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Issues d'un gène ancestral commun, les molécules CD5 et CD6 sont présentes à la surface de tous les lymphocytes T (LT) matures ainsi qu'à la surface de certains lymphocytes B (LB). Ces deux protéines font partie de la famille des « Scavenger Receptor Cystein Rich » (SRCR) protéines mais la régulation, l'expression et les fonctions de ces deux molécules ne sont pas totalement résolues. Ainsi, CD5 est impliquée dans la régulation du récepteur à l’antigène des LB et des LT, dans la tolérance des LB et elle est présente à la surface des LB régulateurs. A l’opposé, CD6 possède un rôle dans la prolifération des lymphocytes, la survie, la migration et l’adhésion cellulaire. Les expressions de CD5 et CD6 diffèrent au sein des LB normaux ainsi qu'en pathologie. Dans le cadre du lupus érythémateux systémique (LES), le nombre de molécules CD5 à la surface des LB CD5+ est réduit. Dans une autre maladie auto-immune (MAI), le Syndrome de Gougerot Sjögren (SGS), l'expression de CD6 à la membrane des LB n'est pas affectée mais la distribution des LB mémoires CD6+, mais pas des LB naïfs, est modifiée par rapport aux témoins sains. En effet, les LB CD6+ sont sous représentés dans le sang périphérique et ce, en raison de leur délocalisation dans les glandes salivaires (GS) des patients. Cette délocalisation est liée à la surexpression d’ALCAM, le ligand naturel de CD6, par les cellules épithéliales au cours du SGS. L'étude de la diminution de l'expression de CD5 à la surface des LB de patients atteints de LES a permis de montrer qu'il existait un défaut dans le processus de la méthylation de l'ADN chez ces patients. Ce même défaut a été retrouvé dans les GS de patients atteints de SGS. Enfin, les LB de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC) sont porteurs des deux molécules à leur membrane. Nous avons testé l'effet in vitro et in vivo d'un l'anticorps monoclonal (Acm) humanisé anti-CD6, T1H, dans la LLC. De façon intéressante, il s’avère que cet Acm favorise la lyse des LB de LLC et ceci, de façon équivalente au rituximab dans un modèle murin in vivo. T1H est internalisé par les LT et est donc inefficace sur ces cellules. Ces résultats nous permettent de conclure que même si les molécules CD5 et CD6 sont proches phylogénétiquement, elles possèdent des fonctions et des modes de régulation différents entre les LB et les LT mais aussi au sein des différentes populations de LB. Une meilleure compréhension des fonctions et des modes d'actions de ces deux protéines ouvre des perspectives thérapeutiques dans le traitement des MAI et de la LLC. / Derived from a common ancestral gene, CD5 and CD6 molecules are present on the surface of all mature T lymphocytes (LT) and some B lymphocytes (LB). These two proteins are members of the "Scavenger Receptor Cystein Rich" family proteins (SRCR) but the regulation, the expression and the function of these molecules is not totally resolved. CD5 is involved in the regulation of antigen receptor in LB and in LT, in the LB tolerance and is present on the surface of regulator B cells. In contrast, CD6 plays a role in lymphocyte proliferation, survival, migration, and cell adhesion. Expressions of CD5 and CD6 differ within normal LB and and LB present in different in pathologies. In the context of systemic lupus erythematosus (LES), the number of CD5 molecules on the surface of CD5+ LB is reduced. In another autoimmune disease (MAI), the Sjogren Syndrome (SS), the expression of CD6 at the membrane of B cells is not affected but the distribution of CD6 + memory LB but not naive LB is changed compared to healthy controls. Indeed, LB CD6 + are underrepresented in the peripheral blood and, it’s due to their relocation in the salivary glands (GS) of patients. This relocation is related to overexpression of ALCAM, the natural ligand of CD6, by epithelial cells in SS. The study of the decreased expression of CD5 on the surface of LB SLE patients has shown that there was a defect in the process of DNA methylation in these patients. The same defect was found in the GS of SS patients. Finally, B cells from chronic lymphocytic leukemia patients (CLL) are holders of the two molecules on their membrane. We tested the effect in vitro and in vivo of a humanized monoclonal antibody (mAb) anti-CD6, T1H, in the CLL. Interestingly, it appears that this mAb promotes lysis of CLL LB and this effect is equivalent to the one that rituximab was shown to have in an in vivo mouse model. T1H is internalized by LT and is therefore ineffective on these cells. These results allow us to conclude that even if the CD5 and CD6 molecules are phylogenetically close, they have different functions and modes of regulation between LB and LT but also within different populations of LB. A better understanding of their functions and action pathway of these two proteins opens up therapeutic perspectives for the treatment of MAI and CLL.

