Monoclonal RhD antibodies (anti-RhD) may potentially be used in preventing Rh alloimmunisation of women delivering RhD-positive babies, and thereby preventing haemolytic disease of the newborn (HDN). Binding and molecular analyses were performed on a range of monoclonal anti-RhDs to understand the interaction between the antibody and antigen. A flow cytometry (FCM) assay system was developed to analyse the binding of the anti-RhD to human group O R₁R₂ red blood cells (RBC). A panel of 30 anti-RhD preparations were studied using this assay and Vmax (maximum binding) and KD (equilibrium constant) were determined for each antibody. The antibodies were categorised into 3 groups (low, medium and high binders) according to their Vmax. Furthermore, the Vmax was converted to the number of antibody molecules bound per RBC (NMBR) by using a correlation curve generated from running parallel FCM and radioiodination assays (RIA). Scatchard analysis of the RIA data indicated that the total NMBR for O R₁R₂ RBC was 27,300 antigen sites/cell. Molecular analysis involved cloning and sequencing of 11 anti-RhD. Heavy chains (HC) preferentially used gene segments from the VH3 and VH4 families, and kappa chain (κ LC) usage was restricted to DPK9. Four sets of antibodies, showed restricted D gene segments (encode part of the HCDR3) which indicated possible importance for epitope specificity. Analysis of V gene sequence indicated that common VH and VL pairings were found used by the medium binders. The high and low binders had unique VH and VL pairings, although the high binders also showed greater somatic mutations from their respective germline genes. It was concluded that the fit of the antibody to the RhD antigen is dependent on both the VH and VL usage and pairing, and that the precise epitope specificity of these antibodies may require HCDR3 interaction.

Nors yra žinoma, kad pacientams, kuriems neseniai atliktos eritrocitų transfuzijos, kraujo grupių nustatymo hemagliutinacijos reakcija rezultatai gali būti nepatikimi dėl kraujyje cirkuliuojančių donoro ertrocitų, tačiau literatūroje nėra aiškių rekomendacijų, kuriais atvejais reikėtų naudoti molekulinius tyrimo metodus. Serologinis Duffy ir Kidd sistemų antigenų ir antikūnų prieš juos nustatymas – viena svarbiausių imunohematologinių problemų transfuzinėje medicinoje. Šiame darbe pirmą kartą Lietuvoje atlikti moksliniai tyrimai imunohematologijos srityje ir panaudoti genetiniai Duffy ir Kidd antigenų sistemų tyrimo metodai. Siekiant įvertinti Duffy ir Kidd antigenų sistemų fenotipavimo ir genotipavimo reikšmę, mes nagrinėjome klinikinių, demografinių, imunohematologinių bei su transfuzija susijusių veiksnių įtaką tyrimų rezultatams. Mūsų tyrimo metu nustatytas didesnis nei 30 proc. nesutapimų dažnis tarp Duffy ir Kidd antigenų sistemų fenotipavimo ir genotipavimo rezultatų patvirtino genetinių tyrimų naudą, atliekant dažnas eritrocitų transfuzijas. Atliekant šį darbą, pirmą kartą Lietuvoje nustatytas Duffy ir Kidd antigenų sistemų fenotipų paplitimas. Nustatytas laiko tarpas, per kurį įprastai klinikinėje praktikoje naudojamų serologinių tyrimų (hemagliutinacijos reakcijos) rezultatai gali būti patikimi, bei pateiktos atitinkamos rekomendacijos didina šio tyrimo praktinę vertę ir yra novatoriška šiuolaikinėje transfuzinėje medicinoje. / Accurate phenotyping of multitransfused patients is often complicated - mostly due to the presence of circulating transfused donor’s RBCs in the recipient’s blood, leading to discrepancies in the assessment of test results. The question when genotyping including Duffy and Kidd systems should be used for patients undergoing chronic RBC transfusions is still being discussed. Serological testing and evaluation of the antigens and antibodies of Duffy and Kidd systems are among the main problems in multitransfused patients. The research on immunohematology and blood group genetics has been caried out for the first time in Lithuania. A high rate (more than 30%) of disagreements between the results of phenotyping and genotyping in our study demonstrates the benefit of DNA-based testing for chronically-transfused patients. In order to estimate the value of phenotyping and genotyping of Duffy and Kidd antigen systems in patients undergoing long-term RBC transfusions, the impact of demographic, clinical, immunohaematological or transfusion-related factors, on the discrepancy of the results, was investigated. Time frame that could be appropriate to obtain reliable results of conventionaly used serologic tests (hemmagglutination reaction) after the last transfusion was established as well as appropriate recommendations were made. We believe that these studies could be helpful for clinical practice as well as in decreasing the risk of transfusion of red blood cells.

