Pendant le développement postnatal du cortex cérébral visuel, l'homéoprotéine Otx2 est transférée préférentiellement dans les interneurones inhibiteurs à parvalbumine (cellules PV), induit leur maturation et régule la période critique de plasticité pour la dominance oculaire. Pendant cette période critique, les cellules PV sont progressivement entourées par une matrice extracellulaire riche en glycosaminoglycanes (GAGs), qui pourraient être impliqués dans la capture d'Otx2. Pour étudier comment l'interaction entre Otx2 et les GAGs à la surface des cellules PV régule la période critique, nous avons analysé une lignée de souris transgéniques Otx2-AA chez lesquelles cette interaction est perturbée. Ces souris présentent une spécificité réduite de l'Otx2 cortical pour les cellules PV et un retard dans l'ouverture et la fermeture de la période critique pour la dominance oculaire. Nous avons montré que la protéine Otx2 se lie aux chaines de chondroïtine sulfates à la surface des cellules PV et qu'elle a une forte affinité pour le chondroïtine sulfate CS-E. Chez l'adulte, le cortex est maintenu à l'état non plastique par un apport continuel d'Otx2. Afin de ré-ouvrir une fenêtre de plasticité chez l'adulte, nous avons développé deux modèles pour perturber le transfert d'Otx2 : un analogue synthétique de CS-E qui se lie à Otx2 et une souris knock-in inductible pour contrôler la sécrétion d'un anticorps simple chaine contre Otx2. Ces résultats confirment et précisent le rôle in vivo de l'interaction entre Otx2 et les GAGs, à la fois pour la mise en place des périodes critiques pendant le développement postnatal et pour le maintien de l'état non plastique du cortex chez l'adulte. / During postnatal development of the visual cerebral cortex, Otx2 homeoprotein is transferred preferentially into parvalbumin inhibitory interneurons (PV-cells), induces their maturation and regulates a critical period of plasticity for binocular vision. During the critical period, PV-cells are gradually enwrapped by perineuronal nets enriched in glycosaminoglycans (GAGs), which are likely involved in the capture of Otx2. To understand how Otx2 interacts with GAGs at the surface of PV-cells for critical period regulation, we have analyzed a transgenic Otx2-AA mouse line in which the interaction between Otx2 and GAGs is disrupted. These mice show a reduced specificity of cortical Otx2 for PV-cells with concomitant delayed onset and closure of critical period for ocular dominance. We have also identified that Otx2 protein binds chondroitin sulfate chains of the perineuronal nets and that it has a high affinity for the chondroitin sulfate CS-E. We have therefore developed a sugar-ase protection assay for identifying specific glycan sequences involved in homeoprotein recognition. Throughout adulthood, the cortex receives Otx2 to maintain a consolidated, non-plastic state. To interfere with Otx2 transfer in the adult and reopen a window of plasticity, we have developed two models: a synthetic hexasaccharide analogue of CS-E that binds to Otx2 and an inducible, knock-in mouse allowing spatio-temporal control of a secreted single chain antibody against Otx2. All these results confirm and clarify the in vivo role for Otx2-GAG interaction, both in the timing of critical periods during postnatal development and in the maintenance of the non-plastic state of the cortex in the adult.

Les leucémies myéloïdes aigües résultent d’un dérèglement du processus de l’hématopoïèse et regroupent des maladies hétérogènes qui présentent des profils cliniques et génétiques variés. La compréhension des processus cellulaires responsables de l’initiation et du maintien de ces cancers permettrait de développer des outils thérapeutiques efficaces et ciblés. Au cours des dernières années, une quantité croissante d’anomalies génétiques reliées au développement de leucémies ont été corrélées à une expression anormale des gènes HOX et de leurs cofacteurs MEIS et PBX. Des modèles expérimentaux murins ont confirmé le rôle direct joué par ces protéines dans le développement de leucémies. En effet, la protéine MEIS1 collabore avec HOXA9 dans la leucémogenèse et requiert pour ce faire trois domaines distincts. Deux de ces domaines sont conservés chez PREP1, un membre de la même classe d’homéoprotéine que MEIS1. En utilisant une approche de gain-de-fonction, j’ai confirmé l’importance du rôle joué par le domaine C-terminal de MEIS1 dans l’accélération des leucémies induites par HOXA9. J’ai également montré que l’activité de ce domaine était corrélée avec une signature transcriptionnelle associée à la prolifération cellulaire. J’ai ensuite réalisé un criblage à haut débit afin d’identifier des antagonistes de l’interaction MEIS-PBX, également essentielle à l’accélération des leucémies HOX. À cette fin, j’ai développé un essai de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permettant de détecter la dimérisation MEIS-PBX dans les cellules vivantes. Plus de 115 000 composés chimiques ont été testés et suite à une confirmation par un essai orthogonal, une vingtaine de molécules ont été identifiées comme inhibiteurs potentiels. Ces composés pourront être rapidement testés sur la prolifération de cellules leucémiques primaires dans un contexte d’étude préclinique. Finalement, deux approches protéomiques complémentaires ont permis d’identifier des partenaires potentiels de MEIS1 et PREP1. La catégorisation fonctionnelle de ces candidats suggère un nouveau rôle pour ces homéoprotéines dans l’épissage de l’ARN et dans la reconnaissance de l’ADN méthylé. / Acute myeloid leukemias are the result of a perturbed hematopoietic process and regroup heterogeneous diseases with distinct clinical and genetic profiles. Identifying and understanding