This thesis deals with the content of biogenic amines in natural wines. It compares the results of the sensory evaluation of the analyzed samples with the results of the chemical analysis of the basic parameters of the wine and with the results of the analysis of the content of biogenic amines. In the literature review, the chemistry and toxicology of these substances is described. The biochemistry of processes and the conditions under which they originate are explained in detail. Part of the review deals with the technical process of detection of biogenic amines. The experimental part describes the material and methods of determination of the sensory and chemical parameters. Both analysis are compared and statistically processed. The results show that biogenic amines are formed primarily by lactic acid bacteria and are found to be present in larger amount in wines that have undergone spontaneous malolactic fermentation. Based on these conclusions the propositions for future research and its applications in process of winemaking is made.

Schweine werden mit hohen Mengen an Histamin konfrontiert, die sich im Lumen ihres Dickdarmes befinden. Dieses Histamin ist einerseits als endogenes Histamin in Mastzellen in der Tela submucosa gespeichert. Andererseits wird durch die bakterielle Synthese exogenes Histamin im Darmchymus angereichert. Dabei kann die Histaminkonzentration im Darmlumen bis zu 105-fach größer sein als im Blut. Da ein Übertritt von Histamin in die Zirkulation zur Schocksymptomatik bis hin zum Tode führen würde, ist anzunehmen, dass das Darmepithel der Schweine eine Histaminintoxikation verhindert. Zur Klärung dieser Annahme wurden In vitro Untersuchungen an Darmepithelien des proximalen Kolons vom Schwein mit Hilfe der Ussingkammer-Technik durchgeführt. Unter gradientenfreien Bedingungen war die Hist-rad-Fluxrate (enthält sowohl natives Histamin als auch dessen radioaktiv-markierte Stoffwechselprodukte) von der serosalen zur mukosalen (SM) Epithelseite signifikant höher als die Fluxrate von der mukosalen zur serosalen (MS) Epithelseite. Das deutet auf eine Sekretion von Histamin und/oder seinen Kataboliten über das Darmepithel hin. Die Differenz zwischen der SM- und der MS-Fluxrate verschwand nach der serosalen Zugabe von 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP), ein organisches Kation. Die Hist-rad-Sekretion beruht somit wesentlich auf der Effizienz basolateraler Aufnahmemechanismen für Histamin. Vergleichend durchgeführte Fluxstudien mit Cholin (ein anderes organisches Modellkation) deuten auf eine vorwiegend passive Permeation von Cholin über das Dickdarmepithel hin. Um detailliert erfassen zu können, inwieweit die Histaminverstoffwechselung beim Übertritt über das Epithel eine Rolle spielt, wurde eine HPLC-Methode entwickelt, die es ermöglicht, sowohl Histamin als auch sein Abbauprodukt 1-Methyhistamin (1-MH) in derselben Probe zu bestimmen. Die Methode beruht auf einer zeitsparenden on-line Derivatisierung von Histamin und 1-MH mit ortho-Phtaldialdehyd (OPA). Die funktionellen Studien zeigen, dass Histamin bei seiner Permeation sowohl in MS- als auch in SM-Richtung, zu einem hohen Prozentsatz vom Darmepithel verstoffwechselt wird. Der Umfang der Verstoffwechselung konnte durch die Anwesenheit von Amodiaquin (AD), einem Hemmstoff der Histamin-N-Methyltransferase (HNMT) signifikant mehr reduziert werden als durch eine Hemmung der Diaminoxidase (DAO) mit Aminoguanidin (AG). Die Hist-rad-Fluxrate wurde von den verschiedenen Substanzzugaben nicht beeinflusst. Anhand der gleichzeitigen Bestimmung von 1-MH und Histamin konnte festgestellt werden, dass die serosale Appearance von 1-MH durch die Hemmung der HNMT durch AD signifikant vermindert werden konnte, während die Blockade der DAO durch AG zu einem signifikanten Anstieg führte. Diese Ergebnisse belegen die unmittelbare Beteiligung der HNMT und der DAO an der Histaminverstoffwechselung im porcinen Dickdarmepithel. 