Blood transfusion is a very common procedure. Before a blood transfusion it is important to find compatible blood for the patient. If the blood is incompatible with that of the patient a transfusion reaction may occur, which can be mortal. It is also important to avoid alloimmunisation. Alloimmunisation occurs when antibodies are produced against a specific antigen. These antibodies are called irregular antibodies and they can be produced after a transfusion, pregnancy, or transplantation. Alloimmunisation makes it harder to find compatible blood for patients in the future and it is a major concern for patients who require blood transfusions repeatedly. By phenotyping erythrocyte antigens, it is easier to find compatible blood for patients before a blood transfusion. Until now, a manual method has been used for phenotyping erythrocyte antigen at the Sundsvall County hospital and an automatization of this method was desired. For this study, 99 anonymised blood doner tests were used. The erythrocyte antigens M, Jka, Jkb, Fya, Fyb, S and s were phenotyped both manually and automated with ORTHO Vision Analyzer. A Clopper Pearson test was used to evaluate the accordance between the methods. A comparison was also made in regard totime and cost. The results showed a good accordance between the methods. The automated procedure using ORTHO Vision has several advantages over the manual procedure using gel cards. The risk of errors is reduced, there are fewer manual steps, it is faster and the personnel can do other tasks while the instrument is processing the tests.

Le potentiel régulateur des lymphocytes B (LB), largement associé avec la production d’interleukine-10 (IL-10), a été mis en évidence dans des modèles murins de pathologies spécifiques d’Ag. Les cellules B transitionnelles (Tr.) CD24fortes CD38fortes ont été décrites comme régulatrices, au travers de la production d’IL-10, de l’inhibition de la prolifération T, ainsi que de la suppression de la réponse inflammatoire des cellules T. Les LB transitionnels représentent un stade de développement central dans la maturation des cellules B, en faisant le lien entre les cellules immatures de la moelle osseuse et celles matures situées dans les organes lymphoïdes secondaires. Dans une première étude, nous montrons que cette population est hétérogène, et composée de LB Tr. de type 1 (T1), T2, T3 et Tr. CD27+. Les LB T3 anergiques semblent jouer un rôle dans la tolérance périphérique en limitant la prolifération des lymphocytes T (LT) CD4+, tandis que les LB Tr. CD27+ IL-10+ nouvellement décrits inhibent la différenciation des LT CD4+ en cellules productrices d’IFN-γ et de TNF-α. Notons que les LB T1 et Tr. CD27+ se différencient rapidement en cellules productrices d’Ac suite à la reconnaissance de signaux de l’immunité innée. La production d’IL-10 est en partie dépendante des signaux perçus, provenant du microenvironnement. Nous avons décrit dans un second travail que les LB s’adaptent aux cellules avec lesquelles ils sont cultivés. En effet, les cellules B régulent spécifiquement les LT CD4+ mémoires (et non naïfs), en limitant leur prolifération avant d’induire une mort cellulaire. Ces caractéristiques fonctionnelles pourraient être associées avec une modification du programme transcriptionnel, permise par la plasticité des cellules B, qui se polarisent en LB régulateurs (Breg) de façon ciblée. L’expression des gènes PRDM1 et IL10 serait associée avec une signature Breg spécifique en culture mixte autologue, en opposition avec celle des gènes NFκB1 et BCL6. La transplantation rénale est un excellent modèle physiopathologique, pour étudier l’importance de certaines populations de LB dans la tolérance immunologique. L’étude BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) nous a permis de confirmer que les LB Tr. ont probablement un rôle important dans cette tolérance du greffon. La présence d’anticorps spécifiques du donneur (DSA) semble limiter l’émergence des LB Tr., même si le pourcentage de cellules B CD24fortes CD38fortes n’est a priori pas associé avec la capacité du compartiment lymphocytaire B à réguler la prolifération des cellules T des patients alloimmunisés. / Regulatory B cells (Breg) were first reported to be interleukine-10 (IL-10) producing B cells in mice. The almost concurrent discovery of Breg cells drew interest toward potential links with transitional B cells because of phenotypic and functional similarities. In addition with IL-10 production, CD24high CD38high transitional B cells limit the proliferation of T cells and the polarization of CD4+ T cells into Th1 cells. Transitional B cells represent a central developmental stage in B-cell maturation, linking generation in the bone marrow with