La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) se caractérise par une hétérogénéité d’évolution avec des formes indolente et progressive. Cette dernière reste incurable avec les options thérapeutiques classiques. Mon objectif de thèse a consisté à définir phénotypiquement et fonctionnellement le potentiel régulateur des lymphocytes B de LLC induisant un contexte favorable à leur survie. Après purification des cellules B leucémiques de 30 patients LLC, nos résultats montrent que les sous-populations B sécrètent des cytokines immuno-régulatrices dont l’IL-10 et le TGFβ1. De façon intéressante, ces sous-populations lymphocytaires expriment également le facteur de transcription FOXP3, caractéristique des cellules T régulatrices. La signature phénotypique de ces sous-populations est spécifique au néoplasme avec des marqueurs de lymphocytes B mémoires activés. Nos approches fonctionnelles in vitro démontrent que ces sous-populations B modulent la prolifération et orientent la différenciation et les sécrétions des cellules T, contribuant à l’absence d’immuno-surveillance chez les patients. Enfin, une analyse statistique combinant les expressions de l’IL-10, du TGFβ1 et de FOXP3 dans ces sous-populations B permet de définir un indice polyfonctionnel qui corrèle avec deux facteurs clés du risque de progression de la LLC. L’ensemble de mes travaux de thèse a permis de caractériser de nouvelles sous-populations B impliquées dans la progression de la maladie et donne un rationnel à la survie des cellules leucémiques dans l’environnement ganglionnaire. / Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a clonal B cell malignancy of the elderly. This neoplasm is characterized by a heterogeneous clinical course from indolent chronic disease to progressive lymphadenopathy that remains incurable. The aim of my PhD was to undertake a comprehensive phenotypic and functional analysis of the B cell subpopulations responsible for their survival advantage. CLL B cell purification from 30 patients indicate the presence in various extents of leukemic B cell subpopulations producing immune-regulatory cytokines, notably IL-10 and TGFβ1. Remarkably, these CLL subpopulations express the FOXP3 transcription factor, a marker of regulatory T cells. These subpopulations present a phenotypic signature, distinguishable from regulatory B cells populations, with specific markers of activated memory B cells. Functional studies prove their regulatory capacities on T cell differentiation, proliferation and secretion, contributing to the T cell dysfunction observed in CLL. Finally, statistical analysis combining IL-10, TGFβ1 and FOXP3 expressions for these subpopulations allows generating a poly-functional index correlated with two major risk factors of CLL progression. Our data characterize novel CLL B cell subpopulations that are involved in disease progression and give a rational to CLL B cell survival in secondary lymphoid organs.

A l’instar des lymphocytes T régulateurs, l’étude de populations lymphocytaires B au potentiel immunosuppresseur a émergé ces dernières années. La capacité immunosuppressive des lymphocytes B régulateurs CD24hi CD38hi passant notamment par leur capacité à exprimer l’IL-10 a été mise en évidence dans plusieurs pathologies notamment chez les patients atteints de maladies auto-immunes. En transplantation rénale, le rôle de ces cellules dans la tolérance du greffon a également été suggéré. Néanmoins, la caractérisation de ces cellules semble très controversée et complexe. En effet à ce jour, il n’a été mis en évidence aucun marqueur spécifique permettant d’identifier clairement cette population régulatrice chez l’homme. L’analyse transcriptomique de ces cellules issues de donneurs sains nous a permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs qui leur sont associés tels que CD9, CD10, CD5, ICOS-L (inducible T cell co-stimulator ligand), GARP (glycoprotein-A repetitions predominant protein) et CD1b. Nous avons pu montrer que la présence de ces marqueurs était corrélée à l’expression d’IL-10 et que l’expression de CD1b sur les cellules CD24hi CD38hi était associée à une augmentation de la capacité suppressive de ces cellules. La présence de ces cellules CD1b+ a également été retrouvée en plus forte proportion chez les patients traités par belatacept identifiés comme présentant un meilleur pronostic clinique du greffon. Des résultats préliminaires suggèrent également que d’autres mécanismes peuvent être impliqués dans la fonction immunorégulatrice des LB CD24hi CD38hi comme la sécrétion de cytokines régulatrices telles que l’IL-35. L’identification de ces molécules permet d’améliorer la caractérisation et la compréhension des mécanismes immunorégulateurs de ces cellules et pourrait être