Les molécules HLA de class Ib ou nonclassiques, HLA-G, -E et -F, sont impliqués dans la régulation de la tolérance immunologique. En particulier, les polymorphismes génétiques ainsi que l’expression différentielle de HLA-G sont corrélés à l’évolution clinique des pathologies inflammatoires et des greffes d’organe. Notre premier travail a permis de montrer que la structure génétique de HLA-G était conservée dans des populations au patrimoine génétique différent (Mali et Sud de la France) et que, les haplotypes résultants (UTR), étaient corrélés à l’expression différentielle d’HLA-G soluble. Dans une deuxième étude on a pu montrer l’association différentielle des haplotypes HLA-G UTR avec certain allèles HLA-E, -A, -H, -G et -F suggérant une interaction privilégiée et/ou un effet tolérant synergique entre ces molécules. Une troisième étude a mis en évidence que deux haplotypes HLA-G UTR étaient corrélé à une évolution clinique péjorative dans la mucoviscidose et dans la transplantation pulmonaire. En fin, on a pu montrer une expression différentielle des isoformes de HLA-G dans les cellules épithéliales bronchiques (CEB), redifférencié in vitro, de témoins sains et patients atteints d’asthme avec une expression diminuée chez les asthmatiques. Finalement, l’ensemble de ces données suggèrent que la molécule HLA-G peut être un biomarqueur génétique et/ou sérologique attrayant et une cible thérapeutique potentielle via la modulation de son effet tolérogène dans un contexte de pathologies inflammatoires ou de conflit immunologique, tel que la transplantation d’organe et la transfusion. / HLA nonclassical class Ib genes HLA-G, -E and -F are involved in managing immune tolerance. Particularly for HLA-G, both its genetic polymorphism and its expression are correlated to clinical outcome in different pathologies, particularly in inflammatory disease and organ transplantation. In our first work we have shown that HLA-G genetic structure was conserved in distant healthy populations (Mali and South France) and that, the resulting haplotypes (UTR) were correlated to sHLA-G differential expression. In another study we observed a differential association between HLA-G UTR haplotypes and specific HLA-E, -A, -H, -F alleles that might reflect a privileged interaction and/or a synergistic tolerant effect between these molecules In a third study we showed that two different HLA UTR haplotypes were respectively associated with a worse evolution of cystic fibrosis and an impaired survival in lung transplant recipients. Afterwards, the analysis HLA-G isoforms expression in normal, mild and severe asthmatic human bronchial epithelial cells redifferentiated in vitro showed that the level of these transcripts was significantly reduced in asthmatics compared to controls. In conclusion, these results suggest that HLA-G molecule might be an attractive genetic and/or serologic biomarker and a potential therapeutic target, via the modulation of its tolerogenic effect, in specific allogenic and inflammatory contexts, such as solid organ transplantation or blood transfusion.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A comparação de taxas de substituição não-sinônimas (dN) e sinônimas (dS) permite inferir quais regimes de seleção operaram sobre regiões codificadoras. Genes com d>N/dS > 1 são candidatos a estarem sob seleção positiva, e scans genômicos em busca dessa assinatura se revelaram uma ferramenta poderosa. Trata-se de um método robusto, uma vez que assume-se que tais sítios estão intercalados nas regiões do genoma sob estudo (e portanto partilham a mesma história demográfica), e que têm como foco a variação em genes específicos, eliminando ambiguidades acerca do alvo da seleção. Por outro lado, o critério de ω > 1 para que genes estejam sob seleção positiva é muito conservador. Isso ocorre porque geralmente apenas alguns códons estão sob seleção positiva, enquanto a maior parte das mutações não-sinônimas são deletérias e, portanto, estão sob seleção purificadora. Por isso, convencionou-se analisar subconjuntos de códons em busca de seleção, seja através de uma base de dados mais restrita ou através de modelos que estimam diferentes valores de ω para subconjuntos de códons, tornando possível inferir quais deles estão sob seleção positiva. Os genes das moléculas MHC têm vários padrões de variação que indicam que algum tipo de seleção balanceadora atuou sobre eles (alta diversidade, grande diferenciação entre alelos e a existência de polimorfismos trans-específicos). Os genes HLA constituem um subconjunto de genes do MHC humano e estão localizados no braço curto do cromossomo 6. Os genes clássicos de classe I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) são expressos na maior parte das células somáticas e desempenham papel central no processo de resposta imune adaptativa, capturando e apresentando peptídeos na superfície celular. A região da molécula de MHC à qual antígenos são ligados para serem apresentados a linfócitos T, dessa forma iniciando a resposta imune adaptativa, é conhecida como sítio de reconhecimento do antígeno (ARS). É bem estabelecido que os códons ARS apresentam taxas de substituição não-sinônimas maiores que as taxas sinônimas para esses três locos, consistente com um efeito de seleção balanceadora levando a maior variabilidade funcional na região da molécula que interage com o peptídeo. Os genes HLA clássicos apresentam centenas de alelos, e esses constituem clados que reúnem alelos filogeneticamente relacionados e com similaridades funcionais. Apesar de não haver controvérsia sobre a existência de seleção sobre genes HLA, não existe consenso acerca da importância relativa da seleção sobre linhagens alélicas e sobre alelos individuais na diversificação dos alelos de HLA, e essa foi a questão que decidimos investigar. Nossa hipótese nula foi a de que as linhagens foram os alvos da seleção e a hipótese alternativa foi a de que os alelos individuais foram alvos da seleção ao longo da história evolutiva dos genes HLA. Buscamos, primeiramente, fazer uma validação do método de inferência de dN/dS usando como estudo de caso os códons ARS e sua relação com a capacidade de inferência. Constatamos que, dos códons que encontramos sob seleção positiva, todos (exceto um) estão também na classificação clássica dos códons ARS ou a ±1 códon de distância destes, mostrando que existem evidências de seleção em sítios vizinhos aos ARS. Portanto, uma classificação expandida, que inclua os códons sob seleção que não estão nas classificações ARS comumente utilizadas, deveria aumentar o poder estatístico de testes de modelos de seleção nos genes HLA. Ao comparar os resultados obtidos em análises filogenéticas com bases de dados com e sem recombinantes, verificamos que a remoção de alelos recombinantes altera as estimativas de parâmetros, a identificação de códons com evidência de seleção e a significância dos testes de comparação de modelos. Nossas análises mostraram que ω é significativamente maior para pares de alelos de linhagens diferentes do que para pares de alelos de uma mesma linhagem e que existe uma correlação positiva significativa entre o tempo de divergência dos alelos e as estimativas de ω. Verificamos, ainda, que é possível rejeitar um modelo nulo de uma razão ω estimada para todos os ramos da árvore filogenética e favorecer um modelo em que ω é estimado separadamente para ramos entre e intra-linhagens em HLA-C. Em HLA-A e HLA-C, ω é significativamente > 1 entre linhagens. Mostramos também, para os mesmos locos, ω é significativamente > 1 nos ramos internos. Em HLA-C, o modelo que estima ω separadamente para ramos internos e terminais foi favorecido. Nossos resultados mostram que a intensidade de seleção atuando entre linhagens é maior do que aquela dentro de linhagens. Entretanto, mesmo dentro de linhagens, há fortes evidências de desvios de neutralidade, sugerindo a ação da seleção natural. / The comparison of non-synonymous (dN) and synonymous (dS) substitution rates allows us to infer selection schemes which operated in coding regions. Genes with dN/dS > 1 are candidates to be under positive selection, and genome scans in search for this signature have proved to be a powerful tool. It is a robust method, since it is assumed that such sites are interspersed in regions of the genome under study (and therefore share the same demographic history), and which focuses on the variation in specific genes, eliminating ambiguities about the target of selection. On the other hand, the criterion of ω > 1 for genes to be considered under positive selection is very conservative. This is because usually only a few codons are under positive selection, while most non-synonymous mutations are deleterious and are thus under purifying selection. Therefore, it has been conventioned to analyze subsets of codons in search of selection, either through a narrower data set or through models that calculate different ω values for subsets of codons, making it possible to infer which of them are under positive selection. The MHC molecules genes have different variation patterns that indicate some sort of balancing selection acted upon them (high diversity, large differentiation between alleles and the existence of trans-specific polymorphisms). HLA genes are a subset of human MHC genes and are located on the short arm of chromosome 6. The classical class I genes (HLA-A, HLA-B and HLA-C) are expressed in most somatic cells and play a central role in the process of adaptive immune response, capturing and presenting peptides on the cell surface. The region of the MHC molecule to which antigens are bound to be presented to T lymphocytes, thereby initiating the adaptive immune response, is known as the antigen recognition site (ARS). It is well established that ARS codons have higher non-synonymous than synonymous substitution rates on these three loci, consistent with an effect of balancing selection leading to greater variability in the functional region of the molecule that interacts with the peptide. The classical HLA genes have hundreds of alleles, and these constitute clades which group phylogenetically related and functionally similar alleles. Although there is no controversy about the existence of selection acting on HLA genes, there is no consensus on the relative importance of selection on allelic lineages and on individual alleles on the diversification of HLA alleles, and that was the question we decided to investigate. Our null hypothesis was that lineages were targets of selection and the alternative hypothesis was that the individual alleles were targets of selection during the evolutionary history of HLA genes. We sought, first, to make a validation of the method of inference dN/d>S using as a case study the ARS codons and their relation to the ability of inference. Of all the codons under selection we found, all (except one) are also in the classification of classical ARS codons or ±1 codon away from these, showing that there is evidence of selection at nearby sites to the ARS. Therefore, an expanded classification, which includes the codons under selection that are not commonly used in the ARS classifications, should increase the statistical power of selecion model tests on the HLA genes. By comparing the results obtained in phylogenetic analysis using data sets with or without recombinants, we found that the removal of recombinant alleles alters the parameter estimates, the identification of codons with evidence of selection and the significance of model comparison tests. Our analysis showed that ω is significantly higher for pairs of alleles from different lineages than for pairs of alleles from the same lineage and that there is a significant positive correlation between time of divergence of alleles and estimates of ω. We also verified that it is possible to reject a null model of one ω estimated for all branches of the phylogenetic tree and favor a model where ω is estimated separately for branches within and between lineages of HLA-C. In HLA-A and HLA-C, ω is significantly > 1 between lineages. We also show that, for these same loci, ω fis significantly greater than one or internal branches. In HLA-C, the model that estimates ω separately for terminal and internal branches was favored. Our results show that the intensity of selection between lineages is greater then within them. However, even within lineages, there is a strong evidence of deviation from neutrality, suggesting the action of natural selection.