Contexte: La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une hémopathie maligne associée à des anomalies dans les réponses immunitaires. Ce qui contribue à la progression de la maladie. Certains LB peuvent induire une inhibition de la réponse anti-tumorale des LT et ainsi promouvoir la progression des tumeurs. Ces LB appelés LB régulateurs partagent des caractéristiques communes avec les LB de LLC.Objectif: L'objectif principal de ce projet est d'évaluer la fonction régulatrice des LB de LLC, afin d’estimer leur influence sur l'absence de réponses anti-tumorales par les cellules T.Méthode: Des modèles de co-culture in vitro ont été développés pour évaluer la capacité desLB à inhiber la prolifération des LT.Résultats: Nos résultats montrent qu’en absence de stimulation, les LB de LLC sont incapables d’inhiber la prolifération des LT contrairement aux LB de témoins. Cependant, deux groupes de patients ont été identifiés après stimulation du TLR-9 des LB. Dans le premier groupe, les LB présentent des fonctions régulatrices défectueuses par rapport aux LB de témoins. Dans le second groupe, aucune activité inhibitrice n’est détectée. L’expression différentielle des gènes associés à la voie TLR-9 entre les deux groupes de patients semble pouvoir expliquer cette dichotomie de réponse. Une corrélation a par ailleurs été retrouvée entre le doublement lymphocytaire et la faible activité régulatrice des LB de LLC.Conclusion: Pour aller plus loin, il convient d'identifier les mécanismes moléculaires endommageant la voie TLR-9. Ces nouvelles données aideront à la compréhension de l’absence de réponse anti-tumorale et des dysfonctionnements immunitaires retrouvés chez les patients. / Background: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by expansion of CD5+B cells associated with disruption of immune responses, contributing to the immunodeficiency and the disease progression. Regulatory B (Breg) cells may control the anti-tumor responses favoring tumor escape. Intriguingly, CLL B cells share phenotypical characteristics with these cells.Aims: The main focus of this project is to evaluate the regulatory function of CLL B cells, aiming to estimate their influence on the lack of anti-tumor responses mediated by T cells.Methods: In vitro models of co-cultures between T and B cells are used to appraise the regulatory capacity of CLL B cells on T cell proliferation.Results: We determined a defective spontaneous regulatory function for CLL B cells. Two groups of patients have been identified following CpG-ODN stimulation. The first group presents defective regulatory B cell functions compared with control B cells. In the second group, no inhibitory activity is detected. TLR-9 gene expression analysis highlighted differential gene expression between controls and the two groups of CLL patients. Moreover, ours observations indicate that patients with low Breg activity have more aggressive disease.Conclusion: These results suggest alteration of the TLR-9 pathway in CLL B cells. To go further, it will be of interest to identify the molecular mechanisms damaging the TLR-9 pathway. These results would contribute to clarify the lack of anti-tumor immune response found in the CLL patients.

Des lymphocytes B (LB) appelés LB régulateurs (LBreg) jouent un rôle primordial dans le contrôle de la réponse immunologique.Ces LBreg peuvent être induits suite à une stimulation. Ainsi, le Toll-like receptor (TLR) 9, récepteur de l’immunité innée, participe à cette induction. La voie de signalisation du TLR9 est déficiente chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé qui souffrent d’hyperinflammation chronique et dont les LBreg sont défectueux. Pour étudier le TLR9, des anticorps commerciaux sont classiquement utilisés. Parmi eux, l’anticorps monoclonal de souris anti-TLR9 26C593.2 cible un épitope présent à la membrane plasmique des LB. De plus, cet anticorps active les LB in vitro et bloque l’effet du CpG-ODN, agoniste du TLR9 endosomal. Nous montrons dans ce travail que cinq anticorps anti-TLR9 commerciaux ne sont pas spécifiques du TLR9 et reconnaissent d’autres antigènes. Quatre anticorps sont pourtant capables de reconnaître une protéine TLR9 recombinante commerciale. Afin de contourner le problème de spécificité de ces anticorps, nous avons construit un TLR9 chimérique tagué par une hémagglutinine (TLR9-HA).Trois anticorps reconnaissent cette protéine surexprimée dans des cellules transfectées.Cependant, aucun TLR9-HA ne semble être présent à la membrane plasmique des cellules transfectées. Cette approche nous a permis de démontrer que les anticorps anti-TLR9 se fixent à la membrane plasmique sur une autre cible que le TLR9. Il sera intéressant d’identifier cette protéine afin de mieux comprendre l’effet de l’anticorps anti-TLR9 monoclonal de souris sur l’activation et plus particulièrement sur l’acquisition des propriétés régulatrices des LB. / Regulatory B cells (Breg) play a key role in regulating the immunological response.This regulatory behaviour can be induced by stimulation of the B cells. Toll-like receptor 9 (TLR9), an innate immune receptor, participate to that induction. TLR9 signalling pathway is deficient in B cells from systemic lupus erythematosus patients suffering from chronic hyper-inflammation and having defective Breg cells. To study TLR9, commercial antibodies