Εισαγωγή: Η κίρρωση ήπατος αποτελεί μία σοβαρή και γενικά μη αναστρέψιμη κατάσταση, η οποία συχνά επιπλέκεται από λοιμώξεις, με προεξάρχουσα την αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα. Η εκδήλωση βακτηριακής λοίμωξης στους κιρρωτικούς συνοδεύεται από υψηλή θνητότητα, ενώ η ύπαρξη της κιρρωτικής νόσου θεωρείται κακός προγνωστικός παράγοντας σε σοβαρές λοιμώξεις. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της κίρρωσης στην επίπτωση λοιμώξεων και την Τ κυτταρική απάντηση ασθενών με κίρρωση ήπατος. Ασθενείς και Μέθοδο: Η μελέτη περιέλαβε 74 ασθενείς με κίρρωση ήπατος, οποιασδήποτε αιτιολογίας, που εισήχθησαν στην παθολογική κλινική του Περιφερικού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών από Μάιο 2006 έως Ιούνιο 2007. Τριάνταεννέα (39) από τους ασθενείς (52,7%, ομάδα 1) εισήχθησαν για διάφορους λόγους εκτός από λοίμωξη, 21 ασθενείς (28,4%, ομάδα 2) παρουσίασαν σύνδρομο σήψης και 14 (18,9%, ομάδα 3) επεισόδιο κιρσορραγίας. Στο περιφερικό αίμα όλων των ασθενών προσδιορίστηκαν οι Τ λεμφοκυτταρικοί πληθυσμοί, δηλαδή CD3, CD56, CD4, CD8, CD5 και CD20 καθώς και οι CD14 και CD64 υποπληθυσμοί ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων, με την τεχνική της κυτταρομετρίας ροής. Στους ασθενείς της ομάδας 1, ο προσδιορισμός των κυτταρικών πληθυσμών έγινε μόνο κατά την πρώτη ημέρα νοσηλείας, ενώ στους ασθενείς της ομάδας 2 και 3, μετρήσεις λήφθηκαν και κατά την τρίτη ημέρα νοσηλείας καθώς και την ημέρα εξόδου. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε τάση ελάττωσης των κυτταρικών πληθυσμών σε σηπτικούς κιρρωτικούς ασθενείς, χωρίς όμως στατιστική σημασία. Αντίθετα, σημειώθηκε στατιστικά σημαντική μείωση των Τ λεμφοκυτταρικών πληθυσμών σε ασθενείς με κιρσορραγία [CD3: 693 ±85 vs 357 ± 71 (p<0.05), CD4: 425 ± 46 vs 236 ± 48 (p<0.05), CD8: 233 ± 27 vs 128 ± 32 (p<0.05), CD56: 188 ± 28 vs 120 ± 39, σε ασθενείς με κίρρωση vs κιρσορραγία αντίστοιχα]. . Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η ανοσιακή απάντηση σε σηπτικούς ασθενείς με κίρρωση δεν επηρεάζεται σημαντικά, αντιθέτως επηρεάζεται σημαντικά σε ασθενείς με κιρσορραγία. Φαίνεται ότι οι ασθενείς με αιμορραγία κιρσών παρουσιάζουν καταστολή της Τ-κυτταρικής ανοσιακής απάντησης και πρέπει να αντιμετωπίζονται με την κατάλληλη αντιμικροβιακή αγωγή. / Introduction: Liver cirrhosis is a serious and generally non reversible condition, often complicated by infections, most commonly spontaneous bacterial peritonitis. Bacterial infections in cirrhotics are accompanied by a high mortality rate, while the presence of cirrhosis alone is considered to be a bad prognostic marker in serious infections. The aim of the present study was the investigation of the effect of liver cirrhosis on the onset of infections and the association with T-cell immune response in patients with cirrhosis of the liver. Patients and methods: The study included 74 patients with liver cirrhosis, who were admitted to the hospital from May 2006 until June 2007. Thirtynine patients (52,7%, group 1) were admitted for reasons other than infection, 21 (28,4%, group 2) presented septic syndrome and 14 (18,9%, group 3) with variceal bleeding. Determination of T-cell subsets (CD3, CD4, CD5, CD8, CD56, CD20) as well as CD14 and CD64 subsets of monocytes and neutophils took place, using flow cytometry. Measurements for group 1 were taken only on the first day of admission, while for patients of group 2 and 3 measurements were repeated on the third and exit day. Results: Decrease of cell subsets was observed in septic cirrhotics with no statistical significance. On the contrary, significant decrease was observed in T-cel subsets in cirrhotic patients with variceal bleeding [CD3: 693 ±85 vs 357 ± 71 (p<0.05), CD4: 425 ± 46 vs 236 ± 48 (p<0.05), CD8: 233 ± 27 vs 128 ± 32 (p<0.05), CD56: 188 ± 28 vs 120 ± 39, cirrhotics vs patients with variceal bleeding respectively]. Conclusions: It seems that the immune systen in septic patients with liver cirrhosis is not affected during infections, while it appears to be compromised in patients with variceal bleeding. The demonstrated depression of T-cell immune response in cirrhotics presented with variceal bleeding reflects immunosupression of the immune system, and these patients should be confronted with the appropriate antibiotic regime.