Na gestação, a expressão das moléculas HLA-E ocorre principalmente nos trofoblastos extravilosos da placenta e estão associados com a inibição do sistema imune resultando na imunotolerância ao feto. Esta inibição da resposta imunológica pode ser benéfica em condições fisiológicas como a gestação, mas prejudicial na vigência de tumores e infecções. Nessa condição, tem sido descrito que o HIV infecta células trofoblásticas e utiliza a molécula HLA-E como mecanismo de escape, aumentando sua expressão para inibir a atuação de células citotóxicas. Entretanto, apesar da continua exposição viral, o fato de a maioria dos recém-nascidos não serem verticalmente infectados sugere a existência de barreiras naturalmente protetoras que previnem a transmissão materno-infantil (TMI) do HIV. Frente à escassez de estudos avaliando as moléculas HLA-E na interação imunológica materno-fetal, mais especificamente na infecção do HIV-1, e à importância que este tema tem perante a prevenção da TMI, este projeto teve o objetivo de avaliar a expressão de HLA-E em tecidos placentários de mulheres infectadas ou não pelo HIV-1. Trata-se de um estudo transversal, ao qual foram submetidos ao processamento imunohistoquímico tecido placentário parafinado de 106 mulheres infectadas pelo HIV-1 e de 100 mulheres não infectadas. A expressão da molécula HLA-E foi analisada por um patologista e classificada qualitativamente como leve, moderada ou intensa e quantitativamente como negativa (<5% de marcação), 1+ (6-25%), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%) e 4+ (>75%). Os resultados sociodemográficos apontam que as gestantes infectadas pelo HIV-1 eram mulheres não vivendo em união conjugal (p<0,0001) e com baixa escolaridade (p=0,0004). Na análise imunohistoquímica, ficou evidente que a expressão do HLA-E ocorreu principalmente na região do trofoblasto extraviloso e em células endoteliais, mas não nas vilosidades da placenta. Os testes de estatísticos utilizados foram Qui-quadrado e exato de Fisher. Os resultados mostraram que em mulheres portadoras da infecção pelo HIV-1, a expressão das moléculas HLA-E estava significantemente menor entre as que apresentavam carga viral indetectável (p=0,03), e não houve associação entre a expressão das moléculas HLA-E com outras condições como presença ou não da infecção pelo HIV, ocorrência de aborto em gestações anteriores, número de células CD4+ e terapia antirretroviral utilizada. Estes resultados sugerem que o HIV-1 induz a expressão de HLA-E em células placentárias, podendo ser utilizado como mecanismo de escape do sistema imunológico. Entretanto outros trabalhos com polimorfismos genéticos e microRNAs são necessários para ampliar o conhecimento sobre a molécula, sua atuação na infecção pelo HIV- 1 e seu papel na TMI / During pregnancy, the expression of HLA -E molecules occurs mainly in extravillous trophoblasts of the placenta and are associated with the inhibition of the immune system resulting in immune tolerance to the fetus. This inhibition of the immune response may be beneficial in physiological conditions such as pregnancy, but harmful in the presence of tumors and infections. In this condition, it has been reported that HIV infects trophoblast cells and uses the HLA -E as an escape mechanism, increasing its expression to inhibit the activity of cytotoxic cells. However, despite the continued viral exposure, the fact that most newborns are not vertically infected suggests the existence of naturally protective barriers that prevent mother to child transmission (MTCT) of HIV. Due to the lack of studies evaluating HLA-E in the maternal-fetal immunological interaction, specifically in HIV-1 infection, and the importance that this topic has towards the prevention of MTCT, this project aimed to evaluate the expression of HLA-E in placental tissues of infected women or not by HIV-1. It is a cross sectional study, which were submitted to immunohistochemical processing the paraffin- embedded placental tissue of 106 women infected with HIV-1 and 100 uninfected women. The expression of HLA-E was analyzed by a pathologist and classified qualitatively as mild, moderate or severe and quantitatively as negative (<5% markup), 1+ (6-25 %), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%) and 4+ (>75%). The sociodemographic results indicate that pregnant women infected with HIV-1 were not women living in marital union (p<0,0001) and have lower education (p=0,0004). In immunohistochemical analysis, it became evident that the expression of HLA-E occurred mainly in the extravillous trophoblast and endothelial cells, but not in the villi of the placenta. The statistical tests used were chi-square and Fisher exact tests. The results showed that in women with the HIV-1 infection, the expression of HLA-E was significantly lower among those who had undetectable viral load (p=0,03), and there was no association between the expression of HLA- E with other conditions such as the presence or absence of HIV infection, miscarriage in previous pregnancies, number of CD4+ cells and antiretroviral therapy used. These results suggest that HIV-1 induces the expression of HLA-E placental cells, using it as a mechanism to escape the immune system. However other studies with genetic polymorphisms and microRNAs are needed to increase knowledge about the molecule, its role in HIV-1 infeccion and its role in MTCT

