Se evaluó la capacidad regenerativa de blastómeros de Oncorhynchus mykiss de 60 horas de desarrollo utilizando vitamina A, insulina, suero 2% (v/v) de “Trucha arco iris” en estadíos previos y posteriores al desove y medio Leibovitz L-15. Primero se obtuvo la sangre de trucha anestesiando a los peces en un baño de clorobutanol (600 mg/ml). A partir de ello, la relación encontrada entre el peso del animal, el tiempo de sedación y el tiempo de recuperación fue directa y en promedio la inducción se realizó en un tiempo menor que el reportado para el anestésico. Luego, el suero de trucha obtenido fue tratado con varias temperaturas por separado, obteniéndose la inactivación de las proteínas del complemento sólo con el suero tratado a 30°C. A continuación, las concentraciones más adecuadas de vitamina A e insulina para obtener regeneración de blastómeros fueron 0.6 UI/ml de vitamina A y 0.7 UI/ml de insulina. Utilizando otros tipos de sueros, como los de mujeres grávidas y no grávidas, se estableció que ninguno de ellos son útiles para este tipo de cultivo por tanto la utilidad del suero de “Trucha arco iris” es específica en la concentración probada (2%v/v). Finalmente, cada uno de los elementos componentes del medio regeneratriz – vitamina A, insulina, suero de trucha, medio Leibovitz L-15- desempeñan diferentes roles en el proceso. En ausencia de vitamina A e insulina de manera simultánea, de vitamina A, de suero, y en presencia sólo de medio Leibovitz la capacidad regenerativa de los embriones fue casi nula a diferencia de los cultivos sin insulina. La vitamina A fue de mayor importancia debido a su rol morfógeno y la insulina jugó un papel permisivo en el proceso regenerativo. Los resultados de la ausencia del suero demostraron que este elemento es clave para mantener la adherencia entre los blastómeros del embrión de trucha mientras que el medio Leibovitz no tuvo ninguna participación en el proceso regenerativo. Se establecieron las necesidades del proceso de regeneración de blastómeros de “Trucha arco iris”, basado en la importancia de cada uno de los factores que contribuyeron en el proceso regenerativo, con concentraciones adecuadas de vitamina A e insulina necesarias para desencadenar dicho fenómeno. Su aplicación futura es de suma relevancia tanto en acuicultura, medicina veterinaria y medicina humana. / The regenerative capacity of the 60 hours development Oncorhynchus mykiss blastomeres was evaluated utilizing vitamin A, insulin, pre or post-spawning rainbow trout serum 2%(v/v) and medium Leibovitz L-15. First, trout blood was obtained when the fishes were anesthetized with a bath of clorobutanol at 600 mg/ml. The relationship among animal weight, sedation time and recovery time was proportionally direct and the induction is realized in a less time than the reported for the anesthetic. Then, the trout serum obtained was treated with several temperatures, the proteins complement inactivation was optimal on treated serum at 30°C. Next, the more adequate concentrations of vitamin A and insulin for blastomeres regeneration were 0.6 IU/ml vitamin A and 0.7 IU/ml insulin. Using another kind of sera such as from pregnant and non-pregnant women, it is found out that no one was useful for the culture, so the usefulness of rainbow trout serum is specific in the proven concentration (2% v/v). Finally, each regenerating medium components – vitamin A, insulin, trout serum, medium Leibovitz– have different roles into the process. Without vitamin A and insulin of simultaneous manner, without vitamin A, serum and only utilizing medium Leibovitz the embryos regenerative capacity was almost null. The vitamin A was the more important factor to its morphogenic role and the insulin played a permissive paper in the regenerative process. The results from free-serum culture showed that element is key to maintain the adherence between blastomeres of trout embryo while medium Leibovitz had no participation into regenerative process. It is established the necessities for regeneration process in rainbow trout blastomeres, based on the importance of each factors that contributed for regeneration with adequate concentrations of vitamin A and insulin to trigger this phenomenon. Its application is relevant in aquaculture, veterinary and human medicine.

