The application of ultrahigh-field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS) technology to identify and quantify metabolomics data is relatively new. An important feature of the FTICR-MS metabolomics data is the high percentage of missing values. In this thesis, missing value analysis showed that the missing value percentages were up to 50% and the control treatment, NaOH.ww, had the highest missing value percentage among the treatments in the aqueous FTICRMS sets. A simulation study was done for the FTICR-MS data to compare selection methods, the Kruskal-Wallis test and the MTP and Limma functions in Bioconductor, an open source project to facilitate the analysis of high-throughput data. The study showed that MTP was sensitive to variations among treatments, while the Kruskal- Wallis test was relatively conservative in detecting variations. As a result, MTP had a much higher false positive rate than Kruskal-Wallis test. The performance of Limma for sensitivity and false positive rate was between the Kruskal-Wallis test and MTP. Data sets with missing values were also simulated to assess the performance of imputation methods. Study showed that variances among treatments diminished or disappeared after imputations, but no new differentially expressed masses were created. This gave us confidence in using imputation methods. Summary of analysis results of some of the frogSCOPE data sets was given in the last chapter as an illustration. / Graduate

The rise of high-throughput scientific experimentation and data collection has introduced new classes of statistical and computational challenges. The technologies driving this data explosion are subject to complex new forms of measurement error, requiring sophisticated statistical approaches. Simultaneously, statistical computing must adapt to larger volumes of data and new computational environments, particularly parallel and distributed settings. This dissertation presents several computational and theoretical contributions to these challenges. In chapter 1, we consider the problem of estimating the genome-wide distribution of nucleosome positions from paired-end sequencing data. We develop a modeling approach based on nonparametric templates that controls for variability due to enzymatic digestion. We use this to construct a calibrated Bayesian method to detect local concentrations of nucleosome positions. Inference is carried out via a distributed HMC algorithm that scales linearly in complexity with the length of the genome being analyzed. We provide MPI-based implementations of the proposed methods, stand-alone and on Amazon EC2, which can provide inferences on an entire S. cerevisiae genome in less than 1 hour on EC2. We then present a method for absolute quantitation from LC-MS/MS proteomics experiments in chapter 2. We present a Bayesian model for the non-ignorable missing data mechanism induced by this technology, which includes an unusual combination of censoring and truncation. We provide a scalable MCMC sampler for inference in this setting, enabling full-proteome analyses using cluster computing environments. A set of simulation studies and actual experiments demonstrate this approach's validity and utility. We close in chapter 3 by proposing a theoretical framework for the analysis of preprocessing under the banner of multiphase inference. Preprocessing forms an oft-neglected foundation for a wide range of statistical and scientific analyses. We provide some initial theoretical foundations for this area, including distributed preprocessing, building upon previous work in multiple imputation. We demonstrate that multiphase inferences can, in some cases, even surpass standard single-phase estimators in efficiency and robustness. Our work suggests several paths for further research into the statistical principles underlying preprocessing. / Statistics

Droplet microfluidics is an emerging technology for analysis of single cells and biomolecules at high throughput. The controlled encapsulation of particles along with the surrounding microenvironment in discrete droplets, which acts as miniaturized reaction vessels, allows millions of particles to be screened in parallel. By utilizing the unit operations developed to generate, manipulate and analyze droplets, this technology platform has been used to miniaturize a wide range of complex biological assays including, but not limited to, directed evolution, rare cell detection, single cell transcriptomics, rare mutation detection and drug screening. The aim of this thesis is to develop droplet microfluidics based methods for analysis of single cells and nucleic acids. In Paper I, a method for time-series analysis of mammalian cells, using automated fluorescence microscopy and image analysis technique is presented. The cell-containing droplets were trapped on-chip and imaged continuously to assess the viability of hundreds of isolated individual cells over time. This method can be used for studying the dynamic behavior of cells. In Paper II, the influence of droplet size on cell division and viability of mammalian cell factories during cultivation in droplets is