a expressão e aspectos da função dos genes codificadores de GSTs em abelhas operárias Apis mellifera, além de investigar a possível função de um destes genes, hp191(GSTS1), na dinâmica de sequestro de hexamerinas durante a metamorfose. A metodologia utilizada abrangeu técnicas de biologia molecular, como RT-PCR semiquantitativa e em tempo real, sequenciamento de nucleotídeos, western blot, silenciamento gênico. Resumidamente os resultados mostraram (1) diferenças estruturais (número e organização de íntrons e éxons) entre os dez genes GSTs de A. mellifera, (2) aumento da atividade destes genes relacionado ao envelhecimento e intensa atividade de forrageamento, (3) níveis de expressão dependente do tipo de dieta alimentar, (4) perfil de expressão de hp191(GSTS1), assim como sua resposta aos hormônios morfogenéticos (hormônio juvenil e 20-hidroxiecdisona), consistentes com função na metamorfose, (4) diminuição dos níveis de hexamerina HEX 70a na hemolinfa em consequência do silenciamento de hp191(GSTS1) mediado por RNAi. Em conjunto, estes dados informam sobre estrutura, expressão e função dos genes GSTs de A. mellifera com particular foco na potencial participação de hp191(GSTS1) na metamorfose. / In insects, the enzymes glutathione S-transferases (GSTs) are known for their ability to degrade insecticides, pesticides and other chemical compounds, natural or not, which are not normally produced or expected to be present in the organism. GSTs can also promote the intracellular transportation of hormones and metabolites as well as act in the cellular protection against oxidative stress. In addition, the GST function has been associated with the process of sequestration, by the fat body, of one type of protein (hexamerin) which is stored in the larval hemolymph to be used as a source of amino acids during metamorphosis. The aims of this study were (1) to characterize structure and expression, and explore the roles of the GST encoding genes in Apis mellifera worker bees and, (2) to investigate the potential role of one of these genes, hp191(GSTS1), in the dynamics of hexamerin sequestration during metamorphosis. The methodology included molecular biology techniques, such as semiquantitative and real time RT-PCR, gene sequencing and silencing, and western blot. Briefly, the results revealed structural differences (number and organization of introns and exons) among the ten GSTs genes of A. mellifera, increased activity of these genes associated to bee aging and the intense foraging activity, and modulation of the expression levels of GST genes by the type of diet. The results also revealed that the expression profile of hp191(GSTS1), as well as its response to the morphogenetic hormones (juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone), are consistent with a function in metamorphosis. Furthermore, hp191(GSTS1) silencing mediated by RNAi resulted in decreased hemolymph levels of a hexamerin (HEX 70a) with an essential function in metamorphosis. Altogether, these data provide novel findings concerning the structure, expression and function of the GSTs genes of A. mellifera with a special focus on the potential participation of hp191(GSTS1) in metamorphosis.

Introdução: Hexamerinas são proteínas de estocagem sintetizadas pelo corpo gorduroso de larvas de insetos e secretadas na hemolinfa, onde se acumulam. A função canônica das hexamerinas consiste em servir de reserva de aminoácidos e energia para a reconstrução de tecidos e órgãos durante a metamorfose. Este trabalho teve como objetivo a busca por evidências de funções alternativas das hexamerinas durante o ciclo de vida de abelhas A. mellifera. Resultados: Os perfis temporais de expressão das quatro hexamerinas (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c e HEX 110), verificados por meio de SDS-PAGE e western blot, corroboram sua função canônica na metamorfose. Consistente com esta função, as quatro hexamerinas foram localizadas no citoplasma das células do corpo gorduroso utilizando-se anticorpos específicos e microscopia confocal. No entanto, funções adicionais puderam ser inferidas com base nos seguintes resultados: (1) Foci das quatro hexamerinas foram localizados nos núcleos de algumas células do corpo gorduroso em metamorfose, levando à hipótese de que têm função anti-apoptótica durante este período crítico do desenvolvimento; (2) Além disso, HEX 70a e HEX 110 foram localizadas no citoplasma e núcleo de células ovarianas e testiculares, indicando função no desenvolvimento e maturação das gônadas; (3) A co-localização de um análogo de timidina (EdU) e HEX 70a nos núcleos das células dos ovaríolos, sugeriu fortemente uma função na proliferação celular. O knockdown de HEX 70a in vivo por meio de injeção de anticorpo específico prejudicou o crescimento dos ovaríolos de rainhas, reforçando a hipótese de função na proliferação celular, (4) interferiu na esclerotização da cutícula de operárias, indicando função na formação do exoesqueleto e (5) provocou a antecipação da ecdise adulta, provavelmente em resposta à ausência (ou diminuição) dos aminoácidos derivados das hexamerinas. Foram investigados também aspectos da regulação dos genes de hexamerinas. A manipulação experimental da dieta alimentar e dos títulos do hormônio juvenil (HJ) interferiram claramente na expressão dos genes de hexamerinas. A potencial ação reguladora do HJ foi reforçada pelos resultados de análises por bioinformática da região 5 UTR de cada gene de hexamerina (Martins et al., 2010) que revelaram potencial motivo de ligação à proteína Ultraspiracle (Usp), um membro do complexo receptor do HJ no DNA. Procedimentos para expressar as hexamerinas in vitro em sistema de bactérias e purificá-las estão em progresso visando a caracterização da estrutura e de interações entre as subunidades. Conclusão: Estes resultados ressaltam que as hexamerinas têm outras funções no ciclo de vida de A. mellifera, além da função já bem estabelecida de reserva de aminoácidos para a metamorfose. / Background: Insect hexamerins are storage proteins synthesized by the larval fat body and secreted into the hemolymph, where they accumulate. The canonical function of hexamerins is to provide amino acids and energy for the reconstruction of tissues