Η παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι παρέχει άμεσα πληροφορία σχετικά με την κινητική πρόσδεσης και τις σταθερές ισορροπίας. Σε αυτή την αναφορά, παρουσιάζεται μια μεθοδολογία η οποία βασίζεται στη Φασματοσκοπία Ανάκλασης Λευκού Φωτός και ενδείκνυται για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αντιδράσεων που λαμβάνουν χώρα σε στερεά υποστρώματα. Η οπτική διάταξη αποτελείται από μια VIS–NIR οπτική πηγή η οποία επικοινωνεί μέσω οπτικής ίνας με φασματοφωτόμετρο συνδεδεμένο σε Η/Υ. Το εξωτερικό τμήμα της οπτικής ίνας κατευθύνει το φως κάθετα πάνω στην επιφάνεια όπου συμβαίνουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των βιιομορίων. Το ανακλώμενο φως συγκεντρώνεται από το εσωτερικό τμήμα της οπτικής ίνας και κατευθύνεται στο φασματοφωτόμετρο. Οι αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα σε επιφάνεια διοξειδίου του πυριτίου επικαλυμμένη με πολυμερικό υμένιο. Μια αντλία χρησιμοποιείται για την παροχή των αντιδραστηρίων με ελεγχόμενο ρυθμό σε ένα μικρορρευστομηχανικό κανάλι. Το φάσμα της ανάκλασης καταγράφεται σε πραγματικό χρόνο. Οι αντιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνικών μορίων γίνονται αντιληπτές σαν μετατοπίσεις του μήκους κύματος εκεί που παρατηρείται το φαινόμενο της ενισχυτικής συμβολής. Οι μετατοπίσεις αυτές στο μήκος κύματος συμβαίνουν λόγω του σχηματισμού πρωτεϊνικού στρώματος είτε κατά τη διάρκεια της προσρόφησης των αντισωμάτων στο στερεό υπόστρωμα ή λόγω αλλαγής στο πάχος του πρωτεϊνικού στρώματος όταν τα συμπληρωματικά αντιγόνα δεσμεύονται από τα ήδη ακινητοποιημένα αντισώματα. Η προτεινόμενη μεθοδολογία εφαρμόστηκε για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο, χωρίς τη χρήση ιχνηθέτη της αντίδρασης μεταξύ των συμπληρωματικών μορίων βιοτίνης-στρεπταβιδίνης όπως επίσης και για την ανίχνευση της πρόσδεσης των αντιγόνων mouse IgG από ήδη ακινητοποιημένα αντισώματα anti-mouse IgG. Mouse IgG σε συγκεντρώσεις μικρότερες των 150 pM ανιχνεύτηκαν σε πολύ μικρούς χρόνους αντίδρασης (10 min). Ο οπτικός αισθητήρας είναι μια απλή, γρήγορη, χαμηλού κόστους διάταξη για την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των βιομοριακών αλληλεπιδράσεων που τον καθιστά κατάλληλο για διάφορες αναλυτικές εφαρμογές. / Label-free monitoring of biomolecular reactions in real-time is of great interest since it can provide direct results concerning binding kinetics and equilibrium constants. In this report, a method based on White Light Reflectance Spectroscopy (WLRS) is presented that is capable for real-time monitoring of biomolecular reactions taking place on a solid surface. The optical setup consists of a VIS–NIR light source connected through a bifurcated optical fiber to a PC-driven spectrophotometer. The outer part of the optical fibre guides the light vertically onto the surface where the biomolecular reactions occur. The reflected light is collected from the central part of the optical fibre and is directed to the spectrophotometer. The reactions take place on the top of a polymer covered silicon dioxide surface. A microfluidic module in combination with a micropump is used to supply the reagents in an adjustable rate. The reflectance signal is recorded in real-time. The biomolecular interactions are monitored as shifts of the wavelength where constructive interference is observed. These wavelength shifts correspond to biomolecular film thickness changes during either the adsorption of biomolecules onto the substrate or during biomolecule’s reaction with the immobilized counterpart molecules. The proposed methodology has been applied for real-time and label-free monitoring of streptavidin binding to surface-immobilised biotinylated protein as well as of mouse IgG onto immobilized anti-mouse IgG antibody. Mouse IgG at concentrations less than 150 pM were detected in short reaction times (10 min). The proposed reflectance spectroscopy sensor provides a simple, fast, low cost approach for label-free monitoring of biomolecular interactions thus making the developed sensor suitable for various analytical applications.

