- / -

- / -

- / -

Το ασβέστιο αποτελεί ένα σημαντικό δεύτερο μήνυμα που ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση. Η αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου αυξάνει την παραγωγή της IL-10 στα Τ-λεμφοκύτταρα, αλλά δεν είναι σαφές ποια ενδοκυττάρια μόρια εμπλέκονται σε αυτή τη ρύθμιση. Σκοπός της μελέτης είναι η αποσαφήνιση της συμμετοχής του ασβεστίου στην παραγωγή της IL-10 από Τ-λεμφοκύτταρα και η εντόπιση των πιθανών ενδοκυττάριων στόχων. Ο ρόλος των ενζύμων κλειδιών στην οδό ενεργοποίησης μέσω ασβεστίου καλσινευρίνης και CaM Kinase II μελετήθηκε με χρήση είτε ειδικών αναστολέων, κυκλοσπορίνης και ΚΝ-62 αντίστοιχα, είτε με πλασμίδια που κωδικοποιούν τις καταλυτικές υπομονάδες των ενζύμων καλσινευρίνη και CaM Kinase II. Ανθρώπινα Τ-λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος διεγέρθηκαν με anti-CD3/anti-CD28 (διέγερση μέσω TCR), ή Ionomycin/PMA (ενδοκυττάρια στόχευση Ca++ και PKC) παρουσία ή απουσία των ειδικών αναστολέων. Το πρωτεϊνικό προϊόν της IL-10 μετρήθηκε με ELISA ενώ η παραγωγή mRNA της IL-10 με Real Time PCR. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10, IL-2, IL-4 παρουσία ή απουσία των ενεργών ενζύμων ελέγχθηκε με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τον υποκινητή του γονιδίου (1327 bp) ή τμήματα αυτού (-1010, -500, -310, -235, -135 bp Η δράση των ίδιων ενζύμων στην ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων MEF2, CREB και NF-κB ελέγχθηκε με ταυτόχρονη έκφρασή τους in vivo με πειράματα διαμολύνσεως με πλασμίδια που ελέγχουν την ενεργότητα της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο τους και in vitro σε πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα με πειράματα EMSA. Η επίδραση του μεταγραφικού παράγοντα MEF2 στον υποκινητή της IL-10 έγινε μέσω υπερέκφρασης του in vivo σε πειράματα διαμόλυνσης. Η IL-10 ανιχνεύεται 24 ώρες μετά τη διέγερση των κυττάρων, φτάνει στο μέγιστο στις 48 ώρες και μειώνεται μετά τις 72 ώρες. Παρουσία κυκλοσπορίνης η παραγωγή της IL-10 μειώθηκε κατά 80%-100%, ενώ παρουσία ΚΝ-62 η παραγωγή της IL-10 μειώθηκε κατά 70%-90%, σε όλα τα χρονικά διαστήματα στα οποία μελετήθηκε. Τα ποσοστά αναστoλής ήταν ίδια και κατά τους δύο τρόπους διέγερσης. Οταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν μέσω TCR και του συνδιεγερτικού μορίου CD28, η αναστολή των παραπάνω ενζύμων δεν επηρεάζει την συσσώρευση του mRNA της IL-10, υποδηλώνοντας ότι η ρύθμιση γίνεται σε μεταγενέστερα της μεταγραφής στάδια, επηρεάζοντας πιθανά τη σταθερότητα του mRNA ή το ρυθμό μετάφρασής του. Όταν ο τρόπος διέγερσης των κυττάρων παρέκαμπτε τον TCR τότε η ελάττωση της παραγωγής της IL-10 αντανακλούσε και σε επίπεδο mRNA. Η ενεργοποίηση του υποκινητή της IL-10 που παρατηρείται μετά από διέγερση με ΙON/PMA και CD3/CD28 αυξήθηκε κατά 5 και 3 φορές αντίστοιχα σε Τ λεμφοκύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με τις ενεργές μορφές των ενζύμων καλσινευρίνη και CaM Kinase II σε σχέση με τα κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί μόνο με το όχημα pSRa. Η δράση της CaM Kinase II είναι εκλεκτική για τον υποκινητή της ΙL-10 εφόσον το ίδιο ένζυμο μειώνει την δραστικότητα του υποκινητή τόσο μιας άλλης Th2 κυτταροκίνης όπως η IL-4 όπως επίσης και της IL-2, ενώ η καλσινευρίνη έχει θετική επίδραση στους υποκινητές και των τριων κυτταροκινών. Το τμήμα του υποκινητή της IL-10 που επηρεάζεται από τα προαναφερθέντα ένζυμα καλσινευρίνη και CaM Kinase II βρίσκεται στις πρώτες 500 bp πριν το TATA box, και περιέχει σημεία πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2, CREB και NFκΒ όπως ελέγχθηκε με το πρόγραμμα Consite. Η in vitro δραστικότητα του MEF-2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα διεγερμένων Τ-λεμφοκυττάρων μειώθηκε κατά 50% παρουσία των αναστολέων της καλσινευρίνης και της CaM Kinase II ενώ η ενεργότητα του αυξήθηκε μετά από υπερέκφραση της CaM Kinase II. Αντίθετα η ενεργότητα τόσο του μεταγραφικού παράγοντα CREB όσο και του NFκB μειώθηκε παρουσία της CaM Kinase