d’une grande aide pour le monitoring immunologique de la réponse humorale en transplantation. / Like for regulatory T cells, many studies on B cells immunoregulatory functions have emerged in the past few years. The immunosuppressive capacity of CD24hiCD38hi regulatory B cells known for their ability to produce IL-10 has been demonstrated in several pathologies, in particular in autoimmune diseases. In kidney transplant, the role of these cells in graft tolerance has also been suggested. So far, accurate phenotypic and functional analyses of these Breg are still lacking. Transcriptomic miccroarray analysis of CD24hiCD38hi B cells from healthy donors led us to identify new phenotypic markers as CD9, CD10, CD5, ICOS-L (inducible T cell co-stimulator ligand), GARP (glycoprotein-A repetitions predominant protein) and CD1b. We showed a link between this markers and IL-10 expression and we demonstrated that a CD1b marker on CD24hiCD38hi B cells was associated with an increase of regulatory properties. Breg CD24hiCD38hiCD1b+ was also found in higher frequencies in kidney transplant recipients treated with belatacept. Finally, preliminary results also suggest that other regulatory mechanisms may be involved in immunoregulatory function of CD24hiCD38hi B cells, especially through immunoregulatory cytokines such as IL-35. The identification of these molecules can improve characterization and understanding of immune-regulatory mechanisms of these cells and could be helpful in humoral response immuno-monitoring in transplantation.

Contexte: La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une hémopathie maligne associée à des anomalies dans les réponses immunitaires. Ce qui contribue à la progression de la maladie. Certains LB peuvent induire une inhibition de la réponse anti-tumorale des LT et ainsi promouvoir la progression des tumeurs. Ces LB appelés LB régulateurs partagent des caractéristiques communes avec les LB de LLC.Objectif: L'objectif principal de ce projet est d'évaluer la fonction régulatrice des LB de LLC, afin d’estimer leur influence sur l'absence de réponses anti-tumorales par les cellules T.Méthode: Des modèles de co-culture in vitro ont été développés pour évaluer la capacité desLB à inhiber la prolifération des LT.Résultats: Nos résultats montrent qu’en absence de stimulation, les LB de LLC sont incapables d’inhiber la prolifération des LT contrairement aux LB de témoins. Cependant, deux groupes de patients ont été identifiés après stimulation du TLR-9 des LB. Dans le premier groupe, les LB présentent des fonctions régulatrices défectueuses par rapport aux LB de témoins. Dans le second groupe, aucune activité inhibitrice n’est détectée. L’expression différentielle des gènes associés à la voie TLR-9 entre les deux groupes de patients semble pouvoir expliquer cette dichotomie de réponse. Une corrélation a par ailleurs été retrouvée entre le doublement lymphocytaire et la faible activité régulatrice des LB de LLC.Conclusion: Pour aller plus loin, il convient d'identifier les mécanismes moléculaires endommageant la voie TLR-9. Ces nouvelles données aideront à la compréhension de l’absence de réponse anti-tumorale et des dysfonctionnements immunitaires retrouvés chez les patients. / Background: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by expansion of CD5+B cells associated with disruption of immune responses, contributing to the immunodeficiency and the disease progression. Regulatory B (Breg) cells may control the anti-tumor responses favoring tumor escape. Intriguingly, CLL B cells share phenotypical characteristics with these cells.Aims: The main focus of this project is to evaluate the regulatory function of CLL B cells, aiming to estimate their influence on the lack of anti-tumor responses mediated by T cells.Methods: In vitro models of co-cultures between T and B cells are used to appraise the regulatory capacity of CLL B cells on T cell proliferation.Results: We determined a defective spontaneous regulatory function for CLL B cells. Two groups of patients have been identified following CpG-ODN stimulation. The first group presents defective regulatory B cell functions compared with control B cells. In the second group, no inhibitory activity is detected. TLR-9 gene expression analysis highlighted differential gene expression between controls and the two groups of CLL patients. Moreover, ours observations indicate that patients with low Breg activity have more aggressive disease.Conclusion: These results suggest alteration of the TLR-9 pathway in CLL B cells. To go further, it will be of interest to identify the molecular mechanisms damaging the TLR-9 pathway. These results would contribute to clarify the lack of anti-tumor immune response found in the CLL patients.