Existem evidências de que o gene HLA-B, cujo produto tem como função a apresentação de peptídeos a linfócitos CD8+ e ligação a receptores KIR, esteja sob a ação da seleção natural. As populações nativas da América do Sul possuem uma grande quantidade de alelos de HLA-B exclusivos (endêmicos) em freqüências elevadas, enquanto que as populações nativas norte-americanas compartilham seus alelos com a Ásia. A hipótese elaborada para explicar a diferença de perfil alélico entre as populações norte e sul-americanas é conhecida como turnover de alelos. Segundo essa hipótese, os alelos exclusivos de ameríndios teriam aumentado de freqüência e substituído os ancestrais por apresentarem com eficiência os antígenos dos patógenos sul-americanos e/ou devido ao efeito de deriva genética, que provavelmente foi importante como conseqüência dos pequenos tamanhos efetivos populacionais. Esse processo teria ocorrido várias vezes, explicando as diferenças nos perfis alélicos entre as populações sul-americanas, cada uma das quais com um determinado conjunto de alelos endêmicos. Para verificar se as populações que possuem maiores freqüências de alelos endêmicos apresentam sinais da atuação da seleção natural, nós analisamos o polimorfismo do gene HLA-B em 474 amostras oriundas de 26 populações nativo-americanas e uma siberiana, quantificamos a freqüência de alelos endêmicos por população e região, e aplicamos os testes de neutralidade Ewens-Watterson e D de Tajima. Nós encontramos uma correlação positiva entre aumento da distância do Estreito de Bering e maior freqüência de alelos endêmicos (r2 = 0,351, p<0,01). Entretanto, essa correlação desapareceu quando excluímos as populações norte-americanas (r2 = 0,109, p>0,10), mostrando que a correlação é uma conseqüência das diferenças entre as populações localizadas na região neártica, que praticamente não possuem alelos endêmicos, e as populações neotropicais, que apresentam uma maior freqüência de alelos endêmicos. Esse resultado está de acordo com a hipótese de que há uma correlação entre o ambiente tropical e alterações do perfil alélico das populações ameríndias. O teste de D de Tajima mostrou desvios significativos de neutralidade, na direção de seleção balanceadora, ao longo de todo o continente (p<0,05), não havendo diferenças entre as populações com maiores ou menores freqüências de alelos endêmicos. Esse resultado é, provavelmente, conseqüência da captação de um sinal seletivo anterior à entrada no continente americano. Nossos resultados mostram que a composição de alelos endêmicos difere entre os grupos populações, e não entre as populações individuais. Portanto, é plausível que a seleção natural tenha promovido a substituição dos alelos asiáticos antes do estabelecimento das populações ameríndias individuais que conhecemos hoje. Essa hipótese está de acordo com a quase total ausência de populações desviando significativamente do esperado segundo o modelo neutro, quando aplicamos o teste de Ewens-Watterson, que ao contrário do D de Tajima, é menos afetado por eventos seletivos antigos. / The protein encoded by the HLA-B gene presentes antigenic peptides for immune recognition by T cells and interacts with killer cell immunoglobulin-like receptors. There is strong evidence that HLA-B is evolving under natural selection. South American Amerindians Populations have a great number of exclusive (endemic) HLA-B alleles in high frequency. These are alleles found in this geographic region, and nowhere else in the world. Differently, Native North American Populations have the same alleles as those found in Asians. The allelic turnover hypothesis was proposed to explain these findings. According to this model, the endemic South American alleles reached high frequencies and replaced the old ones under pathogen driving selection and/or strong genetic drift. It is likely that the allelic turnover occurs several times in the history of South Americans Populations, explaining the differences in endemic alleles present in each populations. It is plausible that Native Americans Populations with evidence of allelic turnover were under a strong selective pressure. To test this hypothesis we analyzed the HLA-B gene in 474 individuals from 26 Native American and one Siberian Populations. We described the endemic alleles frequencies for each population and applied the Ewens-Watterson and Tajimas D tests of neutrality. We found a positive correlation between distances from the Behring Strait and on increase in the frequency of the endemic alleles (r2 = 0.351, p<0.01). However, significance was lost when the North Americans Populations werw removed (r2 = 0.109, p>0.10), showing that the correlation was driven by differences between the Neartic Populations (low frequency of endemic alleles) and Neotropical Populations (high frequency of endemic alleles). This observation is in agreement with the hypothesis of correlation between the tropical environment and the shift in the allelic composition observed in Native Latin American Populations. Our results of Tajimas D showed deviations compatible with the action of balancing selection in populations in all the Americas. It is likely that this signal was generated before the colonization of the continent, probably with no correlation with the increase of the endemic alleles frequencies. We observed similarities in the endemic allelic composition of populations located at specific regions (eg, Amazonia or South Mexico) which is likely an effect of their common ancestry Only two populations deviated significantly from neutrality when we applied the Ewens-Watterson test (a less powerful test for ancient selective or demographic effects than Tajimas D). These results are compatible with selection favoring the endemic alleles in the past, before the establishment of the individual populations, whose demographic histories resulted in patterns of variation compatible with neutrality.