In marine teleosts that spawn pelagic eggs (pelagophils), the process of oocyte hydration that occurs during meiosis resumption is a key physiological process for the survival of the eggs in the ocean. Previous studies have discovered the role of a teleost-specific aquaporin water channel (Aqp1b) during fish oocyte hydration, but direct experimental evidence for the function of Aqp1b in oocytes is still lacking. In addition, the molecular regulation of the Aqp1b-mediated mechanism remains poorly understood. In this context, the main objectives of the present thesis were to investigate the evolutionary origin of aqp1ab in teleosts, to provide functional evidence of the role of Aqp1b during oocyte hydration, and to begin to dissect the molecular mechanisms involved in the transcriptional regulation of aqp1b in the oocyte of marine teleosts. By integrating the molecular phylogeny with synteny and structural analyses we show that the teleost aqp1aa and -1ab paralogs (previously annotated as aqp1a and -1b, respectively) arose by tandem duplication, and that the Aqp1ab C-terminus is the most rapidly evolving subdomain within the vertebrate aquaporin superfamily. The functional role of Aqp1ab was investigated in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus), a marine acanthomorph teleost that spawns one of the largest pelagic eggs known. Using immunological inhibition of Aqp1ab in halibut oocytes and artificial expression of the halibut paralog Aqp1aa, we demonstrate that Aqp1ab is required for full hydration of oocytes undergoing meiotic maturation. To investigate the aqp1ab transcriptional regulation in oocytes, we isolated the 5’-flanking region of the gilthead seabream (Sparus aurata) aqp1ab gene which contains regulatory cis-elements for the nuclear progestin receptor (Pgr) and SOX transcription factors. The Pgr, as well as sox3 and -8b transcripts, are co-expressed in seabream oo-gonia, whereas in primary growth oocytes, when aqp1ab mRNA and protein are synthesized, the Pgr is translocated into the nucleus. In contrast, sox9b is highly expressed in more advanced oocytes showing the depletion of aqp1ab transcripts. In the seabream, four different pgr transcript variants are expressed in primary growth ovaries which are generated by alternative pre-mRNA splicing. Seabream wild-type Pgr shows the highest transactivation response to progestins such as 17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20β-P) and 17α,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20β,21-P), whereas two of the N-terminally truncated Pgr isoforms regulate novel nuclear and cytosolic mechanisms of dominant-negative repression of Pgr-mediated transcription. Transactivation assays on the aqp1ab promoter demonstrated that aqp1ab transcription is dependent on wild-type Pgr, with Sox3 and -8b acting synergistically, while Sox9b acts as a repressor. Incubation of primary ovarian explants in vitro with 17,20β-P, followed by chromatin immunoprecipitation, confirmed that 17,20β-P-activated Pgr enhanced aqp1ab promoter activation. The production of 17,20β-P in seabream primary growth ovaries in vivo was consistent with the expression of P450c17-II (Cyp17a2) and 20β-hydroxysteroid dehydrogenase (Cbr1), enzymes needed for progestins synthesis, in granulosa cells associated with primary growth oocytes, and with a high concentration of 17,20β-P. Incubation of primary ovarian explants with recombinant piscine follicle-stimulating hormone (rFsh) in vitro stimulated 17,20β-P synthesis, which was reduced in the presence of Cbr1 inhibitors. The rFsh-mediated production of 17,20β-P correlated with the up-regulation of cyp17a2 and cbr1 transcription, as well as of wild-type pgr mRNA and protein levels. Altogether, these data suggest that aqp1ab transcription in seabream primary growth oocytes is under Fsh regulation through the synthesis of progestins. The results of this thesis show that the Aqp1ab mediated mechanism for oocyte hy-dration is likely conserved in marine teleosts. In addition, the tight transcriptional reg-ulation of Aqp1ab during oogenesis highlights the essential physiological role of this water channel and opens new research avenues for understanding the molecular basis of egg formation in marine fish. / La hidratación de los oocitos de teleósteos marinos que producen huevos pelágicos es clave para la supervivencia de los embriones en el océano. Estudios previos han descu-bierto el papel de una acuaporina específica de teleósteos (Aqp1b) durante este proceso, pero se carece todavía de evidencias experimentales directas, así como información sobre la regulación molecular de la Aqp1ab. En la presente tesis, estudios iniciales con el fletan Atlántico (Hippoglossus hippoglossus) confirman que los parálogos aqp1aa y -1ab de teleósteos han surgido probablemente por duplicación génica en tándem, y han demostrado el papel esencial de la Aqp1ab durante la hidratación del oocito. Para investigar el control transcripcional del gen aqp1ab en los oocitos de la dorada (Sparus aurata) se ha aislado su región promotora, la cual contiene elementos cis-reguladores de unión al receptor nuclear de progestinas (Pgr), como la 17α,20β-dihidroxi-4-pregnen-3-ona (17,20β-P), y factores de transcripción Sox. Estudios de localización subcelular indican que el Pgr aparece en el citoplasma de las oogonias, así como en el núcleo de oocitos en crecimiento primario (pre-vitelogénicos) coincidiendo con la activación de la expresión de aqp1ab. En este estadio también se expresan cuatro isoformas diferentes del Pgr, dos de las cuales pueden inhibir la transcripción mediada por el Pgr de forma dominante negativa. Las oogonias también expresan sox3 y -8b, mientras que el sox9b aparece en el estadio de alveolo cortical, cuando se reduce la expresión de aqp1ab. Ex-perimentos de transactivación indican que el Pgr activa la transcripción de aqp1ab, con Sox3 y -8b actuando de forma sinérgica, mientras que el Sox9b reprime este mecanismo. El papel del Pgr se ha investigado sobre explantes ováricos pre-vitelogénicos incubados in vitro, lo cual ha demostrado que la 17,20β-P, producida en las células de la granulosa en respuesta a la hormona folículo estimulante, activa el promotor de aqp1ab en el oocito induciendo la síntesis de Aqp1ab. Los resultados de esta tesis revelan por primera vez una estricta regulación transcripcional del gen aqp1ab durante la oogénesis de teleósteos marinos, lo cual remarca la función fisiológica esencial de este canal de agua durante la formación de los huevos pelágicos.