Global prevalence of allergic diseases has been on the rise for the last 30 years. In Canada, this upward trend in allergic diseases has resulted in over 3 million Canadians being affected by allergic asthma. Allergic asthma is triggered by inhalation of environmental allergens resulting in bronchial constriction and inflammation, which leads to clinical symptoms such as wheezing, coughing and difficulty breathing. Asthmatic airway inflammation is initiated by the release of inflammatory mediators (-eg- histamine) released by granulocytic cells (-eg- mast cells and basophils). However, immunoglobulin E (IgE) antibody is also necessary for the initiation of the allergic cascade, and IgE is produced and released exclusively by memory B cells and plasma cells. Allergen crosslinking of IgE:FcεRI complexes on the surface of mast cells and basophils causes degranulation of pro-inflammatory mediators. Acute allergen exposure has also been shown to increase IgE levels in the airways of patients diagnosed with allergic asthma; however, more studies are needed to better understand local airway inflammation. Our group's work, in accordance with the literature, has shown an increase of IgE in the airways of subjects with mild allergic asthma following allergen inhalation challenge. Although regulatory B cells (Bregs) have been shown to modulate IgE-mediated inflammatory processes in allergic asthma pathogenesis, particularly in mouse models of allergic airway disease, the levels and function of these IgE+ B cells and Bregs remain to be elucidated in human models of asthma. The overall objective for this dissertation was to investigate the biology of B cells in allergic asthma pathogenesis, specifically investigating the frequency of IgE+ B cells and Bregs in allergic asthma, and the kinetics of these cells after allergen exposure. First, we characterized IgE+ B cells in the blood and sputum of allergic asthmatics and healthy controls with and without allergies (Chapter 2). We showed that IgE+ B cell levels were higher in sputum, but not blood, of allergic asthmatics compared to controls. We further demonstrated that these findings were consistent across airway IgE+ B cell subsets, which include IgE+ memory B cells and IgE+ plasma cells. Additionally, IgE+ B cells in sputum positively correlated with sputum eosinophils, total IgE and B cell activating factor (BAFF) measured in sputum fluid phase. These findings highlight the association of airway IgE+ B cells with allergic asthma, and suggest that local IgE+ B cell functions contribute to the pathogenesis of asthma. Second, we measured the trafficking of IgE+ B cells in periphery (blood, bone marrow and tonsil) and locally (sputum) in allergic asthmatics following whole lung allergen challenge (Chapter 3). IgE+ B cells only increased in the airways of allergic asthmatics following allergen inhalation challenge; there were no allergen-induced changes in IgE+ B cell levels in blood, bone marrow and tonsil. In addition, we showed allergen-induced increases in BAFF and total IgE, but not allergen-specific IgE in sputum fluid phase. Taken together, chapters 2 and 3 show that allergic asthmatics have elevated levels of IgE+ B cells in the airways, that can be further increased after allergen exposure. Therefore, local B cell production of IgE in the lungs may be an important source of IgE for initiation of acute inflammatory responses in allergic airways. Third, we evaluated the levels of Bregs in allergic asthmatics compared to controls, and examined the kinetics, function and distribution (bone marrow, blood and sputum) of Bregs following allergen inhalation challenge (Chapter 4). We showed that Bregs were 2-fold lower in the blood of allergic asthmatics compared to controls, highlighting a possible dysregulation of this regulatory cell type in allergic asthmatics, which may contribute to disease pathology. Furthermore, after whole lung allergen challenge Bregs decreased in the bone marrow with a co-incident increase in the blood and sputum of allergic asthmatics. This pattern reflects potential trafficking of these cells from bone marrow