- / -

- / -

Το καρκίνωμα εκ πλακώδους επιθηλίου ή πλακώδες καρκίνωμα (ΠΚ) του δέρματος είναι ο δεύτερος πιο συχνός καρκίνος του δέρματος και εμφανίζεται συνήθως σε έδαφος ακτινικής υπερκεράτωσης (ΑΚ). Τα νεοπλασματικά κύτταρα εκφράζουν μια ποικιλία αντιγόνων προσελκύοντας με αυτό τον τρόπο λεμφοκύτταρα, τα διηθούντα τον όγκο λεμφοκύτταρα (Tumor Ιnfiltrating Lymphocytes-TILs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Με βάση το ανοσοφαινοτυπικό τους προφίλ η πλειοψηφία των TILs εκφράζει το μόριο CD3 και αφορά σε Τ-λεμφοκύτταρα. Αυτά με την σειρά τους διαχωρίζονται σε CD8+ Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα και CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα. Η έκφραση του δείκτη CD25+ επιτρέπει τον διαχωρισμό των CD4+ λεμφοκυττάρων σε δύο επιπλέον υποομάδες, τα T-επικουρικά (CD4+/CD25-) και τα Τ-ρυθμιστικά (CD4+/CD25+) κύτταρα. Ο πιο αξιόπιστος δείκτης για την ανίχνευση των Τ-ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) θεωρείται ο Forkhead box P3 (Foxp3). Ο αυξημένος αριθμός των TILs έχει συσχετισθεί με την πρόγνωση και τη θεραπευτική αντιμετώπιση σε μια ποικιλία νεοπλασμάτων, περιλαμβανομένων και καρκίνων του δέρματος όπως το μελάνωμα. Η μεθοδολογία αξιολόγησης της λεμφοκυτταρικής διήθησης, ωστόσο, δεν έχει ακόμα αποσαφηνισθεί και ποικίλλει στα διάφορα είδη νεοπλασμάτων. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας η ανίχνευση των Τ-λεμφοκυττάρων έγινε με ανοσοϊστοχημική μέθοδο με τη χρήση των κατάλληλων αντισωμάτων (CD3, CD4, CD8, Foxp3). Η παρουσία των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου με δυο διαφορετικά ημιποσοτικά συστήματα βαθμολόγησης για όλους τους μελετηθέντες Τ-κυτταρικούς υποπληθυσμούς καθώς και με ένα τρίτο σύστημα ποσοτικής καταμέτρησης για τα Τregs. Σκοπός ήταν να γίνει σύγκριση των μεθόδων ώστε να βρεθεί η καταλληλότερη μεθοδολογία αξιολόγησης της λεμφοκυτταρικής διήθησης στο πλακώδες καρκίνωμα του δέρματος, να υπολογιστεί ο αριθμός των Tregs στις μελετούμενες οντότητες χρησιμοποιώντας το βέλτιστο σύστημα βαθμολόγησης και να αναζητηθούν διαφορές στην πυκνότητα των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών μεταξύ των οντοτήτων, οι οποίες μπορεί να έχουν παθογενετική ή θεραπευτική κλινική σημασία. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the skin is the second most common skin cancer. It usually develops in a background of actinic keratosis (AK). Neoplastic cells express a variety of antigens, attracting lymphocytes in the tumor microenvironment (Tumor Ιnfiltrating Lymphocytes-TILs). Based on the immunophenotypic profile, the majority of TILs expresses the CD3 molecule, so they are T-lymphocytes. These in turn are divided into CD8+ cytotoxic T-lymphocytes and CD4+ T-lymphocytes. The expression of CD25 enables the separation of CD4+ lymphocytes in two further subgroups, the T-helper (CD4+/CD25-) and T-regulatory (CD4+/CD25+) cells. The most reliable marker for the detection of T-regulatory cells (Tregs) is considered to be the Forkhead box P3 (Foxp3). The increased number of TILs is associated with prognosis and treatment in a variety of tumors, including skin cancers, such as melanoma. The evaluation methology of lymphocytic infiltration, however, is not yet clarified and varies in different types of tumors. In the context of this thesis, the