Os genes HLA (Antígenos leucocitários humanos) estão localizados no Complexo Principal de Histocompatibilidade humano (o MHC), e possuem os maiores níveis de variação do genoma, com milhares de alelos, altas taxas de heterozigose e diversidade nucleotídica. No presente estudo, nosso objetivo foi a identificação dos principais alvos da seleção natural nos genes HLA. Para isso, propusemos duas abordagens que resultaram na redação de dois manuscritos. Na primeira abordagem, nós testamos a hipótese de que os principais alvos da atuação da seleção natural nas moléculas HLA seriam os aminoácidos que compões os sítios que ancoram os peptídeos antigênicos (os bolsões B e F da região de ligação de peptídeos (PBR)). Para isso, utilizamos um conjunto de dados de 6.435 e 6.409 indivíduos genotipados para os genes HLA-A e -B respectivamente, gerados para o 13º Workshop Internacional de Histocompatibilidade (IHW) e pertencentes a 55 populações espalhadas por todos os continentes. Nós estimamos a diversidade nucleotídica (&PI;) das sequências que codificam para os bolsões B e F e comparamos esses dados com os obtidos de outros bolsões da PBR. Concomitantemente, utilizamos a classificação de alelos dos locos HLA-A e -B em supertipos, que são agrupamentos alélicos com similaridades nos perfis de ligação de peptídeos, devido a semelhanças em aminoácidos específicos dos bolsões B e F. Nós descrevemos os padrões observados de variação dos supertipos e desenvolvemos um teste de hipótese onde comparamos os estimadores observados de diferenciação populacional (Gst) e diversidade genética (taxa de heterozigose (He) e número de alelos (k)) com os obtidos a partir de 10.000 réplicas constituídas por agrupamentos aleatórios de alelos. O bolsão B foi a região que apresentou os maiores níveis de diversidade no gene HLA-B (p <0,00001, teste de soma de ranques de Mann-Whitney) e boa parte de sua variação está estruturada entre os supertipos desse mesmo loco. Além disso, os padrões observados de variação nos supertipos de HLA-B não foram reproduzidos pelos agrupamentos aleatórios de alelos (com 98 % das simulações apresentando valores de Gst menores do que os observados, utilizando as amostras africanas, europeias e asiáticas). Esse resultado indicou que os supertipos e consequentemente as especificidades do bolsão B estão significativamente estruturas entre as populações, um indicativo de adaptações locais aos patógenos específicos de diferentes regiões geográficas. Esses mesmos padrões não foram reproduzidos na análise do loco HLA-A, pois boa parte da variação no PBR desse gene não está localizada nos bolsões B e F. Além disso, as simulações envolvendo os supertipos de HLA-A reproduziram mais frequentemente os padrões observados de variação, indicando que os bolsões B e F não são os principais alvos da seleção nesse gene, ou que os níveis de seleção em HLA-A sejam menores dos atuantes em HLA-B. Na segunda abordagem, o nosso principal objetivo foi a identificação de genes que contribuíram para a adaptação local das populações nativas das Américas, que teria ocorrido durante o recente processo de colonização desse continente. Nós sequenciamos os exons 2 e 3 dos loci de classe I HLA-B e -C e o exon 2 do loco de classe II -DRB1 em 635, 524 e 568 indivíduos, respectivamente, pertencentes a 32 populações nativas do continente Americano. Os dados de sequência foram utilizados na estimativa das frequências alélicas, taxa de heterozigose (He), grau de compartilhamento de alelos entre populações (medido pela distância de Prevosti) e desvios de neutralidade utilizando o teste D de Tajima. Nós também comparamos os padrões de variação das taxas de heterozigose obtidas a partir dos loci HLA ao longo do continente com os obtidos a partir de um conjunto de 61 microssatélites espalhados ao longo do genoma, permitindo-nos a diferenciação dos padrões provavelmente gerados pela história demográfica ou seleção natural. O loco HLA-B apresentou o maior número de pares de populações em que não observamos compartilhamento de alelos (44 pares contra 4 e 6 para os loci HLA-C e -DRB1, respectivamente) sendo que a região leste da América do Sul (SAE) foi a que apresentou os menores níveis de compartilhamento de alelos com outras regiões das Américas (39 dos 44 pares de populações continham uma população SAE). Essa maior diferenciação do gene HLA-B nas populações SAE é uma consequência da presença de alelos exclusivos dessa região, originados por eventos de conversão genica e/ou recombinação envolvendo alelos presentes em outras regiões do continente. As populações SAE também apresentaram níveis elevados de variação para o gene HLA-B, resultado evidenciado pela falta de correlação entre a diminuição da taxa de heterozigose e o aumento da distância em relação ao Estreito de Bering (r2 = -0,1117, p > 0,05), o que contrasta com a tendência geral observada nos microssatélites e genes HLA -C e -DRB1 (r2 = -0,1957, -0,2261 e -0,2637, respectivamente (p < 0,05)). Finalizando, as populações SAE apresentaram valores de D de Tajima maiores (p <0,001, teste de soma de ranques de Mann-Whitney) e mais significativos (p < 0,0000005, aplicando um teste binomial exato) no loco HLA-B, quando comparadas às populações das outras regiões. Essas diferenças entre regiões geográficas não foram observadas nos genes HLA-C e -DRB1, corroborando a explicação seletiva para o aumento da frequência dos alelos de HLA-B originados por conversão gênica/recombinação em resposta aos novos desafios ambientais das regiões tropicais na América do Sul. As conclusões obtidas a partir de ambas as abordagens do presente trabalho apontam o gene HLA-B como o principal alvo da seleção natural, uma vez que esse loco concentra as maiores evidências de atuação de seleção natural recente quando comparado aos demais genes HLA analisados. Nós também demonstramos com as análises intragênicas que o bolsão B do PBR de HLA-B concentra por boa parte das diferenças observadas entre as populações, implicando em diferenças nos perfis de apresentação de peptídeos entre essas mesmas populações, o que pode ser interpretado como um indicativo de adaptações locais aos conjuntos de patógenos presentes em distintas regiões geográficas / The Classical HLA genes (Human Leucocyte Antigens) are located in the human Major Histocompatibility Complex (the MHC) and present the highest levels of variation on the Human genome, with thousands of alleles associated with high levels of heterozygosis and nucleotide diversity. In the present study, our goal was the identification of the main targets of natural selection on the HLA genes. We proposed two