Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / O envelhecimento é um processo biológico complexo, e o conhecimento deste ainda é limitado. Tem sido proposto que alterações epigenéticas podem estar relacionadas ao envelhecimento e ao declínio de memória. Dentre essas alterações está a acetilação de histonas que podem desempenhar um papel crucial no envelhecimento. Com isso, o presente estudo teve como objetivo padronizar o modelo animal de D-gal e avaliar o efeito do butirato de sódio (BS), um inibidor das histonas deacetilases, na memória, modulação das histonas deacetilases (HDAC) e dano ao DNA em ratos Wistar com 2, 6 ou 16 meses submetidos à administração de D-galactose (D-gal). Foram utilizados ratos Wistar machos com 2, 6 ou 16 meses de idade. Para estabelecer a melhor dose de D-gal para indução do modelo de envelhecimento foi realizada uma curva dose-resposta (100, 200 ou 300 mg/kg) em que a D-gal foi administrada durante 30 dias por via oral em ratos com 2 meses de idade. Após, ratos de diferentes idades (2, 6 e 16 meses) foram administrados com D-gal (200 mg/kg) ou água, durante 30 dias. No 24º dia iniciou-se, juntamente com a D-Gal, o tratamento com BS (600 mg/kg) por via intraperitoneal durante 7 dias. 24 horas após a última administração de D-gal ou BS foi realizado o teste de habituação ao campo aberto, Y-maze e esquiva inibitória. O BS foi capaz de reverter o dano de memória de habituação causado pela D-gal em animais com 2 e 6 meses, mas não com 16 meses. BS também foi capaz de reverter o dano causado pelo envelhecimento natural em animais com 16 meses. No teste de esquiva inibitória o BS melhorou a memória imediata, de curta e de longa duração de animais com 2 meses; a memória imediata de animais com 6 meses e a memória de curta e de longa duração de animais com 16 meses. Adicionalmente, o BS reverteu o dano na memória imediata e de curta duração causado pelo envelhecimento natural em animais com 16 meses. O dano na memória espacial causado pelo envelhecimento natural e pela D-gal não foi revertido pelo BS. Além disso, a D-gal causou aumento na atividade das HDACs em animais com 16 meses e o BS conseguiu reverter parcialmente esse efeito no córtex frontal e hipocampo. Quando avaliado os danos ao DNA no sangue periférico, utilizando o ensaio cometa, foi observado que o envelhecimento natural (animais com 16 meses) causou aumento da frequência de danos ao DNA, e o BS foi capaz de reverter parcialmente este dano. Além disso, a D-gal causou aumento do índice e frequência de danos ao DNA nos animais de 2 e 6 meses de idade, e o tratamento com BS foi capaz de reverter este dano, mas não o dano na frequência em animais com 6 meses. Assim, o presente estudo mostrou o efeito protetor do BS na memória de ratos envelhecidos naturalmente ou induzidos pela administração oral de D-gal. A melhora da memória aversiva causada pelo BS nos animais de 16 meses tratados com D-gal pode ser explicada em parte pela redução da atividade das HDACs. A proteção do BS contra o dano na memória de habituação e aversiva induzida pelo envelhecimento natural pode ser explicado, parcialmente, pela redução da frequência de dano ao DNA. A reversão dos danos nas memórias de habituação e aversiva em animais com 2 e 6 meses tratados com D-gal pode ser explicado pela redução da frequência e índice de dano ao DNA nos animais de 2 meses e pela redução do índice de dano ao DNA nos animais de 6 meses. Portanto, o presente estudo fez novos achados que abrem caminho para a utilização do BS no envelhecimento.