the faulty cellular processes would allow the development of targeted and efficient therapeutic tools. Over the last 15 years, a growing number of disease-linked genetic anomalies have been correlated with abnormal expression levels of HOX genes and their cofactors MEIS and PBX. Mouse model experimentations revealed a direct role for these proteins in leukemogenesis. Indeed, the protein MEIS1 collaborates with HOXA9 in the acceleration of leukemia development. This specific function requires the presence of three different domains, two of which are highly conserved in PREP1, another member of the MEIS class of homeoproteins. Using a gain-of-function approach, I confirmed the importance of the C-terminal domain of MEIS1 in the acceleration of HOXA9-induced leukemias. I also correlated the activity of this domain with a transcriptional signature related to cell proliferation. Furthermore, I performed a high-throughput screen to identify antagonists of the MEIS-PBX interaction, also required for acceleration of HOX-induced leukemogenesis. In this regard I developed an assay that exploits bioluminescence resonance energy transfer (BRET) to monitor the MEIS-PBX dimerization in living cells. More than 115 000 compounds were tested and upon confirmation of their activity using an orthogonal assay, 20 small molecules were identified as potential inhibitors. These compounds will be rapidly tested on proliferation of primary leukemic cells in a preclinical setting. Finally two complementary proteomic approaches allowed the identification of new potential partners of MEIS1 and PREP1. The functional clustering of these candidates suggests a new role for homeoproteins in mRNA splicing and methylated DNA recognition.

Les homéoprotéines sont des facteurs de transcription importants au cours du développement des organismes vivants, capables notamment de voyager de cellule en cellule. Ces protéines comportent une longue extrémité N-terminale désordonnée, suivie de trois hélices α séparées par une boucle et un tour. Des études de relations structure-activité ont montré que des domaines cationiques (riches en K et R) particuliers dans ces protéines sont responsables de ces propriétés de transfert cellulaire leur permettant d’être secrétées et internalisées dans les cellules. Ces processus impliquent que ces protéines hydrophiles soient capables de franchir la membrane plasmique composée d'un coeur hydrophobe. La membrane plasmique est en effet composée d’une bicouche lipidique, dans laquelle sont insérées de nombreuses protéines, telles que les protéoglycanes portant des ramifications de glycosaminoglycanes (GAG), polysaccharides anioniques. Dans le but de comprendre au niveau moléculaire le processus d'entrée des homéoprotéines dans des cellules eucaryotes, différentes constructions protéiques ont été produites et étudiées : le peptide pénétrant les cellules correspondant à l'hélice 3 (H3), la séquence correspondant à l'homéodomaine (HD), l'homéodomaine étendu d'une séquence putative de liaison aux GAG (NLS-HD) et la protéine entière (En2). La quantification absolue de l’entrée de ces constructions dans des cellules CHO-K1 par spectrométrie de masse a mis en évidence une efficacité d'entrée meilleure pour H3 > NLS-HD > HD, ainsi que l’importance des GAG de surface dans le processus et plus particulièrement celui des héparanes sulfates (HS). Des expériences complémentaires d’ITC, de dichroïsme circulaire et de RMN ont permis d'identifier deux sites d’interaction avec l’héparine (un site principal de haute affinité et un site secondaire de plus basse affinité), interagissant principalement avec le polysaccharide par interactions électrostatiques. In fine, ces études conduisent à une meilleure compréhension moléculaire du processus d'internalisation des homéoprotéines dans des cellules eucaryotes. / Homeoproteins are important transcription factors during the development of living organisms, and are able to travel from cell to cell. These proteins contain a long N-terminal extremity structurally disordered, followed by three α helices separated by a U-turn. Structure-activity relation studies have shown that in these proteins, some cationic domains (rich in K and R) confer them the cellular transfer properties, allowing them to be secreted by and internalized into cells. These processes imply that the hydrophilic proteins are able to cross plasma membrane. Indeed, the plasma membrane possess a hydrophobic heart and is composed by a lipidic bilayer, in which numerous proteins are inserted, such as proteoglycans carrying glycosaminoglycan (GAG) ramifications, that belong to anionic polysaccharids. In order to understand the entry process of homeoproteins into eukaryotic cells at a molecular level, different proteic constructions have been produced and studied: the cell penetrating peptide corresponding to the third α helix (H3), the sequence corresponding to its homeodomain (HD), the homeodomain with an added putative GAG-binding domain (NLS-HD), and the wild-type protein Engrailed 2 (En2). The absolute mass spectrometry quantification of the peptide and proteins in cells shows a range of internalization efficiency as follows: H3 > NLS - HD > HD. It also highlights the importance of cell-surface GAGs in the internalization and more particularly that of heparan sulfates (HS). Complementary experiments of ITC, circular dichroism and NMR have shown two interaction sites for the heparin (one principal site of high affinity and a secondary site showing a lower affinity) both interacting mainly with polysaccharidic residues using electrostatic interactions. In fine, these studies lead to a better molecular understanding of homeoproteins internalization process in eukaryotic cells.