differentiation in periphery. In a first study, we reveal for the first time that human transitional B cells encompass not only transitional type 1 and type 2 B cells, but also distinct anergic type 3 B cells, as well as IL-10-producing CD27+ transitional B cells. Interestingly, the latter two subsets differentially regulate CD4+ T-cell proliferation and polarization toward Th1 effector cells. Additional experiments showed that type 1 and CD27+ transitional B cells are capable to differentiate into antibody secreting cells after toll-like receptor 9 engagement. In a second work, we wanted to explore the ability of B cells to target T-cell populations. We demonstrate that B cells can be suppressive cells. B cells are capable to target CD4+ memory T-cell, limiting the proliferation and inducing the death of this T-cell population. At the opposite, B cells seem to be effector of CD4+ naïve T-cell functions. These properties are probably associated with a specific transcriptional program. Thus, we observed that suppressive B cells overexpress PRDM1 and IL10, whereas effector B cells preferentially express BCL6 and NFκB1 in in vitro mixed culture. In the last part, we worked on B-cell phenotype and functions in transplanted patients. BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) is a clinical study that aims to better understand the role of B cells in the alloimmunisation and the chronic rejection occurring after renal transplantation. Donor specific antibodies (DSA) seem to limit the expansion of transitional B cells, which are probably not associated with the ability of B cells to regulate T-cell proliferation in DSA+ patients.

Les molécules HLA de class Ib ou nonclassiques, HLA-G, -E et -F, sont impliqués dans la régulation de la tolérance immunologique. En particulier, les polymorphismes génétiques ainsi que l’expression différentielle de HLA-G sont corrélés à l’évolution clinique des pathologies inflammatoires et des greffes d’organe. Notre premier travail a permis de montrer que la structure génétique de HLA-G était conservée dans des populations au patrimoine génétique différent (Mali et Sud de la France) et que, les haplotypes résultants (UTR), étaient corrélés à l’expression différentielle d’HLA-G soluble. Dans une deuxième étude on a pu montrer l’association différentielle des haplotypes HLA-G UTR avec certain allèles HLA-E, -A, -H, -G et -F suggérant une interaction privilégiée et/ou un effet tolérant synergique entre ces molécules. Une troisième étude a mis en évidence que deux haplotypes HLA-G UTR étaient corrélé à une évolution clinique péjorative dans la mucoviscidose et dans la transplantation pulmonaire. En fin, on a pu montrer une expression différentielle des isoformes de HLA-G dans les cellules épithéliales bronchiques (CEB), redifférencié in vitro, de témoins sains et patients atteints d’asthme avec une expression diminuée chez les asthmatiques. Finalement, l’ensemble de ces données suggèrent que la molécule HLA-G peut être un biomarqueur génétique et/ou sérologique attrayant et une cible thérapeutique potentielle via la modulation de son effet tolérogène dans un contexte de pathologies inflammatoires ou de conflit immunologique, tel que la transplantation d’organe et la transfusion. / HLA nonclassical class Ib genes HLA-G, -E and -F are involved in managing immune tolerance. Particularly for HLA-G, both its genetic polymorphism and its expression are correlated to clinical outcome in different pathologies, particularly in inflammatory disease and organ transplantation. In our first work we have shown that HLA-G genetic structure was conserved in distant healthy populations (Mali and South France) and that, the resulting haplotypes (UTR) were correlated to sHLA-G differential expression. In another study we observed a differential association between HLA-G UTR haplotypes and specific HLA-E, -A, -H, -F alleles that might reflect a privileged interaction and/or a synergistic tolerant effect between these molecules In a third study we showed that two different HLA UTR haplotypes were respectively associated with a worse evolution of cystic fibrosis and an impaired survival in lung transplant recipients. Afterwards, the analysis HLA-G isoforms expression in normal, mild and severe asthmatic human bronchial epithelial cells redifferentiated in vitro showed that the level of these transcripts was significantly reduced in asthmatics compared to controls. In conclusion, these results suggest that HLA-G molecule might be an attractive genetic and/or serologic biomarker and a potential therapeutic target, via the modulation of its tolerogenic effect, in specific allogenic and inflammatory contexts, such as solid organ transplantation or blood transfusion.