detection of T-lymphocytes was performed by immunohistochemistry using the appropriate antibodies (CD3, CD4, CD8, Foxp3). The presence of the cells was evaluated using light microscopy with two different semiquantitative scoring systems, for all the T-lymphocyte subpopulations, as well as with a third system of quantification of Tregs. The purpose was to compare the methods in order to find the most suitable methodology for the evaluation of the lymphocytic infiltration in squamous cell carcinoma of the skin, to evaluate the number of Tregs in the studied entities using the best method and examine for differences in the density of lymphocyte subpopulations.

Κάθε χρόνο τα άτομα που υποφέρουν από κάποιας μορφής νεφρική νόσο αυξάνονται παρά τις εξελίξεις στον τομέα της ιατρικής. Έχει παρατηρηθεί ότι η νεφρική νόσος, στις περισσότερες περιπτώσεις μπορεί να εξελιχθεί σε νεφρική ανεπάρκεια, είτε με πιο αργούς είτε με πιο γρήγορους ρυθμούς. Η νεφρική ανεπάρκεια αντιμετωπίζεται είτε με αιμοκάθαρση είτε με μεταμόσχευση. Το ανοσοποιητικό σύστημα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην αντιμετώπιση όσο και στη πρόοδο των διάφορων μορφών νεφρικής νόσου. Ωστόσο, οι διάφοροι λεμφοκυτταρικοί τύποι, και ιδιαίτερα αυτοί της φυσικής ανοσίας, δεν έχουν μελετηθεί ιδιαίτερα και πολλές φορές από τις λίγες μελέτες που υπάρχουν προκύπτουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Η μελέτη μας επικεντρώθηκε στα Τ, στα ΝΚ και στα ΝΚ-Τ λεμφοκύτταρα. Επιλέξαμε να ερευνήσουμε αρχικά και τελικά στάδια νεφρικής νόσου. Έτσι οι ασθενείς κατηγοριοποιούνται σε τρεις ομάδες: ασθενείς με σπειραμαρονεφρίτιδα (αρχικό στάδιο), ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση και μεταμοσχευμένοι ασθενείς (τελικά στάδια). Σε κάθε πείραμα γίνεται σύγκριση με μια ομάδα ελέγχου (control, που αποτελείται από υγιή άτομα). Στην περίπτωση της σπειραματονεφρίδας παρατηρήθηκαν φυσιολογικά ποσοστά των λεμφοκυτταρικών τύπων και της έκφρασης του NKG2D υποδοχέα. Παρατηρήθηκε, όμως, αυξημένη έκφραση του TNF-α. Στην περίπτωση της αιμοκάθαρσης αν και παρατηρήθηκε μειωμένο ποσοστό ΝΚ και Τ κυττάρων, βρέθηκε ότι παρουσιάζουν αυξημένη κυτταροτοξικότητα και λειτουργικότητα. Αυτό φαίνεται και από την αύξηση στην έκφραση του CD107α και από την αύξηση στη συγκέντρωση του TNF-α. Όσον αφορά τα ΝΚ-Τ κύτταρα, αν και το ποσοστό τους είναι φυσιολογικό, εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του υποδοχέα NKG2D. Τέλος, όσον αφορά την ομάδα των μεταμοσχευμένων ασθενών, δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στο ποσοστό των Τ και των ΝΚ-Τ κυττάρων. Όταν όμως οι ασθενείς κατηγοριοποιούνται με βάση την φαρμακευτική αγωγή, το ποσοστό των ΝΚ-Τ κυττάρων είναι αυξημένο σε ασθενείς που τους χορηγείται κυκλοσπορίνη. Επίσης, η έκφραση του υποδοχέα NKG2D είναι φυσιολογική και στις δύο κατηγορίες λεμφοκυττάρων. Από την άλλη, αν και το ποσοστό των ΝΚ κυττάρων μειώνεται, αυτά εμφανίζουν φυσιολογική λειτουργικότητα και κυτταροτοξικότητα, όπως φαίνεται από τη φυσιολογική έκφραση του NKG2D υποδοχέα, της πρωτεΐνης CD107α και του TNF-α. / Every year, people who suffer from some form of kidney disease are increasing despite advances in medicine. It has been observed that the kidney disease, in most cases might progress to renal failure, either slower or faster. The renal failure is