presented. The ability to achieve continuous cell division in droplets will enable development of mammalian cell factory screening assays in droplets. In Paper III, a workflow for detecting the outcome of droplet PCR assay using fluorescently color-coded beads is presented. This workflow was used to detect the presence of DNA biomarkers associated with poultry pathogens in a sample. The use of color-coded detection beads will help to improve the scalability of the detection panel, to detect multiple targets in a sample. In Paper IV, a novel unit operation for label-free enrichment of particles in droplets using acoustophoresis is presented. This technique will be useful for developing droplet-based assays that require label-free enrichment of cells/particles and removal of droplet content. In general, droplet microfluidics has proven to be a versatile tool for biological analysis. In the years to come, droplet microfluidics could potentially be used to improve clinical diagnostics and bio-based production processes. / <p>QC 20160926</p>

Miniaturization of biological analysis is a trend in the field of biotechnology aiming to increase resolution and sensitivity in biological assays. Decreasing the reaction volumes to analyze fewer analytes in each reaction vessel enables the detection of rare analytes in a vast background of more common variants. Droplet microfluidics is a high throughput technology for the generation, manipulation and analysis of picoliter scale water droplets an in immiscible oil. The capacity for high throughput processing of discrete reaction vessels makes droplet microfluidics a valuable tool for miniaturization of biological analysis. In the first paper, detection methods compatible with droplet microfluidics was expanded to include SiNR FET sensors. An integrated droplet microfluidics SiNR FET sensor device capable of extracting droplet contents, transferring a train of droplets to the SiNR to measure pH was implemented and tested. In paper II, a workflow was developed for scalable and target flexible multiplex droplet PCR using fluorescently color-coded beads for target detection. The workflow was verified for concurrent detection of two microorganisms infecting poultry. The detection panel was increased to multiple targets in one assay by the use of target specific capture probes on color-coded detection beads.   In paper III, droplet microfluidics has been successfully applied to single cell processing, demonstrated in paper III, where reverse transcription was performed on 65000 individually encapsulated mammalian cells. cDNA yield was approximately equivalent for reactions performed in droplets and in microliter scale. This workflow was further developed in paper IV to perform reverse transcription PCR in microfluidic droplets for detection of exosomes based on 18S RNA content. The identification of single exosomes based on RNA content can be further developed to detect specific RNA biomarkers for disease diagnostics. Droplet microfluidics has great potential for increasing resolution in biological analysis and to become a standard tool in disease diagnostics and clinical research. / <p>QC 20171024</p>

Der Typ 2 Diabetes mellitus ist eine chronische Stoffwechselerkrankung; hauptsächlich wird dieser durch das Versagen der Insulin-produzierenden _-Zellen und der gestörten Funktion des Insulin Rezeptors in periphären Geweben definiert. Obwohl die Forschung schon tief in die Geschichte greift und der Inzidenz Anstieg besorgniserregende Tendenzen zeigt, bleiben die pathophysiologische Grundlagen dieser Krankheit unklar. Die Voraussetzung für die Entwicklung des T2D und das zentrale Thema dieser Dissertation – das _-Zellen Versagen – wurde in den letzten Jahrzehnten aktiv erforscht. Viele aktuelle, in gewisen Maße überlappende, Hypothesen wurden aufgestellt, in einem Versuch die biologischen Grundlagen zu erläutern, die zum Versagen der _-Zellen führen und gleichzeitig mögliche Lösungen für dieses Problem zu finden. Während die Hypothesen, die auf den nicht-immunen Zelltentod als Ursache für Zellen Versagen beruhen, durch neue Studien an Zugkraft verlieren, bleiben andere mit ERStress und Dedifferenzierung als Schwerpunkt immer noch relevant. Alle bisher genannten Mechanismen leiden dennoch an geringer Reproduzierbarkeit und herausfordernden Translationsmöglichkeiten. Zudem hat sich die momentan meist genutzte experimentelle Plattform zunehmend als suboptimal erwiesen, denn sie basiert auf Gewinnung von Langerhassche Inseln durch enzymatische Isolierungsverfahren aus Spenderorganen; insbesondere für die Studien die sich methodologisch auf hoch-empfindliche Hochdurchsatzmethoden gründen. Frühere Arbeiten des Solimena-Labors mit Microarray-basierten transkriptomischen Signaturen haben deutlich gezeigt, was seit dem Aufkommen erschwinglicher omics-Methoden in diesem Bereich spekuliert wurde. Es hat sich gezeigt, dass diese hochsensiblen experimentellen Ansätze beeinträchtigt werden, vor allem durch die Verfahren, die zur Isolierung der Inseln aus der gesamten Bauchspeicheldrüse von Spendern erforderlich sind. Die Einführung von Signaturen, die eher ein Produkt