different approaches to address this issue resulting in two manuscripts. At the first approach, we performed an intragenic analysis, verifying if the amino acids at the peptide-binding region (PBR) anchor positions (the B and F pockets) exhibit higher evidences of evolution under natural selection when compared with the remaining regions of the HLA molecules. To do so, we used a dataset generated for the 13th International Histocompatibility Workshop (IHW), composed by 6,435 and 6,409 individuals genotyped for HLA-A and -B respectively, belonging to 55 populations scattered along all the continents. We measured the levels of nucleotide diversity (&pi;) of the sequences coding for the B and F pockets and compared them with the remaining PBR pockets. Concomitantly, we applied the supertype classification which consists in groups of HLA-A and -B alleles which bind overlapping sets of peptides, as a consequence of sharing specific amino acids at B and F pockets and described the patterns of supertype variation in the observed data. Next, we developed a hypothesis test in which the observed patterns of population differentiation (Gst) and variability (heterozygosity (He) and number of alleles (k)), using the supertype definition, were compared with 10,000 replicates of random assigned groups of alleles. At the HLA-B locus, the B pocket presented the highest levels of variation (p < 0.00001, Wilcoxon rank sum test) and concentrated most of the differences between supertypes. Our simulations results revealed that the reassignment of alleles into random groups could not reproduce the observed patterns of population differentiation (with 98% of the simulations presenting Gst values smaller than the observed, using the African, European and Asiatic samples), indicating that supertypes and more specifically the B pocket specificities are significantly structured among populations, which could be an indicative of adaptations to local pathogens. We did not observe the same patterns at the HLA-A locus which presented relative lower levels of variation at B and F pockets when compared with the remaining PBR regions, and simulated values of Gst and He which often reproduced the observed data. At the second approach, our main objective was the identification of genes that contributed for local adaptation on Native American Populations because of the relatively recent colonization of the new American environments. We sequenced the exons 2 and 3 of the HLA-B and -C class I loci and the exon 2 of the -DRB1 class II locus in 635, 524 and 568 individuals, respectively, belonging to 32 different Native American Populations scattered along all the Americas. We estimated the allele frequencies, expected heterozygosity (He), degree of allelic sharing between populations (measured by the Prevost\'s Distance) and departure from neutral expectation using the Ewens-Watterson (EW) and Tajima\'s D test. Concomitantly, we used a dataset of 61 microsatellites scattered along the genome as a demographic control, comparing the degree of variation of the heterozygosity along the continent. The HLA-B locus showed the highest number of pairs of populations in which we did not observe any sharing of alleles (44 pairs against 4 and 6 for HLA-C and -DRB1 loci, respectively) and the Eastern South American (SAE) region was the one presenting the smallest levels of allelic sharing with other American regions at this locus (39 out the 44 pair of populations contained a SAE population). The presence of exclusive gene conversion and/or recombination alleles accounts for the higher differentiation of SAE populations at the -B locus. The -B locus also exhibited a higher level of variation at SAE populations which was evidenced

O MHC é uma região genômica que contém genes de papel central na resposta imune adaptativa. Genes do MHC e, particularmente, genes HLA em humanos, estão envolvidos susceptibilidade e resistência a doenças infecciosas, na predisposição a doenças autoimunes e na rejeição de órgãos transplantados. Essas descobertas incentivaram uma série de estudos sobre padrões da variabilidade genética em genes HLA, que demonstraram possuir uma variação bastante distinta da expectativa neutra. Essa contundente evidência de seleção natural, ímpar no genoma humano, levanta uma série de perguntas a respeito das forças evolutivas específicas que agem nesses genes e as implicações genômicas para a evolução da região como um todo. O presente estudo investiga como a seleção natural afeta e é afetada pela diversidade de genes que estão ligados fisicamente a outros que constituem alvos de seleção. Nossa expectativa é que seleção balanceadora forte sobre genes HLA interfere na eficácia com que a seleção purificadora remove variantes deletérias em loci próximos. Especificamente, a partir da anotação funcional de variantes genéticas, testamos se grupos de genes ligados fisicamente aos genes HLA apresentam uma diversidade mais alta do que seria esperado na ausência de seleção balanceadora e de carona genética causada por ela, e se essa diversidade é enriquecida com variantes possivelmente deletérias. Por meio da análise de razão entre polimorfismos não-sinônimos e sinônimos (e diversas outras estatísticas relacionadas), fomos capazes de observar que loci próximos a genes HLA acumulam um excesso de variação não-sinônima (e portanto potencialmente deletéria). O grau de deleteriedade foi confirmado pelo emprego do software Polyphen 2, que utiliza como critério de classificação a conservação das sequências nucleotídicas e informação das estruturas protéicas, e pela análise de estatísticas como Pdel/Pn e Pdel/Ps. De acordo com testes de McDonald-Kreitman e o Índice de Neutralidade, entretanto, parte dessa variação deletéria se fixa em longo prazo, o que sugere que a seleção em genes HLA pode interferir tanto nos padrões de polimorfismos como de divergência / The MHC is a genomic region that contains genes with a central role in the adaptive immune response. Genes in the MHC region, in particular the HLA genes of humans, are involved in the differential susceptibility and resistance to infectious diseases, predisposition to autoimmune diseases and the rejection of transplanted organs. These findings have fueled a series of studies on patterns of genetic variation at HLA genes, which have conclusively demonstrated that their variation deviates from neutral expectations. Such strong evidence of natural selection, with few counterparts in the remainder of the human genome, raise a series of questions concerning the specific evolutionary forces acting on this region and their genomic