1-MH konnte nur auf der serosalen Epithelseite detektiert werden. Ungeachtet der Versuchsgruppen war die serosale Appearance von 1-MH immer größer, wenn Histamin auf der serosalen statt der mukosalen Epithelseite zugesetzt worden war. Das unterstützt die Annahme eines effizienten basolateralen Aufnahmemechanismus für Histamin. Bei Versuchen zur intraepithelialen Kompartimentierung der Histaminverstoffwechselung zeigte sich, dass 1-MH in den Proben kaum noch nachzuweisen war, wenn der vesikuläre Transport durch N-Ethylmaleimid (NEM) gehemmt worden war. Auch die Präsenz von AG zusätzlich zu NEM erhöhte nicht die Appearance von 1-MH. AG alleine führte zu einem Anstieg der 1-MH-Appearance. Daraus kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass 1-MH zur DAO in Vesikel geschleusst und dort der Verstoffwechselung zugeführt wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das Darmepithel in der Lage ist, Histamin zu sezernieren. Dadurch kann endogen freigesetztes Histamin nach mukosal abgegeben werden. Gegenüber exogenem Histamin schützt das Darmepithel den Säugetierorganismus dadurch, dass es durch seine Dichtigkeit kaum Histamin von mukosal auf die Blutseite gelangen lässt. Die Mengen an Histamin, die trotzdem nach serosal gelangen, werden zum großen Teil von serosal in die Zellen aufgenommen. Im Darmepithel der Schweine findet sodann eine sequenzielle Histaminverstoffwechselung statt. Zuerst wird Histamin von der HNMT zu 1-MH umgesetzt und dann wird vor allem 1-MH durch die DAO weiter abgebaut. Damit kommt der HNMT eine entscheidende Rolle bei der Entgiftung von Histamin zu. Der oxidative Abbau von 1-MH scheint in vesikulären Strukturen der Zellen stattzufinden.

Das translationell kotrollierte Tumorprotein (TCTP) ist ein bei Eukaryonten vorkommendes hochkonserviertes Protein, das eine Rolle bei der Pathogenese allergischer Erkrankungen spielt. Bei atopischen Kindern vermittelt es eine IgE abhängige Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch unklar. TCTP hat die Eigenschaft, an das Tubulin des Zytoskeletts der Zelle zu binden und besitzt eine hohe Affinität für Kalzium. Seine Synthese wird auf dem transkriptionellen und translationellen Niveau reguliert. Eine früher angenommene spezifische Funktion in Tumorzellen konnte nicht bestätigt werden. Das für TCTP kodierende Gen wird als TPT1 bezeichnet. Um die molekulare Basis für die Kontrolle der Synthese des TCTP zu verstehen, wurden in dieser Arbeit Struktur und Funktion des TPT1-Gens bei Mensch und Kaninchen untersucht. Erstmalig wurde die vollständige Struktur eines Säuger-TPT1-Gens durch Klonierung und Sequenzierung aufgeklärt und die funktionelle Rolle des Promotors analysiert. Das 3,8 kb große Kaninchengen wird durch fünf Introns unterbrochen, und kodiert für zwei mRNAs von 843 und 1163 nt, die sich in der Länge der 3' untranslatierten Region unterscheiden. Sie entstehen durch alternative Polyadenylierung. Vom Human-Gen wurden genomische Rekombinanten isoliert und seine vorläufige Struktur ermittelt. Es besitzt eine identische Intron/Exon Architektur und unterscheidet sich nur geringfügig in der Länge der Introns. Auch bei der Expression des Human-Gens entstehen zwei mRNAs. Hybridisierungsexperimente mit RNA aus 10 Kaninchen- und 50 Human-Geweben zeigten, daß beide TCTP mRNAs in allen untersuchten Geweben in ähnlichem Verhältnis zueinander exprimiert werden. Die Gesamtkonzentrationen der TCTP- mRNAs unterschied sich jedoch in verschiedenen Gewebegruppen bis zum Faktor 100. Dies deutet auf eine ausgeprägte Regulation der gewebsspezifischen Transkription hin. Die Promotorstrukturen von 1,2 kb 5'-flankierender Sequenzen des Kaninchen- Gens wurden mit Computerprogrammen auf Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren analysiert. Für funktionelle Aussagen wurden Promotorfragmente mit dem Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen (cat) gekoppelt und die Promotoraktivität durch Bestimmung der CAT-Enzymaktivität nach Zelltransfektionen ermittelt. Ein minimaler Promotor von 66 bp Länge, der eine TATA-Box enthält, konnte eingegrenzt werden. Die maximale Promotoraktivität, die 90% im Vergleich zum starken Thymidinkinase-Promotor betrug, war mit einem 290 bp langem Fragment assoziiert