des experimentellen Verfahrens als der biologischen Variabilität sind, stellte ein erhebliches Hindernis für die Interpretation der Daten dar, die aufgrund der verworrenen Natur der Auswirkungen der Krankheit auf die Zellbiologie selbst bereits komplex sind. Der Wert der Plattform „Studies of Islets in Living Donors' wurde durch das translationale Potenzial erhöht, das durch die verfügbaren klinischen Daten und die präoperative Erstellung von Stoffwechselprofilen definiert wird, die ansonsten durch den rechtlichen Rahmen für Organspenden stark eingeschränkt sind. In dieser Dissertation wurden LCM-Inseln von lebenden chirurgischen Spendern mit Hilfe von drei Hochdurchsatzmodalitäten profiliert: RNA-Sequenzierung, ungezielte massenspektrometrie-basierte Proteomik und enzymatische Methylierungssequenzierung. Für sich betrachtet, brachte jeder dieser Ansätze neue Erkenntnisse, und im Falle der RNA-Sequenzierung und der Proteomik wurden ausgewählte frühere Ergebnisse bestätigt. Die High-Level-Analyse der Insel-Transkriptome identifizierte eindeutig eine Untergruppe der Proben, die besonders stark mit Betazellen angereichert war, was durch die Dekonvolutionsanalyse bestätigt wurde. Dies ermöglichte vor allem die Identifizierung von differenziell regulierten Genen in den Inselzellen von Patienten mit gerstörten Glukosetoleranz, was einen neuen Einblick in die Entwicklung der Krankheit und nicht nur in die bereits vorhandene Krankheit bietet. Bei der differenziellen Expressionsanalyse wurde eine allgemeine Hochregulierung von Genen festgestellt, während die Gene-Set-Enrichment-Analyse dieser Daten auf Störungen bei Prozessen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel, der Translation und extrazellulären Interaktionen hinwies. Die gewichtete Genkorrelationsnetzwerkanalyse identifizierte ein Gen-Koexpressionsmodul, das stark mit der längerfristigen Blutzuckerkontrolle, gemessen durch HbA1c, korreliert. Das Proteom-Profiling deckte eine herausragende Ähnlichkeit zwischen den Proteomen der ND-Inseln und eine bemerkenswerte Streuung der T2D-Proben auf. Die Ergebnisse der differenziellen Abundanzanalyse sowie der anschließenden Anreicherungsanalysen bestätigten weitgehend die Ergebnisse der Transkriptomanalyse, obwohl die Korrelation zwischen den Transkriptomen und Proteomen insgesamt gering war. Dennoch wurden einige der interessanten Targets, die in der Transkriptomanalyse identifiziert wurden, wie z.B. ALDOB oder ACADS, durch die Proteomanalyse bestätigt, wobei zusätzliche Targets neu identifiziert wurden (z.B. CD90). Obwohl die aus den Methylierungssequenzierungsexperimenten gewonnenen Informationen höchstwahrscheinlich aufgrund der relativ geringen Anzahl der untersuchten Personen begrenzt sind, konnten dennoch aussagekräftige Beobachtungen gemacht werden. Das eindeutige Vorherrschen hypomethylierter Regionen in T2D-Inseln unterstützt die durch die anderen Analysen gewonnenen Erkenntnisse und unterstreicht die scheinbar unselektive Lockerung der Zügel bei der Genexpression, die zuvor angenommen wurde. Ausgewählte Targets aus den oben erwähnten bioinformatischen Analysen wurden in vitro untersucht, um ihre Rolle in der Betazellbiologie in T2D zu validieren. Die Überexpression von ALDOB unter in vitro Bedingungen ergab keinen dramatischen Phänotyp, und diese Ergebnisse können bestenfalls als Hinweise auf die Richtung der Stoffwechselstörung in Betazellen in T2D interpretiert werden. Insbesondere scheint die Histonacetylierung in T2D überzeugend verändert zu sein, was möglicherweise auf den veränderten Spiegel von ACADS und/oder seinem Paralogon ACADSB zurückzuführen ist und im Einklang mit der beobachteten allgemeinen Hochregulierung der Genexpression in T2D steht. Wichtig ist, dass Immunfluoreszenzexperimente, bei denen die CD90-Expression vollständig außerhalb des endokrinen Zellbereichs identifiziert wurde, die Bedeutung von Validierungsbemühungen in Verbindung mit omics-Experimenten zur Vermeidung von Interpretationen auf der Grundlage falsch positiver Ergebnisse hervorheben. Schließlich wurden Gewebeschnitte einer Untergruppe von Patienten, die durch RNA-Sequenzierung profiliert worden waren, mit einer maßgeschneiderten Bildanalyse-Pipeline auf das Vorhandensein von Insel-Amyloidose untersucht. Diese Daten wurden mit den klinischen Daten und mit einmalig verfügbaren transkriptomischen Profilen integriert. Sowohl die differentielle Expressionsanalyse als auch die GSEA identifizierten Signaturen, die im Zusammenhang mit der Inselamyloidose von Interesse sind (Zytokinrezeptorinteraktion, Proteintranslation und -verarbeitung). Diese Befunde sind jedoch nur begrenzt spezifisch für die Insel-Amyloidose, da sie meist auch in der Hauptanalyse zum Diabetes-Status zu finden sind. Die Identifizierung von traskriptomischen Veränderungen, die spezifisch für die Inselamyloidose sind und nicht direkt mit der Krankheit selbst zusammenhängen, ist daher mit dem derzeitigen Ansatz fraglich. Nichtsdestotrotz wurde ein Gen-Koexpressionsmodul identifiziert, das in signifikanter, wenn auch schwacher Weise mit der Inselamyloidose korreliert, was für künftige Studien zu dieser Entität spricht.