to the airways after exposure to allergic stimuli. Lastly, we stimulated CD19+ B cells purified from blood of allergic asthmatic with IL-4 in vitro. IL-4 is a type 2 cytokine known to isotype-switch B cells to IgE+ B cells, as well as differentiates naïve T cells into Th2 cells, thus propagating the allergic cascade. We found that IL-4 promoted higher proportions of IL-10+ and FoxP3+ Bregs, which demonstrates that Bregs may have a role in dampening IgE-mediated inflammation in a type 2 environment. However, further functional studies are warranted. Taken together, the findings of this dissertation highlight the local compartmental changes in IgE+ B cells and Bregs following allergen challenge of allergic airways. Better understanding the temporal and compartmental shifts in B cell subpopulations, particularly IgE+ B cells and Bregs, may aid in future development of therapeutics. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

Des lymphocytes B (LB) appelés LB régulateurs (LBreg) jouent un rôle primordial dans le contrôle de la réponse immunologique.Ces LBreg peuvent être induits suite à une stimulation. Ainsi, le Toll-like receptor (TLR) 9, récepteur de l’immunité innée, participe à cette induction. La voie de signalisation du TLR9 est déficiente chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé qui souffrent d’hyperinflammation chronique et dont les LBreg sont défectueux. Pour étudier le TLR9, des anticorps commerciaux sont classiquement utilisés. Parmi eux, l’anticorps monoclonal de souris anti-TLR9 26C593.2 cible un épitope présent à la membrane plasmique des LB. De plus, cet anticorps active les LB in vitro et bloque l’effet du CpG-ODN, agoniste du TLR9 endosomal. Nous montrons dans ce travail que cinq anticorps anti-TLR9 commerciaux ne sont pas spécifiques du TLR9 et reconnaissent d’autres antigènes. Quatre anticorps sont pourtant capables de reconnaître une protéine TLR9 recombinante commerciale. Afin de contourner le problème de spécificité de ces anticorps, nous avons construit un TLR9 chimérique tagué par une hémagglutinine (TLR9-HA).Trois anticorps reconnaissent cette protéine surexprimée dans des cellules transfectées.Cependant, aucun TLR9-HA ne semble être présent à la membrane plasmique des cellules transfectées. Cette approche nous a permis de démontrer que les anticorps anti-TLR9 se fixent à la membrane plasmique sur une autre cible que le TLR9. Il sera intéressant d’identifier cette protéine afin de mieux comprendre l’effet de l’anticorps anti-TLR9 monoclonal de souris sur l’activation et plus particulièrement sur l’acquisition des propriétés régulatrices des LB. / Regulatory B cells (Breg) play a key role in regulating the immunological response.This regulatory behaviour can be induced by stimulation of the B cells. Toll-like receptor 9 (TLR9), an innate immune receptor, participate to that induction. TLR9 signalling pathway is deficient in B cells from systemic lupus erythematosus patients suffering from chronic hyper-inflammation and having defective Breg cells. To study TLR9, commercial antibodies are commonly used. Among them, the anti-TLR9 monoclonal antibody 26C593.2 targets an epitope located at the plasma membrane of the B cells. Moreover, this particular antibody activates the B cells in vitro and blocks the CpGODN effects, an agonist of the endosomal TLR9. In this work, we show that five commercial antibodies are not specific for the TLR9 protein and recognize other antigens.However, four tested antibodies can recognize recombinant TLR9 molecule. In order to avoid the specificity problem, we achieved to build a chimeric TLR9 protein expressing a hemagglutinin tag at its C-terminal region (TLR9-HA). Three antibodies efficiently target this overexpressed protein in transfected cells.However, no TLR9-HA molecule seems to be located at the plasma membrane of transfected cells. This approach allowed us to demonstrate that anti-TLR9 antibodies recognize another target than TLR9. It would of interest to identify that protein in order to better understand the mouse monoclonal anti-TLR9 antibody effect on B cell activation and Breg properties.