treated either by hemodialysis or renal transplantation. The immune system plays an important role in the treatment and in the progression of various forms of renal disease. However, the various types of lymphocytes, and especially those of innate immunity have not been widely studied and often the few studies that exist result in conflicting results. Our study focused on T, NK and NK-T lymphocytes. We chose to investigate initial and final stages of renal disease. Patients were categorized into three groups: patients with glomerulonephritis (initial stage), patients on dialysis and transplanted patients (final stages). In each experiment patients were compared with a control group consisting of healthy individuals. In the case of glomerulonephritis, we observed normal percentages of the lymphocyte population examined and normal expression of the NKG2D receptor, as well as increased expression of TNF-α. In the case of hemodialysis, NK and T cell percentages were reduced, while NK cells exhibited enhanced cytotoxicity and functionality. This was shown by the increase in the expression of CD107α and by the increase in the concentration of TNF-α. Regarding the NK-T cells, although their percentage was normal, they showed increased expression of NKG2D receptor. Finally, concerning the group of transplanted patients, no change was observed in the percentage of T and NK-T cells. However, when patients were categorized based on the medication, the percentage of NK-T cells was increased in patients receiving cyclosporine. In addition, the expression of NKG2D receptor was normal on T and NK-T cells. On the other hand, although the percentage of NK cells was reduced, those cells exhibited normal functionality and cytotoxicity, as shown by the normal expression of NKG2D receptor, CD107α protein and TNF-α.

Η cAMP αποτελεί ένα σημαντικό δεύτερο μήνυμα που ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση. Η αύξηση της ενδοκυττάριας cAMP αυξάνει την παραγωγή της IL-10 από μονοκύτταρα. Σκοπός της μελέτης είναι η αποσαφήνιση της συμμετοχής της cAMP στην παραγωγή της IL-10 από Τ-λεμφοκύτταρα όπου τα δεδομένα είναι ακόμα ασαφή. Ανθρώπινα Τ-λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος διεγέρθηκαν με anti-CD3/anti-CD28, anti-CD3 ή Ionomycin/PMA παρουσία ή απουσία παραγόντων που αυξάνουν την ενδοκυττάρια cAMP (10-6 Μ Forskolin, 10-6 Μ PGE2, 5x10-6 Μ Rolipram και 10-6 Μ 8-Br-cAMP). Το πρωτεϊνικό προϊόν της IL-10 μετρήθηκε με ELISA ενώ η παραγωγή mRNA της IL-10 με Real Time PCR. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 ελέγχθηκε με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τον υποκινητή του γονιδίου (1327 bp) ή τμήματα αυτού (-1010, -500, -310, -235, -135 bp). Η δέσμευση των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2 και CREB ελέγχτηκε σε πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα με πειράματα EMSA, ενώ η ενεργότητα τους ελέγχθηκε με πειράματα διαμολύνσεως με πλασμίδια που ελέγχουν την ενεργότητα της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των MEF-2 και CREB. Αύξηση της cAMP ελαττώνει την παραγωγή της IL-10 σε πρωτεϊνικό επίπεδο κατά 50-60% μετά από διέγερση με Ion/PMA, και κατά 80-90% με anti-CD3 ή με anti-CD3/anti-CD28. Η IL-10 παράγεται ακόμα και μετά από διέγερση μόνο με anti-CD3, εύρημα ειδικό για