II, γεγονός που υποδεικνύει τον MEF2 ως ενδοκυττάριο στόχο της ασβεστιοεξαρτώμενης οδού ενεργοποίησης στη ρύθμιση της παραγωγής της IL-10 από ανθρώπινα T λεμφοκύτταρα. Το γεγονός ότι η υπερέκφραση του MEF2D σε Τ-λεμφοκύτταρα αύξησε την ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 αποδεικνύει ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση της παραγωγής της. / Calcium is a second messenger playing a crucial role in the signal transduction which controls the immune response, while IL-10 is considered to be an important regulator of this response. Elevation of intracellular concentration of calcium has been shown to increase IL-10 production. The aim of this study was the elucidation of the role of calcium in IL-10 production by normal T lymphocytes, a mechanism that remains unclear. Fresh Human Τ-lymphocytes derived from PBMC of healthy donors where stimulated with anti-CD3/anti-CD28 or Ionomycin/PMA, in the presence or absence of the specific inhibitors of calcineurin and CaM Kinase II, CsA and KN-62 respectively while there were used plasmids coding the catalytic subunits of calcineurin and CaM Kinase II. The protein product of IL-10 was measured by ELISA, the production of IL-10 mRNA by Real Time PCR. The activity of IL-10 promoter was measured by luciferase reporter assay, after transfection of cells with plasmids carrying the wild type promoter (1327bp) or promoter fragments (constructs of -1010, -500, -310, -235, -135bp).Similarly, we studied the activity of IL-2 and IL-4 promoter The presence of binding sites of transcription factors in the first 500bp of the IL-10 promoter, was validated using the web-based program CONSITE The activity of MEF2 NF-kB and CREB was investigated independently with transfection experiments using plasmids containing the lusiferase reporter under the control of the transcription factors.. Binding of the transcription factor MEF2 was investigated in nuclear extracts of stimulated human T cells with EMSA experiments, whilw his effect on IL-10 promoter was determined through transfecrtion experiments, using a MEF2D plasmid. IL-10 production reaches its peak at 48 hours and it is diminished after 72 hours. We observed a 80-100% reduction of IL-10 production in the presence of CsA and a 70-90% reduction in the presence of KN-62. The inhibition was the same regardless the way of stimulation. When the cells are stimulated through TCR and costimulatory molecule CD28 the inhibition of calcineurin and CaM Kinase II does not affect mRNA accumulation, suggesting that the mechanism of regulation is post-transcriptional, possibly through changes in mRNA stability or through different translation rate, while when cells are Ion/PMA stimulated the reduction of IL-10 protein is also observed at the mRNA level. The induction of IL-10 promoter observed after Ion/PMA stimulation and CD3/CD28 is 3 and 5-fold increased in T cells transfected with the active forms of the enzymes calcineurin and CaM Kinase II. The effect of CaM Kinase II is selective only for the Il-10 promoter, as the same enzyme decreases the activity of IL-2 and IL-4 promoter, while Calcineurin has the same effect on all three promoters. The part of the promoter of IL-10 that shows to be affected by the previously mentioned enzymes is the first 500 bp after the TATA box. This part contains binding sites for the transcription factors MEF-2 and CREB, as validated by the web-based program Consite. The binding of MEF2 to nuclear extracts of stimulated T cells is reduced by 50% in the presence of CsA and KN-62, while his activity is induced in t cells transfected with CaM Kinase II. On the contrary, CREB and NF-kB activities are reduced in the presence of CaM Kinase II, a fact indicating MEF2 as an impotant transcription factor for the regulation of IL-10 production. This is also shovn by the fact that overexpression of MEF2D in T cells increases the activity of IL-10 promoter.

- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

- / -