Le lymphocyte B (LB) joue un rôle important dans la polyarthrite rhumatoïde (PR), en produisant des auto-anticorps qui ont un rôle pathogène, en activant les lymphocytes T, en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires et en permettant la formation de centres germinatifs. Plus récemment, il a été montré que le LB pouvait également produire de l'interleukine (IL) 10, une cytokine anti-inflammatoire qui lui procure des fonctions régulatrices. Ces B régulateurs ont notamment la capacité de différencier les lymphocytes T en T régulateurs. De nombreux traitements sont actuellement disponibles dans la PR, notamment les anti-TNF alpha et les inhibiteurs du récepteur de l'IL-6 (tocilizumab). Dans la première partie de cette thèse, nous avons comparé les LB circulants de patients atteints de PR et de contrôles. Nous avons étudié l'influence de l'activité de la maladie et des traitements sur les LB. Nous avons montré qu'il existait une lymphopénie B globale chez les patients atteints de PR avec une répartition des différents sous-types de LB superposable à celle des contrôles. Les patients ayant une maladie active avaient significativement plus de LB mémoires totaux, pré- et post-switch, CD24hiCD27+ et double négatifs que les patients ayant une maladie peu active. Les traitements anti-TNF et le tocilizumab ne modifiaient pas la répartition des sous-types de LB. Nous avons également montré qu'un taux de plus de 26% de LB mémoires CD27+ avant l'instauration d'un traitement par anti-TNF était associé à la réponse clinique à 3 mois. Les LB mémoires semblent produire plus de TNF que les LB naïfs et par ce biais pourraient induire une réponse Th1. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons tout d'abord cherché à mieux définir les LB régulateurs. Nous avons ensuite étudié leur présence et leur rôle dans la PR. Chez les sujets sains, les LB CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi semblent produire plus d'IL-10 que les autres LB, qui peuvent néanmoins en sécréter. Il semble donc plus adapter de définir les B régulateurs comme B producteurs d'IL-10 ou B10. Les patients atteints de PR avaient significativement moins de B10 que les contrôles en pourcentage et en valeur absolue. Chez les patients ayant un facteur rhumatoïde (FR) positif, il y avait une corrélation inverse entre le pourcentage de B10 et le taux de FR. Il y avait une corrélation inverse entre l'activité de la maladie (DAS28) et le pourcentage de B10, qui était particulièrement marquée pour les PR évoluant depuis moins de 5 ans. Chez ces patients, il y avait également une corrélation inverse entre les B10 et l'inflammation biologique (protéine C réactive). L'instauration d'anti-TNF ou de tocilizumab ne modifiait pas le taux de B10. Les CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi induisaient plus de lymphocytes T régulateurs chez les contrôles que les autres LB (CD24lo/-) alors que ça n'était plus le cas chez les patients atteints de PR, montrant que ces sous-types ont perdu cette fonction régulatrice dans la PR. En conclusion, bien qu'il existe une lymphopénie B, la répartition des sous-types de LB ne semble pas différente entre les patients atteints de PR et les contrôles. Néanmoins, il existe des anomalies fonctionnelles avec notamment une perte de la capacité à produire de l'IL-10 et à induire des T régulateurs chez les patients atteints de PR. / B cells play an important role in rheumatoid arthritis (RA), producing autoantibodies which have a pathogenic role, activating T cells, secreting pro-inflammatory cytokines and allowing the formation of germinal centers. More recently, it was shown that the B cells could also produce interleukin (IL)-10, an anti-inflammatory cytokine which provides their regulatory functions. Those regulatory B cells have the ability to differentiate T cell into regulatory T cells. Many treatments are currently available in RA, including TNF-alpha inhibitors and IL-6 receptor inhibitor (tocilizumab). In the first part, we compared circulating B cells in RA patients and in controls, and we studied the influence of disease activity and treatment on B cells. We have shown that there is a global B cell lymphopenia in RA patients with a similar B cell subtype distribution as controls. Patients with active disease had significantly more pre- and post-switch, CD24hiCD27+ and double negative memory B cells than patients with low disease activity. Anti -TNF treatment and tocilizumab did not change the distribution of B cell subsets. We also showed than patient with more than 26% of CD27+ memory B cells prior TNF inhibitor initiation was associated with clinical response at 3 months. Memory B cells produced