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) ainda é afetada pela baixa eficiência. As modificações epigenéticas estabelecidas durante o processo de diferenciação celular estão entre os principais fatores. Uma vez que estas modificações atuam como barreiras epigenéticas restringindo a reprogramação do núcleo somático. Considerando isso, a maioria dos fatores que promovem a descondensação da cromatina, incluindo os inibidores das Histonas Deacetilases (HDACis), tem sido demonstrado aumentarem a eficiência da reprogramação nuclear, tornando o seu uso comum para melhorar as taxas da TNCS. Neste trabalho, nós testamos dois inibidores das histonas deacetilases: o Ácido Valpróico (VPA) e o Ácido β-Hidróxibutírico (BOHB), sendo um farmacológico e o outro um metabólito endógeno na TNCS. Nosso objetivo era testar se o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos com estes HDACis melhoravam o desenvolvimento de embriões bovinos clonados. Em relação ao VPA, nós observamos que o tratamento de fibroblastos com o VPA aumentou a acetilação das histonas e a expressão de genes importantes para o desenvolvimento como IGF2R e PPARGC1A. Entretanto, quando as células tratadas foram usadas como doadoras de núcleo, não foi observado diferença nos níveis de acetilação das H3K9 entre os grupos. Além disso, as alterações foram rapidamente removidas após a transferência nuclear. Em relação as taxas de desenvolvimento, o uso de células tratadas como doadoras de núcleo não resultou em diferença durante o desenvolvimento pré- e pós-implantacional. Em relação ao BOHB, nós executamos um série de experimentos para testar se esta molécula age como um inibidor das HDACs em bovinos. Nós observamos que fibroblastos tratados com BOHB apresentam aumento nos níveis globais de H3K9ac. O tratamento altera a expressão de genes importantes como os transportadores de glicose e a enzima chave no metabolismo lipídico SCD. Também, nós demonstramos que este metabólito é capaz de alterar uma marca epigenética em zigotos clonados, que persiste até o estágio de blastocisto. Entretanto, o tratamento dos zigotos com este metabólito endógeno não aumentou a taxa de desenvolvimento pré-implantacional, embora tenha alterado a expressão de um fator de transcrição que protege embriões contra estresse oxidativo, o FOXO3a. O tratamento de zigotos partenogenéticos com BOHB não afetou o desenvolvimento embrionário, nem a produção de ATP, sugerindo que o BOHB não apresenta efeitos tóxicos como anteriormente pensado. Concluindo, os resultados deste trabalho mostram que a inibição das HDACs através de uma molécula farmacológica ou um metabólito endógeno, não aumenta a eficiência da TNCS em bovinos. Entretanto, aqui nós mostramos que o corpo cetônico BOHB pode ser um elo de ligação entre o ambiente extracelular e a regulação do metabolismo. E serve como um modelo in vitro para testar como distúrbios metabólicos como a cetose afeta o metabolismo e epigenoma celular e embrionário em bovinos / Cloning of mammals by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is still plagued by the low efficiency. The epigenetic marks established during the cell differentiation process are among the main cause. These modifications act as a barrier restricting the nuclear reprogramming process of somatic nuclei. Based on this, molecules that promotes chromatin decondensing, including Histone Deacetylases inhibitors (HDACis), has been demonstrated increase the efficiency of nuclear reprogramming, making their use common on SCNT procedure. Herein, we tested two histone deacetylase inhibitors: Valproic Acid and β-hydroxybutyric Acid, the former a pharmacological drug and the latter, an endogenous metabolite on SCNT. Our objective was to test whether the donor cells treatment or zygotes with these HDACis improve the bovine cloned embryos development. Regarding the VPA, we observed that fibroblasts treatment with VPA increases the histone acetylation and expression of developmentally important genes such as IGF2R and PPARGC1A. However, when treated cells were used as nuclear donors, we did not observe difference on H3K9ac levels between the groups. Moreover, the alterations were quickly removed after SCNT. Regarding the developmental rates, the use of treated cells as nuclear donors did not affect the pre- and post-implantation development. In the second experiment, we used the BOHB in a series of experiments to test whether this molecule acts as a histone deacetylase inhibitor in bovines. We observed that treatment of fibroblasts with BOHB increased the global levels of H3K9ac. Also, treatment alters the expression of important genes such as glucose transporters and a key enzyme regulating lipid synthesis. Additionally, we demonstrated that this metabolite affect at least one epigenetic mark in cloned zygotes, that lasts until the blastocyst stage. However, zygote treatment with this endogenous metabolite did not increase the pre-implantation developmental rates, albeit increased the expression of a transcription factor that protects cells against oxidative stress, the FOXO3a. Treatment of parthenogenetic embryos with BOHB did not affect the embryo development, neither ATP production, suggesting that BOHB is not toxic as previously believed. Concluding, the results presented here shows that the HDAC inhibition through a pharmacological compound or an endogenous metabolite did not increase the efficiency of bovine SCNT. However, here we showed that the ketone body BOHB might be a nexus between the extracellular environment and the cellular metabolism. Also, it can used as a in vitro model to interrogate questions about does metabolic disturbances such as ketosis in cattle affects the epigenome and cellular metabolism in bovines