and organs during pupal-to-adult development. The aim of the current study was to search for evidence of alternative roles for the hexamerins in the life cycle of the honey bee, A. mellifera. Results: The canonical role of insect hexamerins received support from our data on the temporal expression profiles of the four honey bee hexamerin subunits (HEX 70a, HEX 70b, HEX 70c and HEX 110), as verified by SDS-PAGE and western blot using hemolymph and fat body samples. Consistent with the canonical function, the four hexamerins were localized in the cytoplasm of fat body cells, during metamorphosis, by using specific antibodies and confocal laser-scanning microscopy. However, additional functions could be inferred by the following findings: (1) The four hexamerins were also localized in the nuclei of some fat body cells, thus tentatively suggesting an anti-apoptotic role during metamorphosis; (2) Furthermore, HEX 70a and HEX 110 were localized in the cytoplasm and nucleus of ovarian and testicular cells, pointing to a role in gonad development and maturation. Co-labeling of the thymidine analog EdU and HEX 70a in the ovariole cell nuclei, strongly suggested a role in cell proliferation; HEX 70a depletion via injection of the specific antibody in queen pupae impaired ovariole growth, thus strengthening our hypothesis on a role in cell proliferation, (3) HEX 70a depletion also impaired cuticle sclerotization, indicating a function in exoskeleton formation, and (4) led to a precocious adult ecdysis, perhaps in response to the lack (or decrease) in hexamerin-derived amino acids. We also investigated aspects of the regulation of hexamerin genes. The experimental manipulation of diet consumption and juvenile hormone (JH) titer clearly interfered in the expression of hexamerin genes. Regulation by JH was also supported by a previous bioinformatics analysis of the 5 UTR region of each hexamerin gene (Martins et al., 2010), which revealed a potential binding site for Ultraspiracle (Usp), a member of the JH receptor complex in the DNA. Experiments are in progress for in vitro expression and purification of the four hexamerins aiming to further characterize their structures and interactions. Conclusion: Taken together, these results imply in novel roles for hexamerins in the life cycle of A. mellifera in addition to their well-established role as amino acids sources for metamorphosis.

Em insetos, as enzimas glutationa S-transferases (GSTs) são conhecidas pela capacidade de degradar inseticidas, pesticidas e outros compostos químicos, naturais ou não naturais, estranhos ao organismo, podendo também promover o transporte intracelular de hormônios, metabólitos, e atuar na proteção celular contra o estresse oxidativo. Além disto, a função de uma GST tem sido associada ao processo de sequestro, pelo corpo gorduroso, de um tipo de proteína (hexamerinas) estocada na hemolinfa larval para ser utilizada como fonte de aminoácidos durante a metamorfose. Os objetivos deste trabalho consistiram em caracterizar a estrutura, a expressão e aspectos da função dos genes codificadores de GSTs em abelhas operárias Apis mellifera, além de investigar a possível função de um destes genes, hp191(GSTS1), na dinâmica de sequestro de hexamerinas durante a metamorfose. A metodologia utilizada abrangeu técnicas de biologia molecular, como RT-PCR semiquantitativa e em tempo real, sequenciamento de nucleotídeos, western blot, silenciamento gênico. Resumidamente os resultados mostraram (1) diferenças estruturais (número e organização de íntrons e éxons) entre os dez genes GSTs de A. mellifera, (2) aumento da atividade destes genes relacionado ao envelhecimento e intensa atividade de forrageamento, (3) níveis de expressão dependente do tipo de dieta alimentar, (4) perfil de expressão de hp191(GSTS1), assim como sua resposta aos hormônios morfogenéticos (hormônio juvenil e 20-hidroxiecdisona), consistentes com função na metamorfose, (4) diminuição dos níveis de hexamerina HEX 70a na hemolinfa em consequência do silenciamento de hp191(GSTS1) mediado por RNAi. Em conjunto, estes dados informam sobre estrutura, expressão e função dos genes GSTs de A. mellifera com particular foco na potencial participação de hp191(GSTS1) na metamorfose. / In insects, the enzymes glutathione S-transferases (GSTs) are known for their ability to degrade insecticides, pesticides and other chemical compounds, natural or not, which are not normally produced or expected to be present in the organism. GSTs can also promote the intracellular transportation of hormones and metabolites as well as act in the cellular protection against oxidative stress. In addition, the GST function has been associated with the process of sequestration, by the fat body, of one type of protein (hexamerin) which is stored in the larval hemolymph to be used as a source of amino acids during metamorphosis. The aims of this study were (1) to characterize structure and expression, and explore the roles of the GST encoding genes in Apis mellifera worker bees and, (2) to investigate the potential role of one of these genes, hp191(GSTS1), in the dynamics of hexamerin sequestration during metamorphosis. The methodology included molecular biology techniques, such as semiquantitative and real time RT-PCR, gene sequencing and silencing, and western blot. Briefly, the results revealed structural differences (number and organization of introns and exons) among the ten GSTs genes of A. mellifera, increased activity of these genes associated to bee aging and the intense foraging activity, and modulation of the expression levels of GST genes by the type of diet. The results also revealed that the expression profile of hp191(GSTS1), as well as its response to the morphogenetic hormones (juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone), are consistent with a function in metamorphosis. Furthermore, hp191(GSTS1) silencing mediated by RNAi resulted in decreased hemolymph levels of a hexamerin (HEX 70a) with an essential function in metamorphosis. Altogether, these data provide novel findings concerning the structure, expression and function of the GSTs genes of A. mellifera with a special focus on the potential participation of hp191(GSTS1) in metamorphosis.