more TNF alpha than naive B cells and can potentially induce a Th1 response. B cell subtypes were not associated with response to tocilizumab. In the second part, we first sought to better define regulatory B cells. We then studied their presence and role in RA. In healthy subjects, CD24hiCD27+ and CD24hiCD38hi B cells seem to produce more IL-10 than the other B cells that can nevertheless rarely produce some. It seemed more acurate to define regulatory B cells as IL-10 producing B cells also called B10 cells. Patients with RA had significantly less B10 cells than controls in percentage and absolute values. In rheumatoid factor (RF) positive patients, there was an inverse correlation between the percentage of B10 and the rate of RF. There was an inverse correlation between disease activity (DAS28) and the percentage of B10, which was particularly significant for patients with a disease duration of less than 5 years. In these patients, there was also an inverse correlation between B10 and biological inflammation (C-Reactive Protein). TNF inhibitors or tocilizumab did not change B10 cell rate. The CD24hiCD27 + and CD24hiCD38hi induce more regulatory T cells in controls than other LB (CD24lo/-) while it was not the case in patients with RA, indicating that these subtypes have lost this regulatory function in RA. In conclusion, although there are B cell lymphopenia, the distribution of B cell subsets does not seem to differ between RA patients and controls. Nevertheless, there are functional abnormalities including a loss of the ability to produce IL -10 and induce regulatory T in patients with RA.

B cells and in particular IL-10-secreting B cells emerge as important players in immune balance during pregnancy. We have recently revealed that CD19-deficient (CD19−/−), B cell-specific IL-10-deficient (BIL-10−/−) and B cell-deficient µMT pregnant mice are highly susceptible to LPSinduced preterm birth (PTB). We aimed to analyze the ability of IL-10-secreting cells to protect from PTB and the underlying mechanisms. Wild type (WT), CD19−/−, BIL-10−/− and µMT mice were treated with LPS at gd16 and the cellular immune response was investigated 24 h later. LPS-treated BIL-10−/− dams showed a more pronounced PTB phenotype compared to WT, CD19−/− and µMT females, and increased inflammatory and reduced anti-inflammatory mediator concentrations in the peritoneal cavity and serum. CD19−/−, BIL-10−/− and µMT mice displayed altered immune cell population frequencies in the blood and uterus with lower numbers of IL-10-secreting B cells and T cells. BIL-10−/− mothers presented decreased frequencies of uterine CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells. Co-stimulatory molecules are critical for feto-maternal tolerance and IL-10 secretion. We found dysregulated PD-1 expression in peripheral blood and ICOS expression in the uterus of CD19−/−, BIL-10−/− and µMT dams. Our data show that B cell-specific IL-10-signaling is essential for a balanced maternal immune response to an inflammatory stimulant that cannot be hampered without IL-10-secreting B cells.

B cells and in particular IL-10-secreting B cells emerge as important players in immune balance during pregnancy. We have recently revealed that CD19-deficient (CD19−/−), B cell-specific IL-10-deficient (BIL-10−/−) and B cell-deficient μMT pregnant mice are highly susceptible to LPS- induced preterm birth (PTB). We aimed to analyze the ability of IL-10-secreting cells to protect from PTB and the underlying mechanisms. Wild type (WT), CD19−/−, BIL-10−/− and μMT mice were treated with LPS at gd16 and the cellular immune response was investigated 24 h later. LPS-treated BIL-10−/− dams showed a more pronounced PTB phenotype compared to WT, CD19−/− and μMT females, and increased inflammatory and reduced anti-inflammatory mediator concentrations in the peritoneal cavity and serum. CD19−/−, BIL-10−/− and μMT mice displayed altered immune cell population frequencies in the blood and uterus with lower numbers of IL-10-secreting B cells and T cells. BIL-10−/− mothers presented decreased frequencies of uterine CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells. Co-stimulatory molecules are critical for feto-maternal tolerance and IL-10 secretion. We found dysregulated PD-1 expression in peripheral blood and ICOS expression in the uterus of CD19−/−, BIL-10−/− and μMT dams. Our data show that B cell-specific IL-10-signaling is essential for a balanced maternal immune response to an inflammatory stimulant that cannot be hampered without IL-10-secreting B cells