are commonly used. Among them, the anti-TLR9 monoclonal antibody 26C593.2 targets an epitope located at the plasma membrane of the B cells. Moreover, this particular antibody activates the B cells in vitro and blocks the CpGODN effects, an agonist of the endosomal TLR9. In this work, we show that five commercial antibodies are not specific for the TLR9 protein and recognize other antigens.However, four tested antibodies can recognize recombinant TLR9 molecule. In order to avoid the specificity problem, we achieved to build a chimeric TLR9 protein expressing a hemagglutinin tag at its C-terminal region (TLR9-HA). Three antibodies efficiently target this overexpressed protein in transfected cells.However, no TLR9-HA molecule seems to be located at the plasma membrane of transfected cells. This approach allowed us to demonstrate that anti-TLR9 antibodies recognize another target than TLR9. It would of interest to identify that protein in order to better understand the mouse monoclonal anti-TLR9 antibody effect on B cell activation and Breg properties.

Plusieurs lymphomes à cellules B présentent des anomalies génétiques qui sont importantes pour déterminer leurs caractéristiques biologiques et peuvent être utiles pour le diagnostic. Les types les plus courants sont le lymphome folliculaire et le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGCB), qui représentent à eux deux plus de 60 % de tous les lymphomes. Les LDGCB sont agressifs mais peuvent être traités par chimiothérapie à agents multiples. Cependant, les gènes suppresseurs de tumeur (GST) potentiellement responsables de la lymphomagenèse ne sont pas tous connus. Le rationnel de ce projet reposait sur des données non publiées du projet translationnel GHEDI (déchiffrer l'hétérogénéité génétique du lymphome diffus à grandes cellules B à l'ère du rituximab). Une hybridation génomique comparative (CGH) (puce Agilent 180 K) a été réalisée sur une série de 202 LDGCB de la série GHEDI et 40 % des délétions de la région 6q21 ont été identifiées, dont la région minimale commune délétée qui contient le gène HACE1. Par ailleurs, l'analyse transcriptomique a montré une corrélation significative entre le nombre de copies du gène et le niveau d'expression. Le gène HACE1, situé sur le chromosome 6q, code pour une ubiquitine ligase E3 et est régulé négativement chez l'homme dans les tumeurs, y compris les neuroblastomes et les lymphomes à cellules tueuses naturelles (NK). Il a été montré que le gène HACE1 ubiquityle Rac1, une protéine impliquée dans la prolifération cellulaire et la progression G2/M du cycle cellulaire. La fonction du gène HACE1 et les facteurs impliqués dans sa régulation transcriptionnelle sont en grande partie inconnus dans le contexte des lymphomes à cellules B. Dans cette étude, nous avons examiné si le gène HACE1 était un gène candidat dans la région génomique 6q impliqué dans la lymphomagenèse des LDGCB et plus largement dans les lymphomes B. Nous avons déterminé la fréquence de l'inactivation du gène HACE1 dans le lymphome à cellules B et analysé les mécanismes impliqués dans son extinction. / Several B-cell lymphomas have characteristic genetic abnormalities that are important in determining their biologic features and can be useful in differential diagnosis. Historically, classical Hodgkin lymphomas have been distinguished from non-Hodgkin lymphomas (NHL). The most common types are follicular lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), which together make up more than 60% of all lymphomas. DBCL are aggressive but potentially curable with multi-agent chemotherapy. However the putative tumor suppressor genes (TSG) responsible for lymphomagenesis still remain unknown. The rational of this project was based on unpublished data from the translational project GHEDI (Deciphering the Genetic Heterogeneity of Diffuse large B-cell lymphoma in the rituximab era). Array comparative genomic hybridization (aCGH) (Agilent 180 K) was performed in a series of 202 DLBCL and found 40% of deletions of 6q21 region, whose minimal commune deleted region (MCR) contains HACE1 gene. Furthermore, transcriptomic analysis showed a significant correlation between gene copy number and expression level. HACE1, located on chromosome 6q, encodes an E3 ubiquitin ligase and is downregulated in human tumors such as neuroblastomas and natural killer (NK) lymphomas. HACE1 has been shown to ubiquitylate Rac1, a protein involved in cell proliferation and G2/M cell cycle progression. The function of HACE1 and the factors involved in its transcriptional regulation are largely unknown in the context of B-cell lymphomas. In this study, we investigated whether HACE1 is a candidate gene in the 6q genomic region involved in DLBCL lymphomagenesis. We determined the frequency of HACE1 inactivation in B-cell lymphoma and analyzed the mechanisms involved in its silencing. We show, by RT-qPCR, that HACE1 gene is constitutively expressed in normal lymph nodes and in normal B-cells isolated from peripheral blood, contrasting with a strong downregulation of its expression in more than 70% (77/111) of B-cell lymphoma cases and in four tested B-Lymphoma cell lines. HACE1 gene copy number was assessed by quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments (QMPSF) and array for comparative genomic hybridization (aCGH) in 91 DLBCL cases.