την IL-10, καθώς δεν παρατηρήθηκε αύξηση της παραγωγής άλλων κυτταροκινων (IL-2 & IL-4). Η ελάττωση της παραγωγής της IL-10 αντανακλάται και σε επίπεδο mRNA όπου οι αντίστοιχες μειώσεις είναι κατά 50% με όλους τους τρόπους διέγερσης. Η ενεργότητα του υποκινητή της IL-10 δεν επηρεάζεται από αλλαγές στα επίπεδα της cAMP όταν η διεγερση παρακάμπτει τον Τ κυτταρικό υποδοχέα. Ωστοσο, μειώνεται παρουσία αυξημένων συγκεντρώσεων cAMP όταν τα κύτταρα διεγείρονται μέσω του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Το τμήμα του υποκινητή της IL-10 που επηρεάζεται από την ανασταλτική δραση της cAMP (50 % αναστολή) βρίσκεται στις πρώτες 500 bp πριν το TATA box, και περιέχει σημεία πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων MEF-2 και CREB, όπως ελέγχθηκε με το πρόγραμμα Consite. Η δέσμευση του MEF-2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα διεγερμένων Τ-λεμφοκυττάρων μειώνεται κατά 70% παρουσία αυξημένης cAMP ενώ η ενεργότητα του δεν επηρεάζεται σημαντικά. Αντίθετα, η αύξηση της cAMP αυξάνει τόσο τη δέσμευση (x 2,5) όσο και την ενεργότητα του CREB (x 2). Η δράση της cAMP στην παραγωγή της IL-10 είναι ειδική για τα Τ-λεμφοκύτταρα και εξαρτάται από τον τρόπο διέγερσής τους. Η ρύθμισή της γίνεται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μετά-μεταγραφικό επίπεδο. Η αύξηση της cAMP μπορεί να επηρεάσει την παραγωγή IL-10 από τα Τ-λεμφοκύτταρα παρεμβαίνοντας στην δέσμευση και την ενεργότητα των παραγόντων μεταγραφής MEF-2 και CREB. Ο τρόπος της αλληλεπίδρασης/συνεργασίας των MEF-2 και CREB παραμένει υπό διερεύνηση. / cAMP is a second messenger playing a crucial role in the signal transduction which controls the immune response, while IL-10 is considered to be an important regulator of this response. Elevation of intracellular concentration of cAMP has been shown to increase IL-10 production by monocytes. The aim of this study was the elucidation of the role of cAMP in IL-10 production by normal T lymphocytes, a mechanism that remains unclear. Fresh Human Τ-lymphocytes derived from PBMC of healthy donors where stimulated with anti-CD3/anti-CD28 or Ionomycin/PMA, in the presence or absence of cAMP elevating agents (10-6 Μ Forskolin, 10-6 Μ PGE2, 5x10-6 Μ Rolipram and 10-6 Μ 8-Br-cAMP). The protein product of IL-10 was measured by ELISA, the production of IL-10 mRNA by Real Time PCR and IL-10 mRNA stability was determined by the use of Actinomycin D (10 μM). The activity of IL-10 promoter was measured by luciferase reporter assay, after transfection of cells with plasmids carrying the wild type promoter (1037bp) or promoter fragments (constructs of -1010, -500, -310, -235, -135bp). PKA role was examined either by cotransfection experiments with a plasmid carrying a constitutively active mutant of the catalytic subunit of PKA-α isoform, or by the use of a specific PKA inhibitor Rp-8- Br-cAMP (10-50 μM). The presence of binding sites of transcription factors in the first 500bp of the IL-10 promoter, was validated using the web-based program CONSITE. Binding of the transcription factors MEF2 and CREB was investigated in nuclear extracts of stimulated human T cells with EMSA experiments. The activity of MEF2 and CREB was investigated independently with transfection experiments using plasmids containing the lusiferase reporter under the