Une méthode de réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (t-PCR), permettant de déterminer dès 12 semaines d'aménorrhée (SA) le statut RhD dun foetus à partir d'ADN libre dans le plasma maternel, a été mise au point dans notre laboratoire. Cette technique est appliquée en routine clinique depuis novembre 2002 aux patientes RhD négatif dans le cadre de leur suivi immuno-hématologique. Ce développement ainsi quune première évaluation portant sur 218 grossesses et 223 nouveau-nés ont été rapportés dans un travail original publié dans le J Gynecol Obstet Biol Reprod en 2005 (Minon et al. 2005). La qualité de la prédiction du statut RhD ftal a permis d'envisager l'extension du génotypage à toute patiente RhD négatif. En parallèle, différentes PCR conventionnelles ont été développées pour rechercher les gènes RHD silencieux. Lexistence de variants non fonctionnels du gène RHD - principalement trouvés dans les populations africaine et asiatique - a conduit à amplifier des segments spécifiques du gène RHD fonctionnel (séquences des exons 4 et 5) en plus dune séquence de lexon 10, afin déviter les faux positifs. Toutefois, un résultat faux positif inhabituel, lié en fait à la présence d'un greffon rénal chez l'une de nos patientes, a fait l'objet d'une publication dans Transfusion en 2006 (Minon et al. 2006). La place du génotypage foetal RHD a été réfléchie dans un contexte plus général de prise en charge et de prévention de l'alloimmunisation foeto-maternelle anti-D. Cette réflexion a permis de définir de nouvelles stratégies qui ont été décrites dans la Revue Médicale de Liège en 2006 (Minon et al. 2006). Une synthèse de notre activité tant régionale que nationale entre 2002 et 2006 a été récemment publiée dans Transfusion en 2008 (Minon et al. 2008). Elle reprend l'étude de 563 patientes et de leurs 581 nouveau-nés. Notre expérience dans les grossesses gémellaires y est rapportée. Les pièges (faux positifs et négatifs) de la technique sont abordés et des moyens de prévention pour les éviter sont proposés. Elle a été loccasion dune discussion assez exhaustive sur le génotypage RHD foetal à partir du sang maternel. La faible expression de l'antigène D chez certaines mamans pose un double problème: le premier est lié à la présence d'un gène RHD maternel "intact" qui invalide la recherche du gène RHD foetal dans le plasma. Le second est lié à la confusion induite dans lesprit de l'obstétricien par la présence d'un gène RHD maternel « normal » mais associé à une expression faible de l'antigène D, la patiente étant par ailleurs connue sérologiquement D négative. Sur ce sujet déjà épineux viennent se greffer les particularités des variants D partiels. Une nouvelle stratégie a été définie afin d'orienter l'obstétricien dans le suivi immuno-hématologique et la prophylaxie par anti-D des patientes présentant un D variant (D faible et/ou D partiel). Cette nouvelle approche concerne aussi la politique transfusionnelle à adopter en matière de sang D phéno-compatible. Cette discussion fait partie intégrante de notre sujet et reprendra notre expérience reposant maintenant sur plus de 700 déterminations de RHD ftal réalisées depuis 2007. L'extension du génotypage RHD à toutes les patientes RhD négatif encourage nos équipes à réaliser de manière systématique une prévention par immunoglobulines anti-D à 28 semaines daménorrhée (SA) chez les patientes Rh D négatif dont le foetus est RHD positif. L'introduction de cette prophylaxie modifie le suivi immuno-hématologique obstétrical traditionnel et fait l'objet d'une publication sous presse dans Acta Clinica Belgica (Minon et al. 2008). En corollaire de notre travail, nous avons démontré la fiabilité de la prédiction du sexe foetal par la recherche du gène SRY utilisé comme contrôle interne de la présence de DNA foetal dans le plasma maternel lorsque le foetus est de sexe masculin.