Le lymphocyte B (LB) des patients lupiques est réfractaire à tous les procédés décrits à ce jour pour activer une fonction régulatrice B (Breg). Il constitue de ce fait un modèle intéressant d’étude de la déficience Breg chez l’Homme et soulève de nombreuses interrogations. Est-il possible de restaurer un défaut d’activation de la régulation LB? Si oui est-il possible d'agir à temps et le plus efficacement possible, et comment s'y prendre? Ou au contraire, est-ce un état irréversible de la cellule B? Ce travail de thèse a pour objectif principal de répondre à cette problématique essentielle à notre compréhension du Breg. Grace à un polypeptide de synthèse le Glatiramer acetate (GA), nous montrons que la restauration de la fonction régulatrice d’un Breg chez les patients lupiques est possible. Le compartiment LB mémoire fixe fortement le GA et la pré-sensibilisation par le GA permet d’augmenter le potentiel régulateur des LB mémoires mais n’affecte aucunement celui des LB matures. Le GA exerce deux actions majeures sur le LB mémoire. D’une part, il génère une meilleure capacité d’inhibition de la prolifération T, dont le mécanisme est associé à un contact cellulaire impliquant les molécules HLA-DR. D’autre part, il favorise un contrôle plus efficace de la polarisation Th1 qui est très probablement associé à sa capacité à induire la production d’IL-10 dans ces LB. Enfin, le GA modifie le phénotype des LB mémoires puisque l’expression de CD5, IL-21R, ou encore PD-1 est significativement augmentée, autant de molécules impliquées dans la fonction suppressive et dans la production d’IL-10. En conclusion, nous montrons qu’amplifier une fonction régulatrice et surtout la restaurer lorsqu’elle est défaillante chez les malades, est parfaitement possible in vitro. Face à l’engouement suscité par le développement de procédés favorisant l’expansion des Bregs chez la souris à des fins thérapeutiques, l’enjeu est aujourd’hui d’être en mesure d’extrapoler de telles démarches chez l’Homme. Ce travail, avec toute la modestie requise, contribuera à faire naître un nouvel élan vers de telles perspectives. / B cell in systemic lupus erythematous (SLE) is unresponsive to all methods described to date, to activate B cells regulatory (Breg) function. Therfore, it is an interesting model to study the Breg deficiency in Human, and highlights many questions: is there a way to restore a defect of the Breg activation ? If yes, how can we act more efficiently ? Or in contrast, is it an irreversible state of the B cell? Glatiramer Acetate (GA) is a synthetic polypeptide used in the treatment of multiple sclerosis. We show that Breg activity of SLE B cells can be restored after stimulation with GA. Interestingly, memory B cells bound high level of FITC-conjuated GA in contrast to mature B cells. We desmonstrate that GA can increased specifically the regulatory activities of memory B cells. GA exerts two major actions on the memory B cells. It generates an improved capacity of inhibition of the T cell proliferative response, whose mechanism is associated with a cellular contact involving HLA-DR molecules. In addition, GA supports a more effective control of the Th1 polarization which is most likely associated with its capacity to induce the production of IL-10 in these B cells. Finaly, GA modifies the memory B cell phenotype since the expression CD5, IL-21R, or PD-1 is significantly increased, all molecules involved in the suppressive function and the IL-10 production. In conclusion, our results show for the first time that amplification of Breg function and additionally its restoration when it is defective in patients, can be perfectly achieved in vitro. Currently, while the development of new process supporting the expansion of Bregs in the mouse model exist, the challenge is to extrapolate such methods in human. Through the control of their regulatory potential, regulatory B cells could be the targets of novel therapeutic approach in autoimmune diseases. This study might open up new horizons in this field.