control of the transcription factors. Intracellular cAMP elevation, inhibits IL-10 protein production by 50-60%, when T cells are stimulated with Ionomycin/PMA, and by 80-90% after stimulation with anti-CD3 or anti-CD3/anti-CD28, while PKA blocking by Rp-8- Br-cAMP reversed cAMP mediated inhibition.. IL-10 steady state mRNA levels follow the same pattern of inhibition only after anti-CD3/anti-CD28 stimulation. cAMP elevation decreases IL-10 mRNA stability after I/PMA stimulation, whereas in the anti-CD3/anti-CD28 stimulated cells, the mechanism of inhibition is mainly transcriptional. IL-10 promoter activity is reduced up to 60% when cells are stimulated with anti CD3/anti CD28 in the presence of cAMP elevating agents, but is not affected after stimulation with Ionomycin/PMA or cotransfection of the cells with constitutively active PKA mutant. Transfection assays with the different IL-10 promoter fragments revealed that the most responsible part of IL-10 promoter to cAMP mediated inhibition, is the first 500 bp after the TATA box. This part contains binding sites for the transcription factors MEF-2 and CREB, as validated by the web-based program Consite. Increased intracellular cAMP reduces the binding of MEF2 to nuclear extracts of stimulated T cells by 70 %, however its activity is not affected significantly. On the contrary, both the binding and the activity of CREB are increased in the presence of elevated cAMP. cAMP mediated inhibition of IL-10 production is PKA mediated and specific for T lymphocytes, depending on the nature/strength of stimulation. cAMP-dependent regulation of IL-10 production is controlled by transcriptional and/or post-transcriptional mechanisms depending on the nature of stimulus. Transcriptional mechanisms involve the transcription factors MEF2 and CREB, however the exact mechanisms of action of these factors deserves further elucidation. Cell and stimulus specific mechanism of regulation of IL-10 production is necessary for its immunoregulatory function.

Η ριβονουκλεάση P (RNase P) είναι το ένζυμο που ευθύνεται για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των πρόδρομων μορίων tRNA συμμετέχοντας έτσι στην πρωτεΐνοσύνθεση. H RNase P καταλύει την ενδονουκλεολυτική θραύση ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού παρουσία ιόντων Mg2+ παράγοντας προϊόντα με 3΄ υδροξυλικά και 5΄ φωσφορικά άκρα. Η πλειοψηφία των RNase P ενζύμων που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνες αποτελούμενες από μια RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες. Η RNA υπομονάδα της βακτηριακής RNase P είναι ένα από τα πρώτα καταλυτικά RNA που μελετήθηκαν. Η RNase P και το ριβόσωμα είναι τα μόνα γνωστά ριβοένζυμα που είναι συντηρημένα και στις τρείς φυλογεννετικές περιοχές. Δεδομένης της ζωτικής σημασίας των λεμφοκυττάρων στην ακεραιότητα του ανοσολογικού συστήματος και στην παθογένεια ευρέος φάσματος δερματολογικών και μη νοσημάτων, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την απομόνωση και τον καθαρισμό της RNase P από περιφερικά λεμφοκύτταρα υγιών μαρτύρων, ο προσδιορισμός της ενζυμικής της δραστικότητας, καθώς και η μελέτη της in vitro επιδράσεως δυο συνθετικών ρετινοειδών, του 13-cis ρετινοϊκού οξέος και της ασιτρετίνης, της αμινογλυκοσίδης νεομυκίνης Β, όπως και της διφωσφορικής χλωροκίνης στην δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Το ένζυμο καθαρίστηκε με τη χρήση κατιοντοανταλλακτικής χρωματογραφίας φωσφοκυτταρίνης και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δραστικότητάς του.