Le potentiel régulateur des lymphocytes B (LB), largement associé avec la production d’interleukine-10 (IL-10), a été mis en évidence dans des modèles murins de pathologies spécifiques d’Ag. Les cellules B transitionnelles (Tr.) CD24fortes CD38fortes ont été décrites comme régulatrices, au travers de la production d’IL-10, de l’inhibition de la prolifération T, ainsi que de la suppression de la réponse inflammatoire des cellules T. Les LB transitionnels représentent un stade de développement central dans la maturation des cellules B, en faisant le lien entre les cellules immatures de la moelle osseuse et celles matures situées dans les organes lymphoïdes secondaires. Dans une première étude, nous montrons que cette population est hétérogène, et composée de LB Tr. de type 1 (T1), T2, T3 et Tr. CD27+. Les LB T3 anergiques semblent jouer un rôle dans la tolérance périphérique en limitant la prolifération des lymphocytes T (LT) CD4+, tandis que les LB Tr. CD27+ IL-10+ nouvellement décrits inhibent la différenciation des LT CD4+ en cellules productrices d’IFN-γ et de TNF-α. Notons que les LB T1 et Tr. CD27+ se différencient rapidement en cellules productrices d’Ac suite à la reconnaissance de signaux de l’immunité innée. La production d’IL-10 est en partie dépendante des signaux perçus, provenant du microenvironnement. Nous avons décrit dans un second travail que les LB s’adaptent aux cellules avec lesquelles ils sont cultivés. En effet, les cellules B régulent spécifiquement les LT CD4+ mémoires (et non naïfs), en limitant leur prolifération avant d’induire une mort cellulaire. Ces caractéristiques fonctionnelles pourraient être associées avec une modification du programme transcriptionnel, permise par la plasticité des cellules B, qui se polarisent en LB régulateurs (Breg) de façon ciblée. L’expression des gènes PRDM1 et IL10 serait associée avec une signature Breg spécifique en culture mixte autologue, en opposition avec celle des gènes NFκB1 et BCL6. La transplantation rénale est un excellent modèle physiopathologique, pour étudier l’importance de certaines populations de LB dans la tolérance immunologique. L’étude BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) nous a permis de confirmer que les LB Tr. ont probablement un rôle important dans cette tolérance du greffon. La présence d’anticorps spécifiques du donneur (DSA) semble limiter l’émergence des LB Tr., même si le pourcentage de cellules B CD24fortes CD38fortes n’est a priori pas associé avec la capacité du compartiment lymphocytaire B à réguler la prolifération des cellules T des patients alloimmunisés. / Regulatory B cells (Breg) were first reported to be interleukine-10 (IL-10) producing B cells in mice. The almost concurrent discovery of Breg cells drew interest toward potential links with transitional B cells because of phenotypic and functional similarities. In addition with IL-10 production, CD24high CD38high transitional B cells limit the proliferation of T cells and the polarization of CD4+ T cells into Th1 cells. Transitional B cells represent a central developmental stage in B-cell maturation, linking generation in the bone marrow with differentiation in periphery. In a first study, we reveal for the first time that human transitional B cells encompass not only transitional type 1 and type 2 B cells, but also distinct anergic type 3 B cells, as well as IL-10-producing CD27+ transitional B cells. Interestingly, the latter two subsets differentially regulate CD4+ T-cell proliferation and polarization toward Th1 effector cells. Additional experiments showed that type 1 and CD27+ transitional B cells are capable to differentiate into antibody secreting cells after toll-like receptor 9 engagement. In a second work, we wanted to explore the ability of B cells to target T-cell populations. We demonstrate that B cells can be suppressive cells. B cells are capable to target CD4+ memory T-cell, limiting the proliferation and inducing the death of this T-cell population. At the opposite, B cells seem to be effector of CD4+ naïve T-cell functions. These properties are probably associated with a specific transcriptional program. Thus, we observed that suppressive B cells overexpress PRDM1 and IL10, whereas effector B cells preferentially express BCL6 and NFκB1 in in vitro mixed culture. In the last part, we worked on B-cell phenotype and functions in transplanted patients. BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) is a clinical study that aims to better understand the role of B cells in the alloimmunisation and the chronic rejection occurring after renal transplantation. Donor specific antibodies (DSA) seem to limit the expansion of transitional B cells, which are probably not associated with the ability of B cells to regulate T-cell proliferation in DSA+ patients.