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) ainda é afetada pela baixa eficiência. As modificações epigenéticas estabelecidas durante o processo de diferenciação celular estão entre os principais fatores. Uma vez que estas modificações atuam como barreiras epigenéticas restringindo a reprogramação do núcleo somático. Considerando isso, a maioria dos fatores que promovem a descondensação da cromatina, incluindo os inibidores das Histonas Deacetilases (HDACis), tem sido demonstrado aumentarem a eficiência da reprogramação nuclear, tornando o seu uso comum para melhorar as taxas da TNCS. Neste trabalho, nós testamos dois inibidores das histonas deacetilases: o Ácido Valpróico (VPA) e o Ácido β-Hidróxibutírico (BOHB), sendo um farmacológico e o outro um metabólito endógeno na TNCS. Nosso objetivo era testar se o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos com estes HDACis melhoravam o desenvolvimento de embriões bovinos clonados. Em relação ao VPA, nós observamos que o tratamento de fibroblastos com o VPA aumentou a acetilação das histonas e a expressão de genes importantes para o desenvolvimento como IGF2R e PPARGC1A. Entretanto, quando as células tratadas foram usadas como doadoras de núcleo, não foi observado diferença nos níveis de acetilação das H3K9 entre os grupos. Além disso, as alterações foram rapidamente removidas após a transferência nuclear. Em relação as taxas de desenvolvimento, o uso de células tratadas como doadoras de núcleo não resultou em diferença durante o desenvolvimento pré- e pós-implantacional. Em relação ao BOHB, nós executamos um série de experimentos para testar se esta molécula age como um inibidor das HDACs em bovinos. Nós observamos que fibroblastos tratados com BOHB apresentam aumento nos níveis globais de H3K9ac. O tratamento altera a expressão de genes importantes como os transportadores de glicose e a enzima chave no metabolismo lipídico SCD. Também, nós demonstramos que este metabólito é capaz de alterar uma marca epigenética em zigotos clonados, que persiste até o estágio de blastocisto. Entretanto, o tratamento dos zigotos com este metabólito endógeno não aumentou a taxa de desenvolvimento pré-implantacional, embora tenha alterado a expressão de um fator de transcrição que protege embriões contra estresse oxidativo, o FOXO3a. O tratamento de zigotos partenogenéticos com BOHB não afetou o desenvolvimento embrionário, nem a produção de ATP, sugerindo que o BOHB não apresenta efeitos tóxicos como anteriormente pensado. Concluindo, os resultados deste trabalho mostram que a inibição das HDACs através de uma molécula farmacológica ou um metabólito endógeno, não aumenta a eficiência da TNCS em bovinos. Entretanto, aqui nós mostramos que o corpo cetônico BOHB pode ser um elo de ligação entre o ambiente extracelular e a regulação do metabolismo. E serve como um modelo in vitro para testar como distúrbios metabólicos como a cetose afeta o metabolismo e epigenoma celular e embrionário em bovinos / Cloning of mammals by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is still plagued by the low efficiency. The epigenetic marks established during the cell differentiation process are among the main cause. These modifications act as a barrier restricting the nuclear reprogramming process of somatic nuclei. Based on this, molecules that promotes chromatin decondensing, including Histone Deacetylases inhibitors (HDACis), has been demonstrated increase the efficiency of nuclear reprogramming, making their use common on SCNT procedure. Herein, we tested two histone deacetylase inhibitors: Valproic Acid and β-hydroxybutyric Acid, the former a pharmacological drug and the latter, an endogenous metabolite on SCNT. Our objective was to test whether the donor cells treatment or zygotes with these HDACis improve the bovine cloned embryos development. Regarding the VPA, we observed that fibroblasts treatment with VPA increases the histone acetylation and expression of developmentally important genes such as IGF2R and PPARGC1A. However, when treated cells were used as nuclear donors, we did not observe difference on H3K9ac levels between the groups. Moreover, the alterations were quickly removed after SCNT. Regarding the developmental rates, the use of treated cells as nuclear donors did not affect the pre- and post-implantation development. In the second experiment, we used the BOHB in a series of experiments to test whether this molecule acts as a histone deacetylase inhibitor in bovines. We observed that treatment of fibroblasts with BOHB increased the global levels of H3K9ac. Also, treatment alters the expression of important genes such as glucose transporters and a key enzyme regulating lipid synthesis. Additionally, we demonstrated that this metabolite affect at least one epigenetic mark in cloned zygotes, that lasts until the blastocyst stage. However, zygote treatment with this endogenous metabolite did not increase the pre-implantation developmental rates, albeit increased the expression of a transcription factor that protects cells against oxidative stress, the FOXO3a. Treatment of parthenogenetic embryos with BOHB did not affect the embryo development, neither ATP production, suggesting that BOHB is not toxic as previously believed. Concluding, the results presented here shows that the HDAC inhibition through a pharmacological compound or an endogenous metabolite did not increase the efficiency of bovine SCNT. However, here we showed that the ketone body BOHB might be a nexus between the extracellular environment and the cellular metabolism. Also, it can used as a in vitro model to interrogate questions about does metabolic disturbances such as ketosis in cattle affects the epigenome and cellular metabolism in bovines