und enthielt eine SP-1, zwei AP-1/CREB und zwei ETS Bindungsstellen. Diese Konstellation ist ein häufiges Merkmal von Genen, die wie das TPT1-Gen durch Phorbolester und Lipopolysaccharide induzierbar sind. Im Sequenzbereich bis -160 sind die Promotoren des Human- und des Kaninchen-Gens sehr ähnlich (89% Homologie), alle Bindungsorte für Transkriptionsfaktoren sind hier konserviert. Weiterhin wurde im Kaninchengenom eine Vielzahl von prozessierten TPT1- Pseudogenen.gefunden. Sechs von ihnen und ihre genomisch-flankierenden Integrationsorte wurden sequenziert. Sie repräsentierten beide mRNA Typen und waren zu über 99% zu den korrespondierenden mRNAs homolog. Die Leserahmen aller Pseudogene waren intakt, bei zwei Pseudogenen war die Aminosäuresequenz sogar unverändert erhalten. Die durch CAT-Assays getestete Transkriptionsaktivität der 5'flankierenden Region eines Pseudogens zeigte eine Aktivität von über 15% gegenüber dem authentischen TPT1-Promotor. Dies ist ein Indiz für eine mögliche Expression von TPT1 Pseudogenen in vivo. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is a conserved eukaryotic protein, which is involved in the pathogenesis of allergic diseases. In atopic children it has been reported to mediate histamine release from basophilic leukocytes in an IgE dependent way. The underlying mechanism, however, is unknown. TCTP is characterized by an efficient binding to tubulin of cytoskeletal structures and by a high calcium affinity. Its synthesis is regulated at the transcriptional and translational level. A specific function in tumor cells, which was assumed initially, could not be confirmed. The gene coding for TCTP is called TPT1. To understand the molecular basis for the control of TCTP expression structure and function of the human and rabbit TPT1 genes were investigated including their promoter regions. The first mammalian TPT1 gene (rabbit) was cloned and sequenced. It consists of 3.8 kb and is interrupted by five introns. Two mRNAs of 843 and 1163 nt length are transcribed differing in their 3'untranslated regions. They are generated by alternative polyadenylation. Furthermore genomic recombinants were isolated containing the human TPT1 gene and a preliminary structure of the gene was established. The human gene has the same intron/exon architecture as the rabbit gene just differing in the length of its introns. Human multi-tissue dotblots revealed an identical transcription pattern for both mRNAs. The concentration of the TCTP mRNAs differed up to the factor 100 between different tissues, indicating distinct tissue specificity in transcriptional control. 1.2 kb 5'flanking promoter structures were analyzed for transcription factor binding sites. For functional studies TPT1 promoter fragments were fused to the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reportergene and assayed by cell transfection and CAT enzyme activity. A basic promoter of 66 bp length containing a TATA box could be defined. Maximal promoter activity of 90% compared to the strong thymidine kinase promoter was associated with a fragment of 290 bp containing a SP-1, two AP-1/CREB and two ETS binding sites. This is a common feature of genes like TPT1, which are inducible by phorbolesters and lipopolysaccharides. Furthermore, numerous processed TPT1 pseudogenes were found spread through the rabbit genome. Six pseudogenes and their flanking genomic integration sites were sequenced. They represented both mRNA types and were at least 99% homologous to the corresponding mRNAs. In all pseudogenes the open reading frames were retained and in two of them the original amino acid sequence was even conserved completely. The 5'flanking region of one pseudogene was tested for transcriptional activity by CAT assays and revealed an activity of about 15% of the authentical TPT1 promoter. This could suggest a possible expression of TPT1 pseudogenes in vivo.

The aim of this thesis was to determine the content of biogenic amines (BA)and polyamines (PA)in selected types of cheese and the influence of storage time on the content of biogenic amines.