Η βαριά μυασθένεια είναι μία αυτοάνοση νόσος που οφείλεται στη μείωση του αριθμού των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης (AChRs) στις νευρομυϊκές συνάψεις. Η μείωση των διαθέσιμων AChRs διαμεσολαβείται από αυτοαντισώματα έναντι του AChR που ανιχνεύονται σε ποσοστό περίπου 85% των ασθενών. Ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης είναι το ιοντικό κανάλι που εδράζει στη νευρομυϊκή σύναψη και συμμετέχει στη μεταγωγή της νευρικής ώσης από το νευρικό στο μυϊκό κύτταρο. H μυασθένεια χαρακτηρίζεται από αδυναμία και εύκολη κόπωση των σκελετικών μυών και από ανάκτηση της μυϊκής δύναμης με την ανάπαυση. Συχνότερη και σαν πρώτη εκδήλωση και σαν σύμπτωμα, είναι η συμμετρική ή μη προσβολή των οφθαλμικών μυών, που οδηγεί σε πτώση των βλεφάρων και παροδική διπλωπία. Πειραματικά μοντέλα μυασθένειας έχουν επαχθεί σε διάφορους οργανισμούς και κυρίως σε τρωκτικά. Η επαγωγή της ασθένειας σε πειραματόζωα επιτυγχάνεται είτε μέσω ενεργητικής ανοσοποίησης πειραματοζώων με ολόκληρο, ανέπαφο AChR ή τμημάτων του, είτε μέσω παθητικής μεταφοράς ορών μυασθενικών ή αντισωμάτων έναντι του AChR. Στην παρούσα εργασία: 1ον) προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε την ύπαρξη και τη σημασία ενός μηχανισμού αντιγόνο-ειδικής παρεμπόδισης της ενεργοποίησης των Β-λεμφοκυττάρων κατά του AChR στην πειραματική βαριά μυασθένεια. Η κατιούσα ρύθμιση των Β- λεμφοκυττάρων μπορεί να διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα FcγRIIΒ των Β- κυττάρων. Όταν ο κύριος υποδοχέας των Β κυττάρων (BCR) προσδέσει αντιγόνο το οποίο φέρει προσδεμένο επάνω του ένα άλλο αντίσωμα, ο υποδοχέας FcγRIIB προσδένει το Fc τμήμα αυτού του αντισώματος και μεταδίδει κατασταλτικό σήμα στο εσωτερικό του κυττάρου. Η ανίχνευση και μελέτη αυτού του μηχανισμού στη μυασθένεια, θα μπορούσε μελλοντικά να οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας ειδικής θεραπείας για την ασθένεια. Για την μελέτη του παραπάνω μηχανισμού επάχθηκε πειραματική μυασθένεια με ενεργητική ανοσοποίηση AChR από το ηλεκτρικό όργανο του χονδριχθύος Torpedo σε αρουραίους και χορηγήθηκε κατόπιν στα πειραματόζωα σύμπλοκο που αποτελούνταν από Torpedo υποδοχέα και διάφορα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του υποδοχέα Torpedo. Η χορήγηση όμως των συμπλόκων στις συνθήκες του πειράματος δεν φαίνεται να έχει επίδραση στον τίτλο των αντισωμάτων. Περαιτέρω διερεύνηση αυτού του μηχανισμού θα συνέβαλλε στην κατανόηση της δράσης ή όχι του κατασταλτικού υποδοχέα FcγRIIΒ των Β-λεμφοκυττάρων στην πειραματική βαριά μυασθένεια και της πιθανή συμβολή του στην καταστολή της νόσου. 2ον) διερευνήσαμε την παθογένεια των αντισωμάτων έναντι των α- και β- υπομονάδων του AChR από ορούς μυασθενικών μέσω της ικανότητάς τους να προκαλούν πειραματική μυασθένεια όταν χορηγούνται σε πειραματόζωα (αρουραίοι), καθώς επίσης και των ορών, όταν αφαιρούνται τα ειδικά έναντι των α- και β- υπομονάδων αυτοαντισώματα. Σημαντικός παράγοντας για την επίτευξή του στόχου μας είναι η απομόνωση των αυτοαντισωμάτων που επιτεύχθηκε με τη χρήση ανασυνδυασμένων εξωκυτταρικών τμημάτων των α-και β-υπομονάδων του υποδοχέα εκφρασμένα σε βακτηριακές καλλιέργειες E. coli. Τα πειράματα παθητικής μεταφοράς μυασθένειας σε πειραματόζωα μέσω καθαρών-απομονωμένων αντισωμάτων και ορών απαλλαγμένων από τα αντισώματα έναντι της α- και β-υπομονάδας του υποδοχέα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα αντί-α αντισώματα είναι πιο δραστικά στην πρόκληση της νόσου στα πειραματόζωα, σε σχέση με τα αντί-β αντισώματα. Χαρακτηριστικό των πειραμάτων αυτών είναι το γεγονός πως, όταν από τον ορό των μυασθενικών αφαιρούνται όλα τα αντισώματα που κατευθύνονται κατά του υποδοχέα, ο ορός αυτός δεν προκαλεί συμπτώματα της νόσου στα ζώα, ενισχύοντας την άποψη πως ο μοναδικός παθογόνος παράγοντας του νοσήματος είναι τα αυτοαντισώματα, που κατευθύνονται-στοχεύουν σε επιτόπους του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στη νευρομυϊκή σύναψη. / -