Dans des modèles expérimentaux, une tolérance d'allogreffe a pu être induite en transférant des lymphocytes T CD4+ régulateurs (Treg) spécifiques d'antigènes (Ag) du donneur expandus ex vivo. Les données ont démontré l'importance des Treg d'allospécificité indirecte (Treg indirects) dans l'induction d'une tolérance à long terme. L'expansion de Treg indirects ex vivo est problématique, principalement à cause de la difficulté d'obtenir en grand nombre des cellules présentatrices d'antigène autologues (CPA)pour stimuler les Treg. Les lymphocytes B (LB) sont des APC accessibles, présentes en grand nombre et ont un fort potentiel régulateur. Cependant, l'utilisation de LB autologues comme APC est rendue problématique par leur incapacité à présenter les Ag dont ils ne sont pas spécifiques.Dans ce travail de thèse, nous avons développé une approche nanobiotechnologique permettant de transformer des LB polyclonaux autologues en puissants stimulateurs de Treg spécifiques de l'Ag.Des Ag particulaires synthétiques (SPAg) ont été générés en fixant sur des nanosphères fluorescentes de 400 nm de diamètre : (i) des anticorps monoclonaux dirigés contre un domaine constant de la chaine légère kappa du récepteur des LB, et (ii) des Ag modèles.Les SPAg se comportent comme des Ag particulaires naturels lorsqu'ils sont incubés in vitro avec des LB murins ou humains. Les SPAg se lient à la surface des LB kappa+, déclenchent un signal d'activation et sont internalisés dans leur endosomes. Les LB chargés en SPAg induisent l'activation et la prolifération des lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'Ag in vitro.Des propriétés régulatrices peuvent être conférées aux LB chargés en SPAg en les stimulant avec du CpG. Les LB régulateurs générés n'induisent pas de prolifération des T CD4+ effecteurs mais, au contraire, entrainent une prolifération importante des Treg.Cette approche apparait comme une alternative innovante pour expandre des Treg spécifiques de l'Ag ex vivo / Allograft tolerance has been obtained in experimental models with adoptive transfer of ex vivo-expanded regulatory T cells (Treg) specific for donor antigens. Preclinical data have shown that Treg specific for indirectly presented alloantigens (indirect Treg) are mandatory for long-term tolerance. However, the ex vivo expansion of indirect Treg faces limitations,related essentially to the source of autologous antigen-presenting cells (APCs) used to stimulate T cells in vitro. B cells are (i) potent regulatory cells and (ii) APCs able to establish a privileged crosstalk with CD4+ T cells. However, the use of B cells as APCs is made problematic due to their inability to internalize and present non-cognate antigens. We have developed a novel nanobiotechnology-based approach to turn autologous polyclonal B cells into potent stimulators of antigen-specific T reg.Synthetic particulate antigens (SPAg) were generated by immobilizing (i) monoclonal antibodies directed against a framework region of B cell receptor (BCR) kappa-light chains and (ii) model antigens on fluorescent nanospheres of 400 nm in diameter.SPAg behaved like genuine particulate antigens when incubated in vitro with polyclonal murine B cells. SPAg bound to surface BCR of any kappa-positive B cells, triggered activation signal and were internalized in late endosomal compartment of B cells. SPAgloaded B cells induced activation and proliferation of antigen-specific T cells. This approach was transposable to humans’ cells. Importantly, regulatory properties could be conferred toSPAg-loaded B cells by CpG stimulation. SPAg-loaded regulatory B cells prevented proliferation of effector CD4+ T cells and induced proliferation of antigen-specific Treg in vitro.Autologous polyclonal B cells loaded with SPAg appear as an innovative platform to expand Treg ex vivo. This approach may improve the efficiency and costs of current procedures