implications for the evolution of the region as a whole. This work investigates how natural selection affects and is affected by the diversity of genes that are physically linked to those that are units of selection. Our expectation is that strong selection on HLA genes may interfere with the efficacy of selection in removing deleterious variants at closely linked loci. Specifically, by using functional annotations of genetic variants, we test whether sets of genes physically linked to the strongly selected HLA loci show a higher diversity than would be expected in the absence of balancing selection and genetic hitchhiking caused by it, and if this diversity is enriched for putatively deleterious variants. By analyzing the ratio of nonsynonymous to synonymous polymorphisms (and several related statistics) we were able to show that loci close to HLA genes are harboring an excess of nonsynonymous (and hence potentially deleterious) variation. The deleteriousness was confirmed by employing Polyphen 2 - a software that uses nucleotide sequence conservation and protein structure information to classify variants as deleterious or not - and computing statistics such as Pdel/Pn and Pdel/Ps. According to McDonald-Kreitman tests and the Neutrality Index, however, part of this putatively deleterious variation reaches fixation over long timespans, suggesting that selection at the HLA genes may be interfering with both the transient patterns of polymorphism and substitution processes

Na gestação, a expressão das moléculas HLA-E ocorre principalmente nos trofoblastos extravilosos da placenta e estão associados com a inibição do sistema imune resultando na imunotolerância ao feto. Esta inibição da resposta imunológica pode ser benéfica em condições fisiológicas como a gestação, mas prejudicial na vigência de tumores e infecções. Nessa condição, tem sido descrito que o HIV infecta células trofoblásticas e utiliza a molécula HLA-E como mecanismo de escape, aumentando sua expressão para inibir a atuação de células citotóxicas. Entretanto, apesar da continua exposição viral, o fato de a maioria dos recém-nascidos não serem verticalmente infectados sugere a existência de barreiras naturalmente protetoras que previnem a transmissão materno-infantil (TMI) do HIV. Frente à escassez de estudos avaliando as moléculas HLA-E na interação imunológica materno-fetal, mais especificamente na infecção do HIV-1, e à importância que este tema tem perante a prevenção da TMI, este projeto teve o objetivo de avaliar a expressão de HLA-E em tecidos placentários de mulheres infectadas ou não pelo HIV-1. Trata-se de um estudo transversal, ao qual foram submetidos ao processamento imunohistoquímico tecido placentário parafinado de 106 mulheres infectadas pelo HIV-1 e de 100 mulheres não infectadas. A expressão da molécula HLA-E foi analisada por um patologista e classificada qualitativamente como leve, moderada ou intensa e quantitativamente como negativa (<5% de marcação), 1+ (6-25%), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%) e 4+ (>75%). Os resultados sociodemográficos apontam que as gestantes infectadas pelo HIV-1 eram mulheres não vivendo em união conjugal (p<0,0001) e com baixa escolaridade (p=0,0004). Na análise imunohistoquímica, ficou evidente que a expressão do HLA-E ocorreu principalmente na região do trofoblasto extraviloso e em células endoteliais, mas não nas vilosidades da placenta. Os testes de estatísticos utilizados foram Qui-quadrado e exato de Fisher. Os resultados mostraram que em mulheres portadoras da infecção pelo HIV-1, a expressão das moléculas HLA-E estava significantemente menor entre as que apresentavam carga viral indetectável (p=0,03), e não houve associação entre a expressão das moléculas HLA-E com outras condições como presença ou não da infecção pelo HIV, ocorrência de aborto em gestações anteriores, número de células CD4+ e terapia antirretroviral utilizada. Estes resultados sugerem que o HIV-1 induz a expressão de HLA-E em células placentárias, podendo ser utilizado como mecanismo de escape do sistema imunológico. Entretanto outros trabalhos com polimorfismos genéticos e microRNAs são necessários para ampliar o conhecimento sobre a molécula, sua atuação na infecção pelo HIV- 1 e seu papel na TMI / During pregnancy, the expression of HLA -E molecules occurs mainly in extravillous trophoblasts of the placenta and are associated with the inhibition of the immune system resulting in immune tolerance to the fetus. This inhibition of the immune response may be beneficial in physiological conditions such as pregnancy, but harmful in the presence of tumors and infections. In this condition, it has been reported that HIV infects trophoblast cells and uses the HLA -E as an escape mechanism, increasing its expression to inhibit the activity of cytotoxic cells. However, despite the continued viral exposure, the fact that most newborns are not vertically infected suggests the existence of naturally protective barriers that prevent mother to child transmission (MTCT) of HIV. Due to the lack of studies evaluating HLA-E in the maternal-fetal immunological interaction, specifically in HIV-1 infection, and the importance that this topic has towards the prevention of MTCT, this project aimed to evaluate the expression of HLA-E in placental tissues of infected women or not by HIV-1. It is a cross sectional study, which were submitted to immunohistochemical processing the paraffin- embedded placental tissue of 106 women infected with HIV-1 and 100 uninfected women. The expression of HLA-E was analyzed by a pathologist and classified qualitatively as mild, moderate or severe and quantitatively as negative (<5% markup), 1+ (6-25 %), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%) and 4+ (>75%). The sociodemographic results indicate that pregnant women infected with HIV-1 were not women living in marital union (p<0,0001) and have lower education (p=0,0004). In immunohistochemical analysis, it became evident that the expression of HLA-E occurred mainly in the extravillous trophoblast and endothelial cells, but not in the villi of the placenta. The statistical tests used were chi-square and Fisher exact tests. The results showed that in women with the HIV-1 infection, the expression of HLA-E was significantly lower among those who had undetectable viral load (p=0,03), and there was no association between the expression of HLA- E with other conditions such as the presence or absence of HIV infection, miscarriage in previous pregnancies, number of CD4+ cells and antiretroviral therapy used. These results suggest that HIV-1 induces the expression of HLA-E placental cells, using it as a mechanism to escape the immune system. However other studies with genetic polymorphisms and microRNAs are needed to increase knowledge about the molecule, its role in HIV-1 infeccion and its role in MTCT