<p>U ovom radu su razvijene elektrohemijske metode za određivanje histamina. U svim<br />elektrohemijskim ispitivanjima kori&scaron;ćena je hronopotenciometrija. Istraživanja su obuhvatila optimizaciju uslova elektroanalitičkih tehnika i upoređivanje mehanizama generisanja analitičkog signala primenom različitih radnih elektroda, razvoj odgovarajućeg postupka pripreme uzoraka za analizu i samo određivanje histamina u hrani i piću. Ispitana je mogućnost primene čvrste zlatne elektrode, tankoslojne živine i tankoslojne niklove elektrode za elektrohemijsko određivanje histamina. U slučaju elektrooksidacije histamina, razja&scaron;njeni su mehanizmi generisanja signala na primenjenim elektrodama. Optimizacija uslova elektroanalitičkih tehnika obuhvatila je odabir odgovarajućeg pomoćnog elektrolita i njegove koncentracije, ispitivanje uticaja početnog potencijala i struje oksidacije na analitički signal analita. Pored toga, za svaki elektrohemijski sistem definisana su osetljivost i reproduktivnost, selektivnost, kao i opseg linearnosti. Primenom tankoslojne niklove elektrode uočena je pojava adsorpcionog koncentrovanja analita, te su u slučaju ovog elektrohemijskog sistema ispitani i uticaji vremena adsorpcije i temperature ispitivanog medijuma na analitički signal histamina. Na tankoslojnoj živinoj elektrodi analitički signal se generisao usled direktne oksidacije histamina primenom konstantne struje. Na ostale dve elektrode, pored elektrodnih reakcija odvijale su se i hemijske reakcije, tako da se oksidacija histamina u oba slučaja odigravala po ECE mehanizmu (elektrodna reakcija &ndash; hemijska reakcija &ndash; elektrodna reakcija). Na čvrstoj zlatnoj elektrodi, generisanje signala je bilo posledica oksidacije histamina elektrogenerisanim hlorom, dok se u slučaju tankoslojne niklove elektrode radilo o kombinovanoj katalitičko‐adsorpcionoj hronopotenciometriji. Tankoslojna živina elektroda je pokazala dobru selektivnost pri koncentracijama aminokiselina i histamina nižim od 5 mg/dm³, dok je pri vi&scaron;im koncentracijama dolazilo do preklapanja analitičkih signala. Ostali elektrohemijski sistemi nisu pokazali odgovarajuću selektivnost. Najveća osteljivost je ostvarena primenom tankoslojne niklove elektrode (LOD = 0,11 mg/dm³), zatim sledi čvrsta zlatna elektroda (LOD = 0,27 mg/dm³) i na kraju tankoslojna živina elektroda (LOD = 1,31 mg/dm³). U okviru definisanja postupka pripreme uzoraka, ispitana je efikasnost različitih ekstrakcionih tehnika i različitih ekstragenasa u pogledu izdvajanja histamina iz uzoraka. Pored toga razvijeni su odgovarajući postupci preči&scaron;ćavanja ekstrakata primenom preparativnih hromatografskih tehnika, i to na tankom sloju i na stubu adsorbensa. Po definisanju optimalnih uslova elektrohemijskog određivanje histamina, kao i razvijanja postupka pripreme uzoraka, histamin je određen u različitoj hrani i piću.</p> / <p>In this work, the electrochemical methods for the determination of histamine were<br />developed. All electrochemical investigations were carried out by chronopotentiometry. The research included optimization of the experimental parameters of electroanalytical techniques and comparison of the mechanism of the analytical signal generation by using the different working electrodes. Upon the development of sample preparation procedure, histamine was determined in different food and beverages. The possibility of applying solid gold electrodes, thin film mercury electrode and thin film nickel electrode for electrochemical determination of histamine was examined. The mechanisms of histamine electrooxidation on different working electrodes were explained and elaborated. Optimization of the experimental parameters of electroanalytical techniques included the selection of appropriate supporting electrolyte and its concentration, and investigation of the influence of initial potential and oxidation current on histamine analytical signal. Beside this, for each electrochemical system sensitivity and reproducibility, selectivity as well as linearity range were defined. The use of thin nickel film electrode resulted in adsorptive accumulation, and in that case the effects of accumulation time and medium temperature on histamine analytical signal were defined. On thin film mercury electrode, histamine analytical signal was generated<br />due to direct oxidation of histamine by a constant current. On other two electrodes, electrode reactions were coupled with chemical reaction, and histamine oxidation was by ECE mechanism (electrode reaction &ndash; chemical reaction &ndash; electrode reaction). On solid gold electrode histamine was oxidized indirectly by electrogenerated chlorine, while in the case of thin film nickel electrode combination of catalytic and adsorptive chronopotentiomety was responsible for signal generation. Thin film mercury electrode showed good selectivity for histamine and amino acids concentrations below 5 mg/dm³, but higher concentrations caused the overlapping of analytical signals. Other electrochemical systems did not show adequate selectivity. The best sensitivity was achived by thin film nickel electrode (LOD = 0.11 mg/dm³),<br />followed by a solid gold electrode (LOD = 0.27 mg/dm³), and by thin film mercury electrode (LOD = 1.31 mg/dm³). In order to define adequate sample preparation procedure, the efficiency of different extraction techniques and different solvents were tested for histamine extraction from the samples. Appropriate procedures for purification of extracts were defined as well, by applying preparative thin layer and column chromatography. After optimization of the electrochemical methods for histamine determination, as well as the procedure of sample preparation, developed methods were applied for histamine determination in various food and beverages.</p>