Μετά από μελέτη της επίδρασης των συνθετικών ρετινοϊδών και της νεομυκίνης Β στην δραστικότητα της RNase P, προέκυψε ότι και τα τρία προκαλούν μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της δραστικότητας της RNase Ρ των ανθρωπίνων λεμφοκυττάρων. Η διφωσφορική χλωροκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της λεμφοκυτταρικής RNase P. Λεπτομερής κινητική ανάλυση έδειξε πως η αναστολή που προκαλείται από την ασιτρετίνη είναι συναγωνιστικού τύπου, ενώ αυτή από την νεομυκίνη Β είναι μη συναγωνιστικού τύπου.Η κινητική σταθερά Km της λεμφοκυτταρικής RNase P βρέθηκε ότι ισούται με 245 nM και η Vmax με 0.42 pmol/min. Συμπερασματικά, η απομόνωση της RNase P από ανθρώπινα περιφερικά λεμφοκύτταρα καθιστά δυνατή τη μελέτη της πιθανής ανάμιξης αυτού του ριβοενζύμου στους παθογενετικούς μηχανισμούς διαφόρων αυτοάνοσων, φλεγμονωδών και νεοπλασματικών δερματοπαθειών και μπορεί να διευκολύνει τη περαιτέρω ανάπτυξη της βασιζομένης στην RNase P τεχνολογίας για τη γονιδιακή θεραπεία δερματικών και μη παθήσεων. / Ribonuclease P (RNase P) is the enzyme responsible for the 5΄ maturation of the precursor tRNA molecules, participating in tRNA biogenesis and therefore in protein synthesis. It catalyses the endonucleolytic cleavage of a phosphodiester bond in the presence of Mg2+ and results in the production of molecules that bear 3΄ hydroxyl and 5΄ phosphoric ends. Most forms of RNase P are ribonucleoproteins consisting of an essential RNA and protein subunits. The RNA component of the bacterial RNase P was one of the first identified catalytic RNAs. So far, RNase P and the ribosome are the only ribozymes known to be conserved in all kingdoms of life (bacteria, archaea and eucarya). In view of the vital importance of lymphocytes for an effective immune system, we proceeded to the RNase P isolation from human peripheral lymphocytes. The enzyme was purified with cation exchange phosphocellulose chromatography and the optimal conditions were determined. Herein, it was investigated the effect of the synthetic retinoids (cis-retinoic acid and acitretin), neomycin B, as well as chloroquine diphosphate, on the RNase P activity. Cis-retinoic acid, acitretin and neomycin B exerted a dose-dependent inhibitory effect on RNase P activity from human lymphocytes, wlile the activity was not affected in the presence of chloroquine diphosphate. A detailed kinetic analysis showed that the inhibition caused by acitretin was of competitive type, whereas that caused by neomycin B was of noncompetitive type. The kinetic constant Km of RNase P activity isolated from lymphocytes for the tRNA maturation reaction has been estimated equal to 245 nM and the Vmax value has been estimated equal to 0.42 pmol/min. Finally, the isolation of RNase P from human peripheral lymphocytes will enable the study of the possible involvement of this ribozyme in the pathogenetic mechanisms of diverse autoimmune, inflammatory and neoplastic cutaneous disorders and may facilitate the further development of RNase P-based technology for gene therapy of infectious and neoplastic dermatoses.