- / -

- / -

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι πενταμερή διαμεμβρανικά γλυκοπρωτεϊνικά μόρια τα οποία ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των συνδεόμενων με προσδέτη ιοντικών καναλιών και ανάλογως με τη θέση τους στα σπονδυλωτά διακρίνονται σε νευρικού τύπου και μυϊκού τύπου. Ο μυϊκός nAChR συναντάται στη νευρομυΪκή σύναψη και έχει στοιχειομετρία (α1)2β1γδ ή (α1)2β1εδ. Στους νευρικού τύπου nAChRs, μεταξύ άλλων ανήκει και ο α4β2 υποδοχέας ο οποίος συναντάται σε υψηλά επίπεδα στον εγκέφαλο του ανθρώπου και εμφανίζεται με τη στοιχειομετρία (α4)2(β2)3 ή (α4)3(β2)2. Αποτελέσματα μελετών έχουν δείξει ότι ο υποδοχέας αυτός εμπλέκεται σε νευροεκφυλιστικές νόσους – Alzheimer, Parkinson, σχιζοφρένεια – καθώς και στον εθισμό στο κάπνισμα. Για το λόγο αυτό ο α4β2 υποδοχέας αποτελεί σημαντικό στόχο για το σχεδιασμό φαρμάκων και συνεπώς οι πληροφορίες που αφορούν τη δομή του και κυρίως το εξωκυτταρικό τμήμα του (ECD) – όπου συναντώνται οι θέσεις πρόσδεσης των προσδετών – είναι σημαντικές. Στο εργαστήριό μας έχει κατασκευαστεί και εκφράζεται στο ζυμομύκητα Pichia pastoris ένα συγκαταμερές το οποίο αποτελείται από τα ECDs των υπομονάδων β2 και α4 συνδεδεμένα σε σειρά μέσω ενός πεπτιδίου 24 αμινοξικών καταλοίπων (β2-α4). Η υψηλή υδροφιλικότητα και οι καλές ιδιότητες πρόσδεσης συνδετών αποτελούν σπουδαία πλεονεκτήματα που καθιστούν το συγκαταμερές αυτό σημαντικό μόριο για προσπάθειες κρυσταλλογραφικής ανάλυσης. Στηριζόμενοι σε αποτελέσματα μελετών που έχουν δείξει ότι μόρια που δεν κρυσταλλώνονται εύκολα μόνα τους, μπορούν να κρυσταλλωθούν ευκολότερα αν συνδεθούν με άλλα πρωτεϊνικά μόρια, έγινε η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων (mAbs) έναντι του β2α4 ώστε τμήματα των mAbs που θα προκύψουν από πέψη αυτών με παπαΐνη (Fab τμήματα) να συγκρυσταλλωθούν μελλοντικά με το β2-α4. Στο πρώτο μέρος της εργασίας πραγματοποιήθηκε η παραγωγή mAbs έναντι του β2-α4. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της κυτταρικής σύντηξης μυελωματικών κυττάρων και σπληνικών κυττάρων αρουραίου ανοσοποιημένου έναντι του β2-α4. Αποτέλεσμα της μεθόδου αυτής είναι η παραγωγή υβριδωμάτων καθένα από τα οποία εκκρίνει ένα συγκεκριμένο mAb. Στη συνέχεια αυτής της διαδικασίας έγινε η επιλογή έξι υβριδώματων από τα οποία εκκρίνονταν αντίστοιχα έξι mAbs (mAbNR1-mAbNR6) με διαφορετικές ικανότητες πρόσδεσης. Πέντε από τα έξι mAbs αποδείχθηκε ότι προσδένουν είτε στη β2 είτε στην α4 υπομονάδα ενώ ένα από αυτά (mAbNR6) φαίνεται να προσδένει στη διεπιφάνεια των δύο υπομονάδων. Τα αντισώματα mAbNR2 και mAbNR3 παρουσιάζουν υψηλή ικανότητα πρόσδεσης αυστηρά για στην β2 και α4 υπομονάδα αντίστοιχα, ενώ τα υπόλοιπα αντισώματα πραγματοποιούν διασταυρούμενες αλληλεπιδράσεις και με άλλες υπομονάδες. Πειράματα με ολόκληρο τον ανθρώπινο υποδοχέα α4β2 έδειξαν ότι το mAbNR2 προσδένει και σε αυτόν, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το αντίσωμα αυτό θα μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο και για τον εντοπισμό του α4β2 υποδοχέα σε ανθρώπινο νευρικό ιστό. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας πραγματοποιήθηκε απομόνωση και στη συνέχεια πέψη του mAbNR2 καθώς και άλλων δύο μονοκλωνικών αντισωμάτων του εργαστηρίου mAb73 (έναντι της β1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR) και mAb198 (έναντι της α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR). Τα αντισώματα αυτά απομονώθηκαν από καλλιέργειες υβριδωμάτων και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πέψη αυτών για τη δημιουργία Fab τμημάτων. Τα τμήματα Fab χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για τη δημιουργία συμπλόκων με τις αντίστοιχες υπομονάδες με σκοπό τη συγκρυστάλλωση. Τελικός σκοπός αυτής της διαδικασίας είναι η μελέτη της δομής των nAChRs και των υπομονάδων τους καθώς και η διευρεύνηση του τρόπου αλληλεπίδρασης αυτών με τα αντισώματα. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are pentameric transmembrane glycoproteins which belong to the super-family of ligand-gated ion channels. Depending on the location of the nAChRs they are categorized into two groups: muscle type and neuronal type. The muscle type nAChR is present in the neuromuscular junction with the stoichiometry (α1)2β1γδ or (α1)2β1εδ. The α4β2 receptor subtype belongs to the neuronal group, it is abundant in the human brain and its stoichiometry is (α4)2(β2)3 or (α4)3(β2)2. The α4β2 receptor is thought to be implicated in addiction to nicotine and in several neurological diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s. For this reason this subtype is an attractive target for drug design and information concerning its extracellular domain (ECD) structure – where the ligand binding site is located – is invaluable. In our laboratory, the yeast Pichia pastoris expression system has been used for the expression of linked ECDs of α4 and β2 nAChR subunits (concatamer β2-α4). We managed to produce a hydrophilic molecule with near-native pharmacological profile for structural studies. Since several published data indicate that crystals of a molecule can be easier obtained when it is co-crystallized with an interaction partner, we produced monoclonal antibodies (mAbs) against β2-α4. Following mAb digestion with papain enzyme the produced Fab fragments will be co-crystallized with β2-α4. In the first part, mAbs against β2-α4 were produced. Rats were immunized against this molecule and their spleen cells were fused with myeloma cells. The result of this process was the production of hybridomas which secreted specific mAbs. Six hybridomas were selected for production of mAbs. These six mAbs (mAbNR1-mAbNR2) had different binding properties. Five of them (mAbNR1-mAbNR5) were anti-β2 or anti-α4 and one (mAbNR6) seemed to bind at the interface of the two subunits. mAb-NR2 and mAb-NR3 were highly specific for β2 and α4 respectively, whereas the other four mAbs exhibited some cross-reactivity with other nAChR subunits. Also, mAbNR2 could be useful for the detection of α4β2 subtype in human neuronal tissue as it shows high specificity for the human wild type α4β2 receptors. The second part of this project involved mAb purification and digestion to Fab. mAbNR2 and two other antibodies that have been previously produced in our lab (mAb73 and mAb198) were used. mAb73 binds to the β1 subunit of the muscle nAChR and mAb198 binds to α1 subunit of neuronal nAChR. These mAbs were isolated from hybridoma cultures and then digested to Fab fragments. The Fabs were then used to obtain complexes with the corresponding subunits for co-crystallization trials. The final aim of this process is to investigate the structure of nAChRs and its subunits as well as their interaction with the corresponding mAbs.