Seleção balanceadora é definida como aquela que aumenta a variabilidade genética de populações em relação ao esperado sob neutralidade. Uma expectativa sobre seus efeitos é a redução da diferenciação populacional nos genes onde atua. Contudo, regimes que mantêm conjuntos distintos de alelos em diferentes populações poderiam resultar em aumento de diferenciação populacional. Com o objetivo de compreender melhor os efeitos da seleção balanceadora sobre a distribuição da variação genética entre populações, investigamos a diferenciação populacional em genes dos Antígenos Leucocitários Humanos (HLA, do inglês, Human Leukocyte Antigen), que são os genes mais polimórficos do genoma humano e o exemplo mais clássico de seleção balanceadora em humanos. As proteínas HLA são responsáveis pela apresentação de peptídeos aos linfócitos T, mediando uma etapa crítica da resposta imune. A vantagem da manutenção de variação nesses genes está possivelmente associada à capacidade de resposta a uma maior diversidade de patógenos. Neste estudo, analisamos dados do projeto 1000 Genomas (1000G), que sequenciou indivíduos de diferentes populações usando sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês, Next Generation Sequencing). Essa técnica de sequenciamento é conhecidamente problemática quando aplicada a regiões altamente polimórficas, como os genes HLA. Por isso, avaliamos a confiabilidade dos genótipos e frequências alélicas estimados a partir dos dados do 1000G nos genes HLA, utilizando como padrão ouro dados de sequenciamento Sanger de 930 das 1092 amostras do 1000G. Encontramos um viés de superestimativa da frequência do alelo referência em alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, do inglês, Single Nucleotide Polimorphisms), indicando que viés de mapeamento é uma causa importante de erros nos dados do 1000G. Esses resultados são relevantes para a compreensão dos desafios do uso de dados de NGS em outras regiões de alta diversidade. Usando os resultados dessa análise, excluímos de nosso estudo de diferenciação populacional sítios com estimativas de frequências alélicas pouco confiáveis nos dados do 1000G. Em uma segunda etapa de controle metodológico, demonstramos o efeito do uso de dados ricos em variantes raras em estudos de diferenciação populacional. Controlando para esse efeito, e usando apenas sítios que demonstramos ser confiáveis em nossos dados, descobrimos que a diferenciação populacional de SNPs nos genes HLA é menor que a diferenciação de SNPs em outras regiões do genoma. Esse resultado aponta para um papel predominante de pressões seletivas globais na distribuição da variação genética de HLA entre populações. Contudo, apresentamos também evidências de que a diferenciação populacional de haplótipos nos genes HLA pode ser maior do que a observada no nível dos SNPs, sugerindo que pressões locais podem influenciar a distribuição de haplótipos entre populações. Nossos achados indicam que é possível reconciliar baixa diferenciação populacional em SNPs com maior diferenciação em haplótipos, possivelmente sujeitos a pressões seletivas locais. / Balancing selection is defined as any kind of selective regime that increases genetic variability in populations relative to what is expected under neutrality. Theory predicts that balancing selection reduces population differentiation. However, balancing selection regimes in which different sets of alleles are maintained in different populations could increase population differentiation. To better understand the effects of balancing selection on the distribution of genetic variation among populations, we investigated population differentiation at the Human Leukocyte Antigen (HLA) genes, which are the most polymorphic genes in the human genome, and constitute the most striking example of balancing selection in humans. The HLA molecules are responsible for the presentation of peptides to T cells, thus mediating a critical step of the immune response. The advantage of maintaining variation in those genes through balancing selection is possibly related to the increased ability of the immune system to respond to a wider variety of pathogens. In this study, we analysed the public dataset of the 1000 Genomes project (1000G), which sequenced 1092 individuals from different populations using Next Generation Sequencing (NGS) technologies. These sequencing techniques are known to be problematic when applied to highly polymorphic genomic regions, such as the HLA genes. Therefore, we evaluated the reliability of genotype calls and allele frequency estimates of the SNPs reported by 1000G at HLA genes, using Sanger sequencing data of 930 of the 1092 1000G samples as a gold standard. We found a bias towards overestimation of reference allele frequency for some single nucleotide polymorphisms (SNPs), indicating mapping bias is an important cause of error in frequency estimation in the 1000G data. These results provide insights into the challenges of using of NGS data at other genomic regions of high diversity. Using the results of this analysis, we selected a list of sites that have reliable allele frequency estimates in the 1000G data to be used in our population differentiation study. In another methodological control, we demonstrate the effect of using a dataset rich in rare variants in population differentiation studies. Controlling for this effect, and using only the sites which we demonstrated that were reliable, we found that population differentiation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) at the HLA genes is lower than that of SNPs in other genomic regions. This suggests a predominant role of global selective pressures in shaping the distribution of variation at the HLA genes among populations. However, we also show evidence that population differentiation of HLA haplotypes may be higher than what we observe at the SNP level, suggesting that local selective pressures may influence the distribution of haplotypes among populations. Altogether, our results indicate that it is possible to reconcile low population differentiation at the SNP level - as predicted by theory - to higher differentiation at haplotypes, which are possibly under local selective pressures.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1996. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves: [167]-204). Also available on the Internet.