- / -

- / -

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει τον ρόλο της ταξόλης (paclitaxel) και της καρβοπλατίνης σε σχέση με τις παραμέτρους του ανοσοποιητικού συστήματος σε ασθενείς πάσχοντες από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και από καρκίνο των ωοθηκών· πριν, κατά τη διάρκεια και μετά από χημειοθεραπεία και η επίδραση που είχε ο ανωτέρω συνδυασμός φαρμάκων στην συνολική επιβίωση των ασθενών. Υλικό και Μέθοδος: Εξετάσθηκαν 24 ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και 20 με καρκίνο των ωοθηκών (όλοι μεταστατικοί), όπου χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με κριτήριο την επιβίωση και που εν συνεχεία τους χορηγήθηκε συνδυασμός καρβοπλατίνης και ταξόλης για έξι θεραπευτικούς κύκλους. Ομάδα Α. Ασθενείς με καλή επιβίωση (>12 μήνες για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, >30 μήνες για καρκίνο των ωοθηκών) Ομάδα Β. Ασθενείς με «φτωχή» επιβίωση (<12 μήνες για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, <18 μήνες για καρκίνο των ωοθηκών) Την ίδια χρονική περίοδο εξετάσθηκαν οι λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί (CD3, CD4, CD8, CD56, CD34) καθώς και οι κυτταροκίνες ιντερλευκίνη-3 (IL-3) και ιντερφερόνη-γ (IFN-γ), σε σχέση με την ποιότητα ζωής και το προσδόκιμο επιβίωσης κατά την διάρκεια της χημειοθεραπευτικής αγωγής. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με την μέθοδο ANOVA. Αποτελέσματα: Από την εξαγωγή των αποτελεσμάτων παρατηρήθηκε μία στατιστικώς σημαντική διαφορά ανάμεσα στις τιμές των λεμφοκυτταρικών 207 υποπληθυσμών CD4 και CD4/CD8 μετά από χημειοθεραπεία μεταξύ των δύο ομάδων ασθενών Α και Β (p=0,001 και p=0,006). Αυτό σημαίνει ότι η περαιτέρω αύξηση του αριθμού των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων (T-helper) μετά από χημειοθεραπεία συμβάλλει θετικά στο προσδόκιμο επιβίωσης. Επιπροσθέτως, στατιστικώς ενδιαφέρων σε σημείο που να μπορούμε να μιλήσουμε και για προγνωστικό παράγοντα, ήταν η διαφορά ανάμεσα στις τιμές της ιντερφερόνης-γ μεταξύ των ομάδων Α και Β πριν και μετά τη χημειοθεραπεία (p=0,039 και p=0,027, αντιστοίχως). Οι ασθενείς με υψηλές τιμές ιντερλευκίνης-3 παρουσίαζαν επίσης χαμηλή τοξικότητα. Συμπεράσματα: Στην παρούσα μελέτη η προσπάθεια μας επικεντρώθηκε στο να καταδείξουμε την επίδραση που ασκείται, από την χρήση του συνδυασμού καρβοπλατίνης-ταξόλης, στους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς και στις κυτταροκίνες καθώς και την επιρροή που ασκούν και τα δύο αυτά στοιχεία του ανοσοποιητικού συστήματος στο προσδόκιμο επιβίωσης και στην εν γένει ποιότητα ζωής. / The aim of the present study was to exam the role of Paclitaxel (Taxane) and Carboplatin in the parameters of the immune system in patients with non-smallcell lung cancer and in patients with ovarian cancer before, during and after chemotherapy treatment, and the effect of this combination in the overall survival of the patients. Methods: 24 patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) and 20 patients with ovarian cancer (all in stage IIIb-IV) were treated with a combination of paclitaxel and carboplatin for six treatment cicles and they were separated into two groups in terms of survival. GROUP (A). Long survival (>12 months for NSCLC, >30 months for ovarian Ca) GROUP (B). Long survival (<12 months for NSCLC, <18 months for ovarian Ca) At the same time we combined the relevant parameters (CD3, CD4, CD8, CD56, CD34, IL-3, IFN-γ) with the quality of life during treatment with chemotherapy. The results were analyzed using ANOVA system. Results: We observed a significant statistical difference between the values of CD4 and CD4/CD8 after chemotherapy between group A and group B (p=0,001 and p=0,006). This means that the further increase of T-helper cells after chemotherapy has a better prognosis concerning survival. In addiction, statistically interesting, which we may call a prognostic factor, was the difference in values of IFN-γ between individuals of groups and B before and after chemotherapy (p=0,039 and p=0,027, respectively). Patients with high IL-3 had little chance of toxicity. Conclusions: In the current study we tried to demonstrate the effects from the use of the combination of carboplatin-paclitaxel in the whole population of